提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼含量的方法

2023-05-01 07:11:16

專利名稱：提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼含量的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的方法，特別是一種雙關鍵酶基因共轉化代謝工程策略提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼(TIAs)含量的方法。
背景技術：
長春花(Catharanthus roseus)是夾竹桃科(Apocynaceae)長春花屬植物，目前人們從長春花全草中分離了100多種萜類吲哚生物鹼(Terpenoid indolealkaloids，TIAs)，如長春鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)、阿嗎鹼(Ajmalicine)、蛇根鹼(Serpentine)、文多靈鹼(Vindoline)、長春質鹼(Catharanthine)、洛克定鹼(Lochneridine)、派文利鹼(Perivine)等。大多數TIAs由於具有生物學活性而被廣泛應用於現代醫藥中，如著名的抗腫瘤藥物長春鹼和長春新鹼可用於治療何杰金氏病、惡性淋巴腫瘤、急性淋巴細胞型白血病、絨毛上皮細胞癌及其它癌症，其硫酸鹽已廣泛用於臨床，是目前應用最廣的天然植物抗腫瘤藥物。長春花中其它TIAs，如阿嗎鹼和蛇根鹼是高效降壓藥，文多靈、長春質鹼和環氧長春鹼(Leurosine)具降血糖作用，可治療糖尿病，文多靈和長春質鹼是降血脂藥。長春鹼和長春新鹼是目前長春花中藥用價值最大、應用最廣泛的抗癌TIAs。它們主要是從天然長春花植株中提取，但天然植物體內含量極其微少，使得長春花材料來源困難。長春花中長春鹼和長春新鹼的含量還受到植株發育階段、細胞分區、組織分化和環境的影響，僅從天然植物中提取TIAs遠遠不能滿足市場需求。長春鹼和長春新鹼由於結構複雜，化學合成和半合成成本太高，不具商業前景。毛狀根和細胞培養系統為生產這些有價值的生物鹼帶來了希望。儘管通過毛狀根和細胞培養系統能產生單萜類吲哚生物鹼阿嗎鹼，但其含量太低不具商業前景，且細胞培養系統不能產生最具應用價值的雙萜類吲哚生物鹼長春鹼和長春新鹼。因此，提高植物生物鹼含量和改變生物鹼組成成份是非常必要的。代謝工程為改變植物細胞或毛狀根的組成成份和增加植物細胞或毛狀根生物鹼產量提供了一條誘人的方法。為了更有效地生產長春花生物鹼，開展TIAs生物合成途徑及其催化酶乃至基因的表達與調控研究，以及開展TIAs代謝工程研究將提高TIAs含量並最終解決抗腫瘤TIAs藥物稀缺的有效方法。
經檢索發現，現有文獻中香葉醇-10-脫氫酶(Geraniol 10-hydroxylase，G10H)和異胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase，STR)是長春花TIAs生物合成途徑中的關鍵酶，是TIAs代謝工程的重要靶點。採用基因工程手段，將所述的兩個關鍵酶基因str和g10h共轉化長春花，將打破TIAs生物合成限速瓶頸，獲得長春花TIAs高產的長春花毛狀根或植株，為規模化生產長春花TIAs提供一條新途徑，但尚未發現與本發明主題所提及的雙關鍵酶基因共轉化策略提高長春花毛狀根TIAs含量的相關報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼含量的方法。本發明涉及的關鍵酶基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、TIAs提取及含量測定、螢光定量PCR分析用於本發明，建立了提高長春花毛狀根TIAs含量的方法，為長春花毛狀根大規模工廠化生產奠定堅實的基礎，促進了我國長春花葯物技術領域的發展。
本發明是通過以下技術方案實現的本發明從長春花中克隆str和g10h基因，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用髮根農桿菌介導，將str和g10h基因同時導入長春花細胞並再生出毛狀根；PCR和螢光定量PCR檢測外源目的基因str和g10h的整合和表達情況，高效液相色譜測定長春花毛狀根中TIAs含量。
本發明包括如下具體步驟(1)採用基因克隆方法獲得長春花關鍵酶基因str和g10h；(2)把str和g10h基因可操作性地連於表達調控序列，形成含str和g10h基因的植物表達載體；(3)將含str和g10h基因的植物表達載體轉化髮根農桿菌，獲得用於轉化長春花的含str和g10h基因植物表達載體的髮根農桿菌菌株；(4)利用所構建的髮根農桿菌菌株轉化長春花細胞，獲得經PCR檢測的轉基因毛狀根；(5)螢光定量PCR測定長春花毛狀根中TIAs生物合成相關基因的表達；
(6)對獲得的轉基因毛狀根中TIAs含量進行高效液相色譜法測定，獲得TIAs含量顯著提高的轉基因長春花毛狀根。
所述的PCR檢測中，分別設計合成rolB、rolC、hpt、str和g10h基因的引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因長春化毛狀根。
所述的高效液相色譜測定阿嗎鹼、長春鹼和長春新鹼含量的方法如下色譜柱C-18反相矽膠柱，流動相乙腈∶磷酸緩衝液，體積比為25∶75，檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量10μL，靈敏度為AUFS＝1.0，理論塔板數按長春鹼、長春新鹼和阿嗎鹼峰計算≥2000。
所述的螢光定量PCR測定長春花毛狀根中TIAs生物合成相關基因的表達的方法為分別設計合成長春花TIAs生物合成途徑中的11個基因和看家基因18SrRNA的引物，進行螢光定量PCR擴增，用相對定量法分析基因相對表達量。
本發明的雙關鍵酶基因共轉化策略提高長春花毛狀根TIAs含量的方法，採用基因工程方法，將雙關鍵酶基因導入長春花毛狀根中，獲得了TIAs高產的長春花毛狀根無性系。TIAs高產長春花毛狀根的獲得，可以顯著增加長春花毛狀根中重要抗癌TIAs的含量，毛狀根中長春鹼、長春新鹼和阿嗎鹼的含量分別是非轉化對照根的234.8倍、3.3倍和40.6倍，對解決抗癌TIAs藥源匱乏、滿足醫藥工業大規模工廠化生產需要具有重要意義。
具體實施例方式
下面結合具體實施例進一步闡述本發明。應理解為這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1長春花str和g10h基因的克隆1.組織分離(Isolation)將長春花種子用75％乙醇浸泡1min，再用2％NaClO浸泡10min，無菌水衝洗3-4次，用無菌吸水紙吸乾表面水分，接種於無激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固體培養基中，25℃、12h/12h光照培養，即可獲得長春花無菌苗，待苗長至5cm左右後，切取葉片和莖段用於RNA提取。
2.RNA的分離(RNA isolation)稱取0.5g所述的長春花無菌試管苗，用液氮速凍後，迅速用研缽研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)的1.5mL Eppendorf管中，充分振蕩後，於室溫下放置5min，加200μL氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3min後，於4℃、12,000g離心15min；將上清液(約600μL)吸入乾淨的1.5mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min後，於4℃、12,000g離心10min；棄上清，加1mL 75％乙醇清洗，振蕩後，於4℃、7,500g離心5min；室溫乾燥15-20min後溶於適量(30-50μL)RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因克隆(Cloning of the genes)3.1.第一鏈cDNA的合成3.2.長春花str和g10h基因編碼區的PCR擴增根據所述str基因的編碼序列(SEQ ID NO.1)和g10h基因的編碼序列(SEQID NO.2)，分別設計擴增出完整編碼框的上下遊引物，並在上遊和下遊引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增後進行測序。DNA序列測定由上海博亞或晶泰生物技術服務有限公司採用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報導的長春花str基因(SEQ ID NO.1)和g10h基因(SEQID NO.1)編碼序列一致。
本實施例採用基因克隆方法從長春花中獲得序列正確的TIAs生物合成關鍵酶基因str和g10h，為通過雙關鍵酶基因轉化策略提高長春花TIAs含量提供了兩個重要關鍵酶基因。
實施例2含str和g10h基因的植物雙元表達載體的構建1.中間載體pCAMBIA1304+的構建選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構建雙元植物表達載體pCAMBIA1304+。具體地，HindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121的GUS表達盒和pCAMBIA1304大片段；連接回收產物，轉化篩選，抽質粒酶切驗證。
2.植物表達載體pCAMBIA1304++str的構建以所述的pCAMBIA1304+為表達載體，用實施例1中str替換其上的gus基因。具體地，BamHI/SacI雙酶切pGEM T-easy+str和pCAMBIA1304+，回收str和pCAMBIA1304+大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。
3.植物表達載體pCAMBIA1304++str+g10h的構建以所述的pCAMBIA1304++str為基礎，用實施例1中的g10h替換pCAMBIA1304++str上的gfp+gus基因。具體地，BglII/BstEII雙酶切pCAMBIA1304++str和pGEM T-easy+g10h，回收pCAMBIA1304++str大片段和g10h基因小片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。結果表明，g10h基因已被成功構建到植物表達載體pCAMBIA1304++str中，從而獲得含str和g10h的植物表達載體pCAMBIA1304++str+g10h。
本實施例將TIAs生物合成途徑關鍵酶基因str和g10h可操作性地連於表達調控序列，形成含str和g10h基因的植物表達載體，該表達載體可用於通過代謝工程策略來提高長春花TIAs含量。
實施例3髮根農桿菌介導str和g10h基因遺傳轉化長春花獲得轉基因毛狀根1.含str和g10h基因雙元植物表達載體髮根農桿菌工程菌的獲得將實施例2中含str和g10h基因的植物雙元表達載體轉入髮根農桿菌(如C58C1)，並進行PCR驗證。結果表明，含str和g10h基因植物雙元表達載體已成功構建到髮根農桿菌菌株。
2.髮根農桿菌介導str和g10h基因轉化長春花2.1.外植體的預培養剪取實施例1中長春花無菌苗葉片(0.5cm×0.5cm)和莖段(0.5cm)外植體，接種到預培養培養基(MS+AS 100μmol/L)上，25℃暗培養2d。
2.2.農桿菌與外植體的共培養將所述的預培養長春花葉片和莖段外植體，放入含活化好的所述髮根農桿菌工程菌的1/2MS懸液中浸泡5min(輕輕搖動使外植體與菌液充分接觸)後，倒出懸液，用無菌吸水紙吸乾表面餘菌，轉到共培養培養基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，暗培養2d。以浸泡在不帶有髮根農桿菌的1/2MS液體培養基中的葉片和莖段外植體為對照。
2.3.毛狀根的誘導和繼代培養將所述的共培養2d的長春花外植體轉入到脫菌固體培養基(1/2MS+Cef250mg/L)上於25℃、16h/8h光照培養20天左右，可從外植體邊緣切口處長出毛狀根。剪取毛狀根(大約2-3cm)，將起源於一個單細胞的每條根作為一個無性系，接種於脫菌培養基(1/2MS+Cef 250mg/L)中暗培養兩周，選擇生長快、分枝好的毛狀根轉入脫菌培養基(1/2MS+Cef 250mg/L)中繼代篩選，每兩周繼代培養一次，經過5-6次繼代後即可完全脫菌。再將生長良好的長春花毛狀根轉入無抗生素的1/2MS培養基上繼續暗培養20d左右，轉基因毛狀根生長迅速、根毛和分枝逐漸增多、向地性喪失並可以在無植物激素的培養基上快速生長，具有典型的毛狀根特徵。
3.轉基因長春花毛狀根的PCR檢測設計Ri質粒T-DNA區rol基因特異性引物，用PCR方法對所述毛狀根進行分子檢測。由於目的基因str和g10h在植物表達載體上與潮黴素抗性基因(hpt)在同一個邊界內，檢測hpt基因以確認轉基因毛狀根。根據目的基因str序列(SEQ IDNO.1)和g10h序列(SEQ ID NO.2)設計引物對目的基因進行檢測。結果表明，利用rolB、rolC和hpt基因的PCR特異引物，能分別擴增出423bp、622bp和812bp的特異DNA片段。而以非轉化長春花普通根基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。用目的基因str和g10h的PCR引物擴增長春花毛狀根DNA，能擴增出與預期結果一致的特異目的片段。這說明誘導毛狀根形成的rolB、rolC基因和T-DNA區的hpt、str和g10h基因已經整合到長春花基因組中。
本實施例將所述的植物表達載體轉化髮根農桿菌，獲得用於轉化長春花的含str和g10h基因植物表達載體的髮根農桿菌菌株，利用所構建的髮根農桿菌菌株轉化長春花細胞，獲得經PCR檢測的轉基因毛狀根。轉基因長春花毛狀根的獲得為篩選獲得TIAs含量高產的毛狀根提供了直接素材。
實施例4螢光定量PCR檢測轉基因長春花毛狀根中TIAs生物合成基因的表達1.引物的設計和合成根據長春花TIAs生物合成代謝途徑基因(orca3、g10h、dxs、ggpps、asα、cpr、str、tdc、sgd、d4h和dat，共11個)和看家基因18S rRNA全序列設計引物。引物擴增基因片段長度在150-400bp之間。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
2.RNA的提取、標準品的製備和標準工作曲線參照實施例1中所述方法，從長春花毛狀根中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因組DNA，用反轉錄酶XL(AMV)進行第一鏈cDNA的合成，再以第一鏈cDNA為模板，分別用11對引物進行PCR擴增獲得相應的11條基因的擴增條帶。
PCR產物電泳回收，用紫外分光光度計測定所有目的基因原液的濃度和純度。標準品用10倍梯度稀釋法得到系列濃度的目的基因標準品。每個標準品用螢光定量PCR方法測定，得到Ct值。以每個標準濃度的對數對它們的Ct值作圖，得到滿意的11個基因標準工作曲線。得到的11個基因相關係數(斜率-3.3左右，相關係數大於0.95)表明初始模板濃度的對數與循環閾值Ct之間存在著極強的線性關係，這為定量的準確性提供了基礎。標準曲線同時顯示，螢光定量PCR(FQ-PCR)反應線性範圍極寬，可達5個log值的範圍(10-9-105μg/μL)，敏感度高，起始濃度在10-9μg/μL也可獲得良好的定量效果。參照標準品工作曲線，可以準確地得到樣品中起始模板的濃度。
3.螢光定量PCR檢測看家基因18S rRNA基因的表達為調整各樣品間在RNA抽提和逆轉錄過程中反應效率的差異，檢測目的基因表達量的同時需檢測看家基因18S rRNA基因的表達。檢測18S rRNA和目的基因的螢光定量PCR的反應體系如下

PCR反應條件熱啟動和變性94℃15min，50個循環(94℃變性15sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec並檢測螢光，80℃20sec並檢測螢光)。
4.熔解曲線分析和螢光定量PCR產物的檢測所有PCR產物經50個循環完成以後，以0.2℃/sec的速度使溫度從72℃緩慢上升到95℃。擴增產物雙鏈DNA隨溫度的升高逐漸變性解鏈為單鏈，SYBR GreenI染料逐漸釋放出來，螢光信號逐漸減弱，儀器每升高0.2℃檢測一次反應管內螢光強度的變化，最後得到擴增產物螢光信號強度對溫度變化的熔解曲線(Melting curve)，定量PCR儀自動以dF/dT對溫度T作圖。根據熔解曲線的形狀和峰值對反應管中的擴增產物進行鑑定。為消除引物二聚體對Ct的影響，將每個循環中的讀板溫度調高到80℃，在這一溫度下雙鏈的引物二聚體變性，釋放出結合的SYBR-Green染料，從而消除了引物二聚體產生的螢光信號。
根據標準曲線，求出各待測樣品cDNA中各目的基因的原始濃度，然後以每份cDNA中目的基因濃度除以每份cDNA中的看家基因18S rRNA的濃度對每個樣品中目的基因的濃度進行校正。每份樣品目的基因的校正濃度除以非轉化對照根中該目的基因的校正濃度，則表示樣品對非轉化對照根的相對表達量，非轉化對照根的表達量即為1。
通過研究，本發明中提供了一種實時螢光定量PCR測定長春花TIAs生物合成基因表達量的方法。應用本發明的方法，具有快速、準確、靈敏度高、擴增汙染小等優點，同時，同一樣本可同時分析TIAs生物合成途徑中多個目的基因的表達，大大節約了成本。
5.螢光定量PCR檢測轉基因長春花毛狀根中12個基因的表達用螢光定量PCR技術測定實施例3轉基因長春花毛狀根中TIAs生物合成基因的表達情況，結果表明，str和g10h基因導入長春花毛狀根可誘導初級代謝中asα和ggpps的表達，還可誘導次級代謝中g10h、str、tdc、cpr、sgd、dat和d4h的表達。
本實施例採用螢光定量PCR技術測定轉基因長春花毛狀根中TIAs生物合成相關基因的表達，通過基因表達量的高低可以初步篩選出TIAs高產的長春花毛狀根。
實施例5利用HPLC測定轉基因長春花毛狀根中TIAs含量1.毛狀根液體培養選取實施例3中生長迅速的長春花毛狀根無性系，在超淨工作檯上取出毛狀根培養物，無菌水衝洗掉瓊脂後，用無菌濾紙吸乾表面水分，將毛狀根切成約5cm長的根段，放入裝有30mL 1/2MS液體培養基的150mL三角瓶中，起始接種量為0.5-1.0g鮮重/瓶。將培養瓶置於轉速為110rpm的旋轉式搖床上，於25℃黑暗下振蕩培養。每隔3d隨機抽取毛狀根培養物3瓶，用濾紙吸乾毛狀根表面水分後，稱取鮮重，並計算毛狀根培養物的鮮重增值倍數。通過研究，在本發明中長春花毛狀根接種後的1-9d，毛狀根生長較緩慢，處於毛狀根生長的停滯期。9-21d毛狀根生長迅速，為快速生長的對數期，毛狀根繁殖係數從3.89增至47.87。21d後，生長速率開始下降，進入生長平臺期。培養40d後，由於培養基內營養成分的消耗，培養物開始褐化衰老，並逐漸變成淺黃色。
2.色譜條件及系統適用性以及標準溶液的配製色譜柱C-18反相矽膠柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)。流動相為乙腈∶磷酸緩衝液(體積比25∶75)。檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量10μL，靈敏度(AUFS＝1.0)，理論塔板數按長春鹼、長春新鹼和阿嗎鹼峰計算不低於2000。
精密稱取長春鹼、長春新鹼和阿嗎鹼標準品10.0mg、5.0mg和10.0mg，用1mL甲醇完全溶解，分別得到10mg/mL長春鹼、5mg/mL長春新鹼和10mg/mL阿嗎鹼對照品溶液，作為標準品貯備液，保存於-20℃備用。
HPLC流動相是由乙腈和5mM Na2HPO4(用H3PO4調節pH值至6.0)組成的混合液。本發明中流動相乙腈-磷酸緩衝液在體積比25∶75時，長春新鹼、阿嗎鹼和長春鹼的保留時間分別為3.195min、4.727min和6.232min，峰型良好，且可保證三種萜類吲哚生物鹼良好分離。理論塔板數按長春鹼、長春新鹼和阿嗎鹼計算不低於2000。
3.標準曲線的製作將所述對照品溶液分別稀釋1、2、5、10倍，在相應色譜條件下進樣，記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品濃度(X，mg/L)進行回歸分析。通過研究，本發明中長春鹼在2.5-25mg/L、長春新鹼在2.5-25mg/L、阿嗎鹼在2.5-25mg/L範圍內呈現良好的線性關係。長春鹼、長春新鹼和阿嗎鹼對照品的線性回歸方程分別為試驗3、不同途徑應用異煙肼的體內抑菌作用比較以大白鼠為試驗對象，重複試驗2，結果見表1表1

以上結果表明，抗結核病藥物異煙肼經不同途徑給藥的抑菌作用不同，以局部應用的效果為好(P＜0.05)，其中局部注射異煙肼緩釋注射劑和局部放置異煙肼緩釋植入劑的效果更好。
試驗4、不同途徑應用異煙肼的體內抑菌作用比較以大白鼠為試驗對象，重複試驗3，但觀察動物至給藥後60天，結果見表2表2

以上結果表明，抗結核病藥物異煙肼經不同途徑給藥的抑菌作用不同，以局部應用的效果為好，其中局部注射異煙肼緩釋注射劑和局部放置異煙肼緩釋植入劑的效果更好。但局部放置異煙肼緩釋植入劑的效果比局部注射異煙肼緩釋注射劑的效果為好(P＜0.01)。
170PatentIn version 3.121012111044212DNA213長春花(Catharanthus roseus)4001atgatggcag ttttcttcat gtttttcctt cttcttcttt cttcttcttc ttcttcttct 60tcttcttcac caattttgaa aaagattttt attgaaagcc cttcctatgc tccgaatgcc120ttcaccttcg attcaactga taaagggttc tacacttccg tccaagatgg ccgagttatc180aaatatgaag ggccaaattc aggcttcact gacttcgcct acgcatctcc cttctggaac240aaagcttttt gtgagaacag caccgatcca gagaaaagac cattgtgtgg gaggacatat300gatatttcct atgactataa gaacagccaa atgtacattg ttgatggcca ttaccatctt360tgtgtggttg gaaaagaagg tgggtatgcc acacaactag ccacaagtgt gcaaggagtg420ccattcaaat ggctctatgc agtaactgtt gatcagagaa cagggattgt ttatttcact480gatgttagct ccatacatga tgacagtccc gaaggtgtgg aagaaatcat gaatacaagt540gatagaacag ggagattaat gaagtatgat ccttcaacaa aagaaaccac cttattattg600aaagagctac atgttcccgg cggtgcagaa atcagcgcag atggttcctt tgttgtagta660gcagaatttt taagcaatcg gatagtgaag tattggctag aagggccaaa gaaaggcagt720gcagagttct tagttacaat cccaaatcca ggaaatataa agaggaattc tgatggccat780ttttgggtgt cttcaagtga agaattagat ggaggtcaac atggaagtgt tgtttcaaga840ggaattaagt ttgatggatt tgggaatatt cttcaagtta taccacttcc accaccatat900gaaggtgaac attttgaaca gattcaagag cacgatggtt tgttatacat tggaagtctc960tcccatagct ctgtgggtat attagtgtat gatgatcatg ataacaaggg aaattcttat 1020gtttctcagc tagtcattaa ttga 1044SEQ ID NO.2的信息21022111482212DNA213長春花(Catharanthus roseus)4002atggattacc ttaccataat attaacttta ctatttgcct tgactctcta tgaagccttc 60
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1.一種提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼含量的方法，其特徵在於，從長春花中克隆str和g10h基因，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用髮根農桿菌介導，將str和g10h基因同時導入長春花細胞並再生出毛狀根，PCR和螢光定量PCR檢測外源目的基因str和g10h的整合和表達情況，高效液相色譜測定長春花毛狀根中TIAs含量。
2.根據權利要求1所述的提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼含量的方法，其特徵是，包括如下具體步驟(1)採用基因克隆方法獲得長春花關鍵酶基因str和g10h；(2)把str和g10h基因可操作性地連於表達調控序列，形成含str和g10h基因的植物表達載體；(3)將含str和g10h基因的植物表達載體轉化髮根農桿菌，獲得用於轉化長春花的含str和g10h基因植物表達載體的髮根農桿菌菌株；(4)利用所構建的髮根農桿菌菌株轉化長春花細胞，獲得經PCR檢測的轉基因毛狀根；(5)螢光定量PCR測定長春花毛狀根中TIAs生物合成相關基因的表達；(6)對獲得的轉基因毛狀根中TIAs含量進行高效液相色譜法測定，獲得TIAs含量顯著提高的轉基因長春花毛狀根。
3.根據權利要求1所述的提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼含量的方法，其特徵是，所述的經PCR檢測的轉基因毛狀根，分別設計合成rolB、rolC、hpt、str和g10h基因的引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因長春化毛狀根。
4.根據權利要求1所述的提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼含量的方法，其特徵是，所述的高效液相色譜法測定阿嗎鹼、長春鹼和長春新鹼含量的方法如下色譜柱C-18反相矽膠柱，流動相乙腈∶磷酸緩衝液，體積比為25∶75，檢測波長220nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量10μL，靈敏度為AUFS＝1.0，理論塔板數按長春鹼、長春新鹼和阿嗎鹼峰計算≥2000。
5.根據權利要求1所述的提高長春花毛狀根萜類吲哚生物鹼含量的方法，其特徵是，所述的螢光定量PCR測定長春花毛狀根中TIAs生物合成相關基因的表達的方法為分別設計合成長春花TIAs生物合成途徑中的11個基因和看家基因18S rRNA的引物，進行螢光定量PCR擴增，用相對定量法分析基因相對表達量。
全文摘要
本發明是一種生物技術領域的提高長春花毛狀根TIAs含量的方法。本發明從長春花中克隆str和g10h基因，構建含str和g10h基因的植物表達載體，遺傳轉化長春花獲得轉基因長春花毛狀根，高效液相色譜法測定長春花毛狀根中TIAs含量，螢光定量PCR測定長春花毛狀根TIAs生物合成相關基因的表達。本發明獲得的轉基因長春花毛狀根中重要TIAs[抗癌藥物長春鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)]的含量顯著提高，其中長春鹼含量比非轉化對照根提高了234倍，從而提供了一種提高長春花毛狀根TIAs的方法，也為生產具重要臨床需求的抗癌藥物長春鹼和長春新鹼提供了一種新方法。
文檔編號C12Q1/68GK1858212SQ20051011221
公開日2006年11月8日 申請日期2005年12月29日 優先權日2005年12月29日
發明者唐克軒, 龔一富, 廖志華, 苗志奇, 孫小芬 申請人:上海交通大學