人ad7c-ntp抗原決定簇多肽、抗體及其在診斷試劑盒上的應用的製作方法

2023-04-30 21:41:01

專利名稱：人ad7c-ntp抗原決定簇多肽、抗體及其在診斷試劑盒上的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及人AD7C-NTP抗原決定簇多肽、相應的抗體及其在制 備人AD7C-NTP體外診斷試劑盒上的應用。
技術背景在人口老齡化日益加劇的今天，以神經退行性變為主要特徵的老 年病的發病率呈現逐年上升趨勢。在我國老齡化問題尤為嚴峻，2006 年2月23日，全國老齡辦在發布的《中國人口老齡化發展趨勢預測 研究報告》中指出，中國已於1999年進入老齡社會。許多發達國家 65歲以上人口比重由5%上升到7%—般要經歷50-80年，而我國從 1982年的4. 9%上升到2000年的7. 2%只用了 18年，說明我國人口 老齡化速度遠超過發達國家。第五次全國人口普查結果表明，目前我 國65歲以上人口為8811萬人，佔全國總人口的6.96%; 60歲以上人 口已經達到1.43億，佔總人口的10.97%;在2010年後我國50、 60 年代高生育期出生的人將陸續進入老年，屆時人口老齡化的發展更為 迅速，預計2015年老年人口將達到2.02億，2027年將超過3億， 從2040年起，中國60歲以上的人口將達到3.97億，還將有1億80 歲以上的老人，比目前全球80歲以上的老人總數還多。2044年前後 可能突破4億，老年人的數量居世界之首。人口老齡化是我國乃至世界各國在二十一世紀將面臨最大的挑戰。神經退行性疾病是由於神經元進行性變性、死亡導致的、以中樞 神經系統損害為主的神經系統疾病，嚴重危害人類身體健康，但其病 因不清，發病機理複雜，缺乏有效的治療措施。引起神經退行性變的 原因很多，如遺傳性疾病、代謝性疾病、血管性疾病及某些原因不明 的疾病，其致命危害就是造成神經元的不可逆損傷。除人們熟知的老年性痴呆(Alzheimer' s disease,以下簡稱AD)、帕金森氏病 (Parkinson' s disease,簡稱PD)等，在人群中發病率日趨增高、 且發病年齡日趨下降的糖尿病晚期併發症，如腎臟微血管病變、視網 膜病變，均以神經退行性變為首發因素。由於神經退行性變病的發病 機理不清，缺乏有效的早期診斷措施，給治療、護理帶來了一系列實 實在在的問題，同時給社會和家庭造成了沉重的經濟負擔和精神壓 力。我國65歲以上老人中痴呆患病率為4%-7%，其中2/3為阿爾茨 海默病(Alzheimer' s Disease, AD,即老年性痴呆，又稱早老性痴 呆Alzheimer's dementia),目前約有500萬左右的患者，預計到2050 年我國老年痴呆患者將達到2000萬人。如果政府和家庭對每一位AD 病人花費的醫療費、護理費和家庭成員的誤工費等平均每年1萬元， 那麼到2050年我國對老年痴呆患者每年將付出2000億元的費用。如 此之重的經濟負擔將嚴重阻礙我國的經濟發展，並可能引發社會問 題。故研究神經退行性變發病機理和延緩、阻斷其發展的幹預手段， 有著至關重要的意義。作為引起老年痴呆最常見的病因，阿爾茨海默病臨床上表現為智力水平的慢性削弱及記憶的慢性丟失。隨著全球人口的老齡化，AD 發病率也與日俱增，因此，AD的及時診斷與治療必將越來越受到重視。但是，迄今為止，AD的早期診斷十分困難，原因如下l.需做 腦脊液檢査，取材不便；2.雖然腦脊液中磷酸化的Tau蛋白和其它骨 架蛋白增加，但並無特異性，在其它神經系統疾病中也有變化；而 Ae42在AD早期無變化，隨病情加重而減少，不便於測定；3.其它 各種蛋白質包括酶的測定對診斷無指導意義。故有關AD早期診斷方 面雖有百餘篇報導，但只限於描述性研究，由於缺乏有效的生化指標， 並無實用價值。1992年，麻省總醫院的Suzanne de la Monte和Jack Wands博 士首先在AD腦中發現大量的神經絲蛋白(neural thread protein, NTP)與神經元纖維纏結(neuronal fibril tangle, NFT)有關，表明 其在AD的病理改變過程中可能發揮一定作用；1996年，同一研究小 組成功克隆出一種41KDa的、與AD相關的NTP，命名為AD7C-NTP。AD7C-NTP由375個胺基酸組成，分子量41, 718Da，等電點9. 89, 富含絲氨酸(ll. 7%)和脯氨酸(8. 8%)，包括15個胺基酸的信號肽和7 個可能的跨膜區。AD7C-NTP存在於神經細胞發出的軸突中；並且大 量存在於AD患者腦中的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFT)中。AD7C-NTP參與腦神經元的修補與再生，AD患者腦中AD7C-NTP 基因表達水平異常增高。AD7C-NTP現已被確定為診斷AD的生化指標， 在AD患者的腦組織和腦脊液中都選擇性升高。最新的研究發現，AD患者尿樣或血清中AD7C-NTP水平的檢測與CSF(腦脊液)中AD7C-NTP 的檢測具有同樣的意義。這一無創性的檢查更易被病人接受，也易於 在臨床上推廣。因此，監測腦脊液和尿液、血清中AD7C-NTP水平可作為早期AD 的初篩試驗，協助AD或有記憶障礙症狀及體徵患者的早期臨床診斷。而監測AD7C-NTP最理想的方法即是免疫測定，但前提是必須制 備針對AD7C-NTP的特異性抗體，因此尋找合適的具有免疫原性的 AD7C-NTP多肽片段，就成了研究的重點。發明內容本發明的第一個目的在於針對AD診斷和治療的現狀，提供具有 免疫原性的AD7C-NTP多肽片段，即提供人AD7C-NTP抗原決定簇多肽。本發明的第二個目的在於利用本發明的人AD7C-NTP抗原決定簇 多肽製備抗體，提供能與人AD7C-NTP抗原決定簇多肽特異性結合的 抗體。本發明的第三個目的在於將本發明的人AD7C-NTP抗體應用於制 備人AD7C-NTP體外診斷試劑盒。本發明的人AD7C-NTP抗原決定簇多肽，為如下多肽片段之一(1) Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala—Ser-Ala-Ser-Pro， 即序列表中SEQ ID NO. 1所述的胺基酸序列；(2) Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn， 即序列表中SEQ ID NO. 2所述的胺基酸序列；本發明的多肽片段(1)是人AD7C-NTP蛋白N端的一段13個胺基酸的殘基，在該肽段的N端、C端分別加上Tyr則組成多肽片段(3)、 多肽片段(4)，如下(3) Tyr-Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro，即序列表中SEQ ID NO. 3所述的胺基酸序列；(4) Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Tyr，即序列表中SEQ ID NO. 4所述的胺基酸序列。多肽片段(1)在N端或C端加Tyr是為了通過BDB (雙偶氮聯 苯胺二氯化物Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交聯到血蘭 蛋白(KLH)上作為抗原製備抗體，Tyr加在N端產生抗多肽C端抗 體，Tyr加在C端，產生抗多肽N端抗體。本發明的多肽片段(2)是人AD7C-NTP蛋白C端的一段8個氨基 酸殘基，在該肽段的N端、C端分別加上Tyr則組成多肽片段(5)、 多肽片段(6),如下(5) Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn， 即序列表中SEQ ID NO. 5所述的胺基酸序列；(6) Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Tyr, 即序列表中SEQ ID NO. 6所述的胺基酸序列。多肽片段(2)在N端或C端加Tyr是為了通過BDB (Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交聯到血蘭蛋白(KLH) 上作為抗原製備抗體，Tyr加在N端產生抗多肽C端抗體，Tyr加在 C端，產生抗多肽N端抗體。上述兩種AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段--一多肽片段(1)和多肽片段(2)是按以下原則篩選出來的1、 親水；2、 抗原性強；3、 易於合成。迄今為止經研究我們發現上述兩種多肽片段具有如下功能1、 具有免疫原性2、 與載體蛋白連接後作為抗原可刺激動物產生特異性的抗體。3、 用這兩種多肽片段製備的抗體可特異性的與人AD7C-NTP結合o本發明的上述AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段的製備方法可用化 學合成法利用美國ABI431A型多肽自動合成儀，通過固相法合成抗 原決定簇多肽。多肽的純度用薄層色譜和高效液相色譜進行評定，並 測定抗原多肽的濃度。將本發明的任意一種AD7C-NTP抗原決定簇多肽與載體蛋白連接 後作為抗原免疫動物即可製備本發明的特異性的多克隆抗體或單克 隆抗體。製備方法採用現有成熟技術，參見實施例二。如前所述依次製得AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段和其特異性抗 體後，即可將該抗體用於製備人AD7C-NTP體外診斷試劑盒。將採用本發明的抗體製備的人AD7C-NTP體外診斷試劑盒進行臨 床研究，在223例AD病人中，206例尿AD7C-NTP超過2.5ng/ml，而 非AD對照平均值為0. 8ng/ml， 二者比較p〈0. 001。若以1. 5ng/ml為 劃定標準，尿AD7C-NTP診斷早期AD的特異性為91%,靈敏度為 85%-92%，說明AD7C-NTP作為一種診斷AD的生化標記物是切實可行 性的，同時說明本發明的多肽片段抗原性強，製備的抗體特異性強。
具體實施例方式
實施例一兩種AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段的製備。實施例採用的兩種AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段為本發明的多 肽片段(3)和多肽片段(5)，即:Tyr-Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro， Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn。 製備方法採用化學合成法利用美國ABI431A型多肽自動合成 儀，通過固相法合成抗原決定簇多肽。多肽的純度用薄層色譜和高效 液相色譜進行評定，並測定抗原多肽的濃度。該兩種多肽片段採用固相法合成。固相肽合成的主要思想是先 將所要合成肽鏈的羧基末端胺基酸的羧基以共價鍵形式同一個不溶 性的高分子化合物(樹脂)相連接，然後以此結合在固相載體上的氨基 酸作為氨基組份，經過脫去氨基保護基並同過量的活化羧基組份反 應，接長肽鏈。這樣的步驟可以反覆地多次進行下去，最後達到所需 要合成的肽鏈的長度。下圖表示了這個合成過程。formula see original document page 10上述兩種AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段的製備如下 1.所用原料HMP resin(P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂) Fmoc-AA (9-芴基甲氧羰醯基保護的胺基酸)麗P (氮甲基吡咯烷酮) DCM (二氯甲烷) MeoH (甲醇) Piperidine (哌啶) DMAP (二甲基氨基吡啶)H0BT (羥基苯並三唑)DCC (二環己基碳二亞胺)TFA (三氟乙酸)EDT (1， 2-乙二硫醇)硫代苯甲醚結晶苯酚乙腈2. 使用儀器 多肽自動合成儀 旋轉蒸發儀 高效液相色譜儀 冷凍乾燥機3. 合成方法和過程稱取HMP樹脂100mg，取代當量是l.Omeq，即0. l醒ol於美國 ABI431A型多肽自動合成儀的反應腔內，由合成儀自動將特定的M 按不同的順序聯接起來，偶聯率達99%。反應如下(1)胺基酸的活化(H0Bt/DCC法)formula see original document page 11
Fmoc保護的胺基酸
formula see original document page 11(2)聯接胺基酸到樹脂上
formula see original document page 12
(3)脫去胺基酸的Fm0C保護基
0formula see original document page 12
(4)胺基酸的活化(HOBt/DCC法) HOBtfDCCformula see original document page 12
(5)偶聯formula see original document page 12新的偶聯的肽一樹脂(6) 重複3-5直至合成結束，得到AD7C-NTP多肽的肽樹脂260mg。(7) 裂解肽樹脂用TFA(三氟乙酸)切割肽鏈，用EDT，硫代苯甲醚，H20作清除劑， 在室溫下反應3. 0小時，除去切割試劑，再用乙醚萃取，得到AD7C-NTP 多肽的粗品。多肽的純化採用高效液相色譜分離純化條件色譜柱 C8 lOXlOOmm色譜儀 Waters 600美國Waters公司 流動相 A-O. 1%TFA (三氟乙酸)H20B -O. 1% TFA (三氟乙酸)於60%乙腈 檢測波長214nm 流速 4ml/分鐘 洗脫梯度20-60%B於30分鐘 HPLC (高效液相色譜)分析色譜柱 C184.6X150mm流動相A-0. 1%TFA (三氟乙酸)H20B-0.1%TFA (三氟乙酸)於乙腈 檢測波長214nm 流速 lML/min 洗脫梯度0-60% B於30分鐘 兩種多肽片段分析結果顯示純度95%以上。 實施例二將實施例一所得的AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段與載體 蛋白連接後作為抗原免疫動物製備特異性的多克隆抗體。(一)AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段(3)多克隆抗體製備1. 抗原的製備用碳二亞胺法將AD7C-NTP多肽片段(3)與載 體蛋白血蘭蛋白(KLH)聯接製備成抗原。2. 動物製備抗血清取抗原與lml弗氏完全佐劑(基礎免疫)或 弗氏不完全佐劑(加強免疫)充分乳化後免疫Balb/c小鼠，腹腔注 射，每次劑量為50-200 ug/ml，分20點皮內注射，共免疫7-8次， 末次免疫後的第十天取耳血測定抗體效價。3. 測定抗體效價用ELISA法測定抗體效價，結果顯示抗體效價 達到1: 32000以上。4. 接種H22肝癌細胞於腹腔內。5. 取腹水及分離上清。6. 分離純化抗體硫酸銨沉澱後，再經Protein G親和純化。7. 抗體分裝後凍幹，低溫保存。(二) AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段(5)多克隆抗體製備1. 抗原的製備用碳二亞胺法將AD7C-NTP多肽片段(5)與載體 蛋白KLH聯接製備成抗原。2. 免疫動物製備抗血清取抗原與lml弗氏完全佐劑(基礎免疫) 或弗氏完不全佐劑(加強免疫)充分乳化後免疫紐西蘭大白兔背部， 每次劑量為50-200 ug/ml，分20點皮內注射，共免疫7-8次，末次免疫後的第十天取耳血測定抗體效價。3. 測定抗體效價用ELISA法測定抗體效價，結果顯示抗體效價 達到1: 32000以上。4. 取血及分離血清頸動脈插管取血，分離血清。5. 分離純化抗體硫酸銨沉澱後，再經Protein G親和純化。6. 抗體分裝後凍幹，低溫保存。實施例三AD7C-NTP ELISA試劑盒的製備。將上述製備的AD7C-NTP多抗用於製備尿中AD7C-NTP診斷試劑 盒，本實施例將兩種AD7C-NTP多抗中的多肽片段(3)多克隆抗體作 為試劑盒中的包被抗體，多肽片段(5)多克隆抗體則作為結合抗體。AD7C-NTP ELISA試劑盒的製備和操作如下1.各種緩衝液及試劑的配製A、 包被緩衝液0.050M， pH9.6的CB (碳酸鹽緩衝液)Na2C03 (匿 105.99) 16. 0克NaHC03 (MW 84.01 ) 29.0克蒸餾水溶至1000ml 。B、 樣品/洗滌緩衝液pH7. 2的PBS—Tween 20Na2HP04. 12H20 58克KH2P04 4克NaCl 100克KC1 4克 蒸餾水溶至1000 ml 力H Tween 20 20 ml 。C、 酶標記物稀釋液10 X PBS 10 mlFCS (小牛血清) 20 ml 蒸餾水溶至1000 ml穩定劑 1克防腐劑 1 ml 。 D、顯色劑A:檸檬酸 35. 5克過氧化脲 10克蒸餾水溶至1000 ml Tween 20 10ml。E、 顯色劑B:梓檬酸 120克EDTA—2Na 1克 TMB. 2HC1 2克蒸餾水溶至1000 ml。F、 終止液2M H2S04濃硫酸(95—98%) 22.2 ml蒸餾水 177. 3 ml配時將濃硫酸緩慢滴入蒸餾水中，邊加邊搖勻。2. 預包被板的製備將AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段(3)多克隆抗體溶於P^9.6， 0.05M的碳酸鹽緩衝液中，多抗濃度為10ug/ml，製成預包被液，在 酶標板上每孔加入100"1，置4-C放置18-24小時，取出，甩掉包被 液，洗滌，經封閉、乾燥後裝入鋁鉑袋中抽真空密封，並置於4"C保 存。3. 結合抗體(即AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段(5)多克隆抗體)和酶標二抗濃度確定結合抗體和酶標二抗濃度用方陣滴定實驗確定。4. 試劑盒的組成(1) 預包被板 48/96孔(2) 人AD7C-NTP標準品1—6個 6 X 50 u 1(3) 結合抗體 lX10ml(4) 酶標二抗(HRP-IgG) 1X10ml(5) 濃縮洗滌液(25X)(6) 樣品稀釋液1X20ml1X20ml(7) 顯色劑A(8) 顯色劑B(9) 終止液1X6. OmlIX 6.0mlIX 6. Oml5. 試劑盒的操作步驟在預包被板的各孔中加入按待檢的尿液標本以及標準品100 u 1/ 孔，均為雙孔，同時設空白孔，37'C孵育60分鐘，洗滌5次，拍幹。 在各孔內加入結合抗體(即AD7C-NTP抗原決定簇多肽片段(5)多克 隆抗體)100ul/孔，37-C孵育30分鐘，洗滌5次，拍幹。再在各孔 內加入標記有辣根過氧化酶的抗人IgG抗體100p1/孔，37'C孵育30 分鐘，洗滌5次，拍幹。加入顯色劑A、 B液每孔各50y 1，混勻， 37。C孵育15分鐘。加終止液50ul/孔終止反應，用酶聯檢測儀測定 各孔的450nm處的吸光度。6. 結果判定OD比值計算待測標本孔的OD值-空白孔的OD值通過標準曲線計算結果。尿中AD7C-NTP的濃度《1. 5ng/ml，為陰性。尿中AD7C-NTP的濃度〉1.5ng/ml，為陽性。將上述試劑盒應用於79例AD病人，其中66例尿AD7C-NTP超過 2.5ng/ml，而非AD對照平均值為0. 8ng/ml， 二者比較p〈0.001。以 1. 5ng/ml為劃定標準，尿AD7C-NTP診斷早期AD的特異性為91%, 靈敏度為80%-85% 。序列表〈110〉首都醫科大學宣武醫院深圳市安群生物工程有限公司<120〉人AD7C-NTP抗原決定簇多肽、抗體及其在診斷試劑盒上的應用〈160〉 6 Patentln version. 3.1〈210〉 1〈211> 13 PRT〈213> Homo sapiens 1Asn Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro 1 5 10<210〉 2 8<212〉 PRT<213〉 Homo sapiens〈400〉 2Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn 1 5<210〉 3〈211〉 14 PRT〈213〉 Homo sapiens Homo sapiens〈400> 4Asn Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr 1 5 10〈210〉 5 <211〉 9 〈212〉 PRT〈213〉 Homo sapiens 5Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn 1 5 Homo sapiens〈400〉 6Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Tyr 1 權利要求
1.一種人AD7C-NTP抗原決定簇多肽，為如下兩種多肽片段之一(1)Asn-Pro-Gly-Ser-Ser-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro；(2)Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn。
2. 如權利要求1所述的人AD7C-NTP抗原決定簇多肽，其特徵 在於在所述多肽片段(l)、多肽片段(2)的N端或C端加有Tyr。
3. —種人AD7C-NTP抗體，由權利要求1或2所述的任意一種多肽片段製備而成的多克隆抗體或單克隆抗體。
4. 如權利要求3所述的人AD7C-NTP抗體在製備人AD7C-NTP體外診斷試劑盒上的應用。
5. 如權利要求4所述的人AD7C-NTP抗體在製備人AD7C-NTP體 外診斷試劑盒上的應用，其特徵在於所述試劑盒採用權利要求3所 述的任意一種人AD7C-NTP抗體作為包被抗體。
6. 如權利要求5所述的人AD7C-NTP抗體在製備人AD7C-NTP體 外診斷試劑盒上的應用，其特徵在於所述製劑盒還包括結合抗體， 結合抗體為權利要求3所述的另一種人AD7C-NTP抗體，與包被抗體 的多肽來源不同。
7. 根據權利要求6所述的人AD7C-NTP抗體在製備人AD7C-NTP 體外診斷試劑盒上的應用，其特徵在於所述試劑盒還包括酶標記的 二抗。
全文摘要
本發明為一種人AD7C-NTP抗原決定簇多肽、抗體及其在診斷試劑盒上的應用。本發明的AD7C-NTP抗原決定簇多肽，為序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所述的多肽片段之一。本發明的AD7C-NTP抗體，是由本發明的任一種AD7C-NTP抗原決定簇多肽製備而成。本發明的AD7C-NTP抗體可應用於製備AD7C-NTP體外診斷試劑盒。
文檔編號C07K7/06GK101215323SQ20071012558
公開日2008年7月9日 申請日期2007年12月28日 優先權日2007年12月28日
發明者姬志娟, 朱建安, 蓉 王, 盛樹力 申請人:首都醫科大學宣武醫院;深圳市安群生物工程有限公司