一種用於治療惡性腫瘤的中藥組合物及其製備方法
2023-04-30 21:19:26
專利名稱：一種用於治療惡性腫瘤的中藥組合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥組合物，尤其是指一種用於惡性腫瘤治療的中藥組合物，本發明還涉及該中藥組合物的製備方法。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病、多發病，發病率及死亡率逐年上升，癌症患者中約70％～80％是中晚期，大多數失去早期手術根治的機會，多以放療或化療為主，雖有一定的近期療效，但常因不良反應大，且緩解期短，生存質量差，不能明顯延長患者的生存期。中醫藥治療惡性腫瘤，在改善症狀，提高生活質量，穩定縮小癌灶，延長生存期等方面的優勢得到國內和國際同仁的廣泛認可。
中醫藥是中華民族文化瑰寶之一，在當今腫瘤治療中也仍然具有獨特的地位和作用，如中醫的陰陽平衡理論對於理解與腫瘤發生發展密切相關的癌基因和抑癌基因、細胞信號轉導和細胞周期的調控，具有一定的理論指導意義。有效抗癌藥如喜樹鹼、砒霜等已成為抗癌新藥開發的原料。中醫的一些扶正祛邪方劑在配合西醫的抗癌治療中，也起著一定的輔助作用。中醫藥關於固本、祛邪攻毒、軟堅化積的理論和療法在癌症防治中顯示其特色及顯著的療效。同傳統癌症療法相比，中醫藥具有不良作用小的優點(有些藥物除外)。另外，中醫藥在癌症治療上更注重整體與局部的關係，其中，對於提高晚期病人生活質量猶為中醫之所長。已有研究表明癌症的療法如放療、化療，甚至某些生物治療，由於其非特異毒性作用無可避免地損害了機體的正常功能。為了減少放療或化療等對機體的影響，提高機體對腫瘤的防禦能力，改善病人生活質量，採用中西醫結合防治腫瘤也許是理想的方法之一。
隨著中醫藥及中西醫結合防治腫瘤研究的傳承問題日益被關注，有關臨床及實驗研究也取得較大的進展，開發抗癌或抗癌輔助治療的中藥勢在必行。經資料檢索和臨床觀察，本發明人所採用的複方中藥的抗癌作用國內外尚未見相關報導，我們的臨床觀察初步顯示其具有抗癌潛能。為了開拓惡性腫瘤治療的中藥研發，本發明的發明人按照抗腫瘤藥物藥效學研究指導原則，對一種新的中藥複方的抗腫瘤作用進行系列研究，通過體外抗腫瘤活性試驗和體內抗腫瘤試驗研究該中藥複方的抗腫瘤作用，並對其抗腫瘤作用的機制進行了初步探討，該新複方中藥的抗腫瘤作用研究國內外尚未見報導。
發明內容
本發明要解決技術問題是提供一種治療效果好、適用面廣的用於惡性腫瘤治療的中藥組合物。
本發明要的另一技術問題是提供一種上述中藥組合物的製備方法。
本發明的前一技術方案是這樣的一種用於治療惡性腫瘤的中藥組合物，是由下述重量份的原料藥製成，莪朮15份、半枝蓮30份、柴胡10份、黃芩10份、法夏15份、黨參30份、甘草5份、大棗10份、生薑6份。
上述的用於治療惡性腫瘤的中藥組合物中所述的中藥組合物為口服液、片劑、膠囊、散劑等中藥常用劑型。
本發明的後一技術方案是一種用於治療惡性腫瘤的中藥組合物的製備方法，包括下述步驟(1)原料藥加8倍量的水，用水蒸汽蒸餾提取揮髮油2次，每次提取時間為2h；(2)藥渣與揮髮油合併共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，濾過，濾液濃縮成1g生藥/ml的濃縮液或將濃縮液乾燥成清膏後，加常用藥用輔料壓片或裝填膠囊或裝袋。
本發明的複方中藥中半枝蓮清熱解毒活血為君藥，莪朮行氣祛痰，法夏化痰散結，共為臣藥，黨參、大棗健脾益氣扶中，柴胡疏肝理氣，黃芩清熱解毒，共為佐藥；甘草和藥為使。諸藥合用，具有理氣活血、解毒散結、健脾益氣之功，臨床應用表明本發明的中藥組合物對肝癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤具有輔助治療效果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步地詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
實施例1按下述重量配比稱取原料莪朮15g、半枝蓮30g、柴胡10g、黃芩10g、法夏15g、黨參30g、甘草5g、大棗10g、生薑6g。
製備方法加8倍量的水，水蒸汽蒸餾提取揮髮油2次，每次提取時間為2h；藥渣與揮髮油合併共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，濾過，濾液濃縮成1g生藥/ml的濃縮液。
本發明的中藥組合物還可以進一步將濃縮液乾燥成清膏，然後加常用藥用輔料壓製成片或填裝膠囊或直接裝袋成散劑。
上述配方的本發明中藥組合物，也是人體每日的常用劑量，可採用水煎服兩次，早、晚各服用一次。
實驗例1 複方中藥急性毒性試驗實驗分組三組藥物處理組(1g生藥/ml複方中藥)，PBS對照組，非處理組。每組10隻昆明小鼠。
實驗步驟(1)採用小鼠口服灌胃給藥。(2)經預試驗，用最高濃度和最大容積的複方中藥給予小鼠灌胃，小鼠無一死亡，表明複方中藥急性毒性低，未能測得LD50；故本品僅進行最大給藥量試驗。(3)取SPF級昆明小鼠30隻，體重18～22g，如上述分三組，雌雄各半，給藥前禁食12h，然後給予上述複方中藥(1g生藥/ml)及PBS 0.8ml/只灌胃，每日3次，連續給藥7d，空白對照組不給藥，觀察比較並記錄小鼠的毒性反應及死亡數。
實驗結果給藥後30min小鼠出現輕微活動減少，2h左右恢復正常，實驗小鼠連續觀察7d，其全身狀況、攝食、飲水、大小便和體重增長均正常。無一動物死亡。7d後處死動物，剖解肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，未發現異常改變。
實驗例2 複方中藥對體外培養多種腫瘤細胞活性的影響(SRB法)磺基羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)是一種蛋白質結合染料，可與生物大分子中的鹼性胺基酸結合，在一定波長的OD值與細胞數呈良好的線形關係，可用作細胞數的定量。用胰酶消化對數生長期腫瘤細胞，用含10％小牛血清的RPMI1640或DMEM懸浮細胞，並調節細胞濃度為3×104個/ml。接種於96孔培養板內，每孔100μl，置37℃，5％CO2和100％溼度培養箱培養，培養12h後，分為加藥組和對照組進行處理。對照組每孔加入200μl全培養液，加藥組每孔加入含有各濃度藥的全培養液200μl，所加藥物濃度為每ml含的生藥量不同，分別為20mg/ml，10mg/ml，5mg/ml，2.5mg/ml，1.25mg/ml，0.625mg/ml，0.3125mg/ml。繼續培養分別於24h、48h或72h終止實驗，首先每孔加入200μl 10％遇冷的TCA固定1h，離心後去上清，再用水洗5遍，晾乾，然後每孔加入100μl的SRB染色15min後，用1％醋酸洗5遍，晾乾，最後每孔加入10mmol/lTris液150μl，振蕩器振蕩10分鐘，待完全溶解後於酶標儀λ570nm處檢測OD值。SRB實驗結果顯示複方中藥處理多種腫瘤細胞活性均有不同程度的抑制作用，並且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用更為明顯，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。結果表明該複方中藥在體外可抑制多種腫瘤細胞的活性，且抑制作用呈時效和量效關係，參閱表1A-1J。
表1A 複方中藥對CNE-1細胞的抑制作用(％)(x±sd)
表1B 複方中藥對CNE-2細胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1C 複方中藥對ARO細胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1D 複方中藥對KAT-4細胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1E 複方中藥對MCF-7細胞的抑制作用(％)(x±sd)
表1F 複方中藥對Her-18細胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1G 複方中藥對A-549細胞的抑制作用(％)(x±sd) 表1H 複方中藥對H-1299細胞的抑制率(％)(x±sd) 表1I 複方中藥對HCT116-14-3-3sigma+/+細胞的抑制作用(％)(x±sd)
表1J 複方中藥對HCT116-14-3-3sigma-/-細胞的抑制作用(％)(x±sd) 實驗例3 複方中藥的體內抗腫瘤試驗1.複方中藥對S180和EAC荷瘤鼠的抑瘤實驗實驗分組S180和EAC荷瘤鼠各分五組，包括PBS陰性對照組，CTX陽性組，複方中藥治療的高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)濃度組。
實驗步驟(1)藥液的配製用水將複方中藥原藥(1g生藥/ml)分別配成每毫升含0.5g、0.25g和0.125g生藥的高、中和低三個劑量的藥液，4℃冰箱保存，用時搖勻。(2)造模在超淨工作檯中無菌抽取小鼠腹腔內連續傳代的S180、EAC細胞，用生理鹽水調整細胞為2×107·ml-1，小鼠右背後皮下接種，每隻0.2ml。(3)動物隨機分組與處理造模後隨機分為五組，每組10或12隻，接種次日複方中藥分高、中、低3個劑量灌胃給藥(0.2ml/10g)，隱性對照組用等量的水灌胃，陽性對照組採用環磷醯胺(CTX)腹腔注射給藥，20mg/(kg·d)。連續給藥12d後停藥脫頸處死小鼠，取其腫瘤組織，濾紙吸乾後稱重，以抑瘤率代表治療作用。同時並取出小鼠脾臟、胸腺和肝臟，用濾紙吸乾後稱重。(4)計算抑瘤率抑瘤率(％)＝(1-給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)×100％。(5)計算脾係數、胸腺係數和肝係數脾係數＝脾臟重量(mg)/體重(g)，胸腺係數＝胸腺重量(mg)/體重(g)，肝係數＝肝臟重量(mg)/體重(g)。(6)統計學方法用SPSS12.0統計軟體做方差分析。
實驗結果從實驗結果可見，高、中、低濃度以及陽性對照組的腫瘤均小於陰性對照組(p＜0.05)，表明高、中和低濃度複方中藥對S180和EAC小鼠移植瘤均具有明顯抑制作用(P＜0.05)，各濃度XCHT用藥組抑瘤作用亦有差異(P＜0.05)。此外，我們還發現3種不同濃度複方中藥用藥後均可不同程度地增加荷瘤小鼠的體重(P＜0.05)。此項實驗各細胞株分別重複了三次，確保了其結果的可重複性與穩定性，見表2A-2B。複方中藥對S180和EAC荷瘤小鼠脾、胸腺和肝係數的影響結果表明低、中和高濃度複方中藥用藥後均可使荷瘤鼠脾、胸腺係數有不同程度的升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中高或中濃度組療效較好，優於低濃度組(P＜0.05)；而各組的肝係數變化差異不顯著(P＞0.05)，見表3A-3B。
表2A 複方中藥對S180荷瘤鼠移植瘤的抑瘤作用
注The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
表2B 複方中藥對EAC荷瘤鼠移植瘤的抑瘤作用
注The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
表3A 複方中藥對S180荷瘤小鼠脾、胸腺和肝係數的影響(x±sd)
注The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
表3B 複方中藥對EAC荷瘤小鼠脾、胸腺和肝係數的影響
注The mean difference versus controlis significant at the 0.05 level.
2.複方中藥對EAC荷瘤鼠脾淋巴細胞增殖的影響實驗分組陰性對照組水；陽性對照組CTX；複方中藥處理組分高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)濃度處理組。
實驗步驟(1)收集淋巴細胞無菌條件下取出經治療的荷瘤鼠脾臟，將脾臟研成細胞懸液，過200目不誘鋼篩，經計細胞數後，用培養液稀釋並調整細胞濃度為1×107/ml的脾細胞懸液。(2)接種取脾細胞懸液50μl(5×105細胞)加入96孔平板中，加ConA 2μg/孔，平行樣3份置於37℃，5％CO2孵育箱中培養72h。(3)用MTT法[4]測定小鼠脾淋巴細胞轉化率，即用加ConA孔的光密度值減去不加ConA的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力。
實驗結果實驗結果可見，高、中和低濃度組以及陽性對照組較空白對照組高，提示小鼠脾淋巴細胞轉化增殖能力提高(P＜0.01)，陰性對照組小鼠脾淋巴細胞轉化率較空白組低(P＜0.05)，見表4。
3.複方中藥對EAC荷瘤鼠白細胞介素2(IL-2)活性的影響實驗分組參照2。
實驗步驟各組經處理的小鼠常規製備脾細胞懸液5×109/l，加到24孔板中，每孔1ml，再加ConA(終濃度為5mg/l)，置於37℃，5％CO2孵育箱中培養48h後，離心吸上清，即獲得IL-2粗製劑，-20℃凍存待測。測定時取C57BL/6小鼠，無菌摘取胸腺，製備5×109/l的細胞懸液，加到96孔板中，使ConA終濃度為3mg/l，然後加入不同稀釋度的IL2上清，培養72h，培養結束前6h加入185×104Bq/孔3HTdR。收集細胞，液閃儀計數每min脈衝數。
實驗結果從實驗結果可見，與空白對照組相比，高、中、低濃度組以及陽性對小鼠脾細胞IL-2分泌有促進作用(P＜0.05)，以中濃度和陽性對照組最為明顯；陰性對照組與空白對照組比較沒有明顯統計學意義(P＞0.05)，見表4。
4.複方中藥對EAC荷瘤鼠CD4+/CD8+T淋巴細胞比值的影響實驗分組參照2。
實驗步驟摘小鼠眼球取血標本，取20μl抗凝血，加入20μl的抗CD4或抗CD8螢光抗體，作用15分鐘後加入200μl紅細胞裂解液，5分鐘後加入1ml PBS，3000r/min 2分鐘，沉澱用400μl PBS重懸後，在Facscalibur流式細胞儀(Becton Dickinson Inc)上檢測CD4+及CD8+T細胞數，並計算CD4+/CD8+比值。
實驗結果從實驗結果可見，與陰性對照組比較，高、中濃度組以及陽性對照組荷瘤小鼠CD4+/CD8+T淋巴細胞比值均升高(P＜0.01)，其中以中濃度最為明顯；而陰性對照組CD4+/CD8+T淋巴細胞比值較空白組低(P＜0.01)，見表4。
表4 對EAC荷瘤小鼠免疫的影響(x±sd，n＝6)
*P＜0.01，**P＜0.05vs control group△P＜0.01，▲P＜0.05vs negative group，5.電鏡觀察實驗分組S180荷瘤鼠陰性對照組水；陽性對照組CTX；複方中藥處理組分高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)濃度處理組。
實驗步驟(1)小鼠體內抑瘤實驗結束時，採用頸椎脫臼法殺死小鼠後，在無菌條件下取出腫瘤組織及小鼠脾臟、胸腺和肝臟置於培養皿中，用刀片切取約1×1mm3大小放入預冷的2.5％戊二醛中固定；(2)2％餓酸後固定，酒精、丙酮梯度脫水，Epon812滲透包埋，LKBTV型超薄切片機切片，鈾鉛雙重染色；(3)CM10透射電鏡觀察和照像。
實驗結果電鏡觀察細胞超微結構變化發現，複方中藥高中濃度治療組S180荷瘤鼠腫瘤組織中細胞出現典型凋亡形態學改變。電鏡下可見，凋亡細胞皺縮，核膜完整，染色質濃縮、聚集，邊移至核膜內側，呈新月形或馬蹄型的塊狀。而CTX用藥組亦出現凋亡，但主要以細胞壞死為主。可以判定複方中藥在上述濃度條件下可以誘S180荷瘤鼠腫瘤組織細胞凋亡。此外電鏡觀察肝臟未見明顯損傷，電鏡檢測荷瘤小鼠脾和胸腺發現出現明顯的淋巴細胞增殖的表現。
實驗例4 複方中藥治療鼻咽癌的體內外研究1.複方中藥對體外培養的CNE-1和CNE-2細胞形態的影響實驗分組藥物處理組複方中藥終濃度分別為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml；對照組無血清的RPMI-1640培養液；實驗步驟(1)藥物配製用RPMI-1640配製濃度分別為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml的複方中藥備用；(2)接種細胞培養CNE-1和CNE-2細胞至對數生長期，經0.25％胰酶消化細胞，1000rpm離心3min，棄上清後用含10％胎牛血清的RPMI-1640重懸；(3)分別接種等量的細胞於12孔板上，每組2個平行孔，每株細胞5個孔，置CO2培養箱(37℃，5％CO2，以下同)培養12h，細胞貼壁；(4)藥物處理細胞吸去培養液，加入預製的含有不同濃度藥物的培養液，每孔2ml，放培養箱中培養；(5)觀察結果分別在藥物處理後24h，，48h取出，在顯微鏡下拍照。
實驗結果光鏡下觀察發現，培養的CNE-1和CNE-2細胞均存在腫瘤細胞的生長特性，表現為增殖快，分裂相多。而受複方中藥藥物作用的影響，細胞增殖的速度發生明顯變化，隨著藥物濃度的增加和藥物作用時間的延長，細胞出現明顯的壞死，5mg/ml以上濃度處理組幾乎無貼壁細胞，表現為細胞間間隙增大，細胞變圓並從瓶底脫落。
2.複方中藥對體外培養的CNE-1和CNE2細胞活性的影響(MTT法)實驗分組藥物處理組複方中藥終濃度分別為20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml和0.3125mg/ml；對照組無血清的RPMI-1640培養液；實驗步驟(1)藥物配製無血清RPMI-1640培養液配製320mg/ml的複方中藥備用，使用時用培養液等倍稀釋成上述藥物處理組各濃度。用PBS配製5mg/mlMTT，過濾消毒備用；(2)收集細胞取對數生長期的CNE-1和CNE-2細胞常規胰酶消化後，離心，用含10％胎牛血清的RPMI-1640配成5×104/ml細胞懸液；(3)接種細胞將細胞以適當的密度(5000個/孔)接種於用96孔培養板中，每孔100μL，37℃、5％CO2孵箱中培養12h，細胞貼壁；(4)藥物處理細胞按藥物處理組與對照組加入不同濃度的複方中藥以及無血清的RPMI-1640培養液，每組6個平行孔，共3塊培養板，置培養箱中繼續培養；(5)加入MTT在24h、48h和72h後分別取出一塊板，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，繼續培養約4h；(6)加入DMSO溶解結晶吸出培養液後，加入150μL/孔DMSO，室溫下振蕩10min，待紫藍色結晶完全溶解後，在自動酶標儀上測定各孔的570nm處的吸光值(A570)；(7)複方中藥抑制率的計算按以下公式計算每孔的抑制率，繪製劑量—效應曲線
(8)IC50計算SPSS做抑制率對藥物濃度的對數回歸，獲得回歸方程後，以抑制率為50％代入方程，算出半數抑制濃度(IC50)，進行比較；(9)統計分析運用SPSS12.0單因素方差分析，使用SNKq法(方差齊性時)及Dunnet′s T3法(方差不齊時)驗後比較，相關分析採用Spearman′sρ相關係數表示。檢驗水準α＝0.05。
實驗結果此實驗中，將不同濃度的藥物複方中藥分別作用於CNE-1和CNE-2細胞24h，48h和72h，用MTT法檢測藥物作用後CNE-1和CNE-2細胞的存活情況，發現複方中藥對兩株細胞均存在不同程度的抑制作用，其藥效隨藥物濃度的增加而明顯增強，見表5A，表5B。
表5A 複方中藥對CNE-1細胞的抑制作用(％)(x±sd) 表5B 複方中藥對CNE-2細胞的抑制率(％)(x±sd) 3.複方中藥對體外培養的CNE-1和CNE2細胞活性的影響克隆形成實驗實驗分組複方中藥終濃度分別為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.625mg/ml；對照組2倍的RPMI-1640培養液；
平板克隆實驗步驟(1)取指數生長期的CNE-1和CNE-2細胞，0.25％胰酶消化成單細胞懸液，計數細胞；(2)接種到直徑6em的平皿中(100個/平皿)，培養箱中過夜，細胞貼壁後，棄培養液，PBS洗2次，換不同濃度藥物或無血清的RPMI-1640培養液培養24h後，全部換新鮮培養液。每個濃度組設3個平行孔；(3)37℃，5％CO2條件下培養10～14d，每三d換新鮮培液一次，至肉眼可見集落形成；(4)棄培養液，用PBS洗2次，甲醛固定15min，姬姆薩應用液染色20min；(5)流水衝洗染色液，空氣乾燥；(6)燈箱下計數每個培養孔中的集落數，以＞50個細胞數作為一個集落，計算每組均值；(7)計算每孔的克隆形成率，按以下公式克隆形成率(％)＝克隆數/接種細胞數×100％；(8)統計學處理運用SPSS12.0單因素方差分析，使用SNKq檢驗(方差齊)及Dunnet’s T3法(方差不齊)，檢驗水準a＝0.05。
軟瓊脂克隆實驗步驟(1)瓊脂糖配製製備1.4％和0.7％的瓊脂糖溶液稱取0.7g和0.35g瓊脂糖，分別加入50ml三蒸水，高壓蒸汽滅菌。溶解後即為1.4％和0.7％的瓊脂糖溶液。置於45℃烤箱中待用；(2)藥物配製製備2倍的RPMI-1640培養液(含20％新生牛血清以及2倍雙抗)，並用其對倍稀釋配製10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.625mg/ml濃度的複方中藥。對照組為2倍的RPMI-1640培養液；(3)製備下層瓊脂糖取6支離心管，每管中加入500μL含有上述濃度的藥物或培養液。每管中再加入500μL1.4％瓊脂糖溶液，迅速混勻後加入24孔板中，每孔500μL，每組兩孔；(4)製備上層瓊脂糖a)再取6支離心管，各管中加入440μL含有上述濃度的藥物或培養液；b)取培養至對數生長期的CNE-1和CNE-2細胞，消化成單個細胞，離心，用適當的培養液重懸至1×105/ml，在上述離心管中加入60μL/管(3000個/孔)；c)取出0.7％的瓊脂糖溶液，在超淨工作檯中放置片刻，等冷至40℃時，加入離心管，500μL/管，吹打均勻，迅速加入24孔板，500μL/孔；(5)放置37℃、5％CO2的培養箱培養10-14d；(6)染色並觀察用1mg/mL的iodonitrotetrazolium chloride進行染色，每孔加入0.1ml染色液，置培養箱中放置過夜；(7)計數集落形成數低倍鏡(4×物鏡)視野下在每孔的四角和中心隨機選取5個視野，計數直徑大於10μm的集落數量；(8)統計學處理運用SPSS12.0採用單因素方差分析(ANOVA)，驗後比較採用SNKq(方差齊性)和Dunett′s T3(方差不齊)。檢驗水準α＝0.05。
實驗結果平板克隆試驗發現不同濃度複方中藥作用細胞24h後，觀察細胞克隆形成情況，與對照組比較，處理組細胞克隆數減少，並隨著藥物劑量的增加而減少，說明複方中藥對細胞的增殖能力也有抑制作用。各個藥物濃度組的細胞擊落形成率見表6；表6 複方中藥對CNE-1和CNE-2細胞克隆形成數的影響(x±sd)(平板克隆實驗)
The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
軟瓊脂克隆試驗亦發現與對照組相比，通過低倍鏡(4×物鏡)觀察，處理組的集落形成的數目隨著劑量的增加而減少，高濃度實驗組的集落形成的數目明顯減少(P＜0.01)。低濃度處理組雖在形成集落的數量上與對照相仿，但可見其集落略小於對照組的平均水平，見表7。
表7 複方中藥對CNE-1和CNE-2細胞的克隆形成數的影響(個/10×4視野，4×物鏡)(x±sd)(軟瓊脂克隆試驗)
The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
4.複方中藥對CNE-2裸鼠移植瘤模型的半體內抑瘤實驗實驗分組藥物處理組複方中藥的終濃度分別為10mg/ml、5mg/ml和2.5mg/ml的各5隻；對照組PBS對照組，5隻。
實驗步驟(1)處理細胞取對數生長期的CNE-2細胞常規胰酶消化後，離心，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養液配成5×105/ml細胞懸液，以每瓶2mL接種於底面積為75cm2培養瓶上(共接種40瓶)，培養箱中培養24h。待細胞貼壁後，棄去原培養液，加入等量預製的含有不同濃度藥物的培養液，繼續培養24h後，消化細胞，離心，配成1×106/ml細胞懸液；(2)荷人鼻咽癌裸鼠模型的複製和分組取20隻裸鼠稱重後完全隨機分為4組，即PBS對照組、ELXCH低(2.5mg/ml)、中(5mg/ml)、高(10mg/ml)濃度組。無菌條件下，在裸鼠左臀部和右頸前皮下接種CNE2細胞懸液0.2ml/只複製荷人鼻咽癌裸鼠模型，接種腫瘤細胞後不作任何處理。每3d稱裸鼠體重(g)以及測量腫瘤的長徑(L)和寬徑(D)一次，按照公式如下公式計算腫瘤體積V=6LD2]]>(3)收集標本接種CNE-2細胞16d，頸椎脫臼處死裸鼠，將腫瘤取出拍照、稱重；(4)統計處理腫瘤體積和剝離腫瘤重量的差異運用SPSS12.0作單因素方差分析。
實驗結果飼養的BALB/c裸小鼠在背部皮下種植了CNE-2細胞後的第3d，對照組即可在種植局部觸摸到新生的腫瘤組織。質硬、與周圍組織有粘連而不易推動。用遊標卡尺測量腫瘤的長、短徑來估計腫瘤的體積，發現對照組腫瘤增殖明顯快於複方中藥處理組，腫瘤的體積與處理組比即有統計學差異，見表8A。
表8A 複方中藥對CNE-2移植瘤體積的影響(mm3)(x±sd)
*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
種植腫瘤16d後，將腫瘤組織剝離，切取部分組織做HE染色，證實所切取的是NPC組織。對照組各只裸鼠均有腫瘤生長；低濃度處理組的5隻裸鼠也均有腫瘤生長；中、高濃度處理組未見明顯的腫瘤組織。將剝離的腫瘤組織稱重，發現低濃度處理組與對照組相比腫瘤重量有差異(P＜0.05)，見表8B。
表8B CNE-2接種裸鼠16d後剝離出腫瘤的重量
*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
5.複方中藥對CNE-2裸鼠移植瘤模型的體內抑瘤實驗實驗分組分五組，包括PBS陰性對照組，CTX陽性組，複方中藥藥物治療組分高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)濃度組。
實驗步驟(1)藥液的配製用蒸餾水將複方中藥原藥(1g生藥/ml)分別配成每毫升含0.5g、0.25g和0.125g生藥的高、中和低三個劑量藥液，4℃冰箱保存，用時搖勻。(2)造模取對數生長期的CNE-2細胞常規胰酶消化後，離心，用無血清的RPMI-1640培養液配成5×105/ml細胞懸液，小鼠右背後皮下接種，接種體積0.2ml/只。(3)動物隨機分組與給藥造模成功後隨機分為五組，每組8隻，接種次日複方中藥分高、中、低3個劑量灌胃給藥(0.2ml/10g)，模型對照組用同等量經消毒的水灌胃，陽性藥物組採用環磷醯胺(CTX)腹腔注射，20mg/(kg·次)，2次/周，連續給藥15d。(4)每3d測量腫瘤的長徑(L)和寬徑(D)一次，按照公式如下公式計算腫瘤體積V=6LD2]]>(5)收集標本接種CNE-2細胞16d，頸椎脫臼處死裸鼠，將腫瘤取出拍照、稱重。(6)統計處理腫瘤體積和剝離腫瘤重量的差異運用SPSS12.0作單因素方差分析。
實驗結果飼養的BALB/c裸小鼠在背部皮下種植了CNE-2細胞後的第3d，對照組即可在種植局部觸摸到新生的腫瘤組織。質硬、與周圍組織有粘連而不易推動。用遊標卡尺測量腫瘤的長、短徑來估計腫瘤的體積，發現對照組腫瘤增殖明顯快於複方中藥和環磷醯胺治療組，腫瘤的體積與中、高濃度複方中藥治療組及環磷醯胺治療組比即有統計學差異(P＜0.05)，見表9，與低濃度治療組比無統計學意義(P＞0.05)。
表9A 複方中藥對CNE-2裸鼠移植瘤體積的影響(mm3)(x±sd) *The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
種植腫瘤15d後，將腫瘤組織剝離，切取部分組織做HE染色，證實所切取的是NPC組織。除CTX組一隻未長腫瘤，其它均可見大小不等的腫瘤生長。將剝離的腫瘤組織稱重，發現中、高濃度、CTX處理組與對照組相比腫瘤重量有差異(P＜0.05)，低濃度組與對照組比腫瘤腫瘤無差異(p＞0.04)，見表9B。
表9B CNE-2接種裸鼠15d後剝離出腫瘤的重量
*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
6.激酶試驗實驗分組藥物處理組複方中藥終濃度分別為5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml；對照組PBS。
實驗步驟(1)收集細胞棄去舊液，用2ml PBS洗滌，棄去PBS後，置於冰上。添加1.5ml無菌PBS液。收集細胞，放入1.5ml的離心管內離心，5000rpm 5分鐘後棄去PBS液；(2)加入400ul NP40-RIPA+1x pepstatin+1xPMSF+coctail蛋白酶抑制劑+1xNaF+1x NaVO4溶解細胞，將細胞溶解產物離心，14K，15min，4℃，移上清液於新的微量離心管；(3)用Bradford法檢測蛋白沉澱物；(4)使每份樣本的總蛋白量一致，並加溶解緩衝液致每份樣品總容量為400ul；(5)在微量管中加入8ulαCdK2，於4℃孵育1h，適時振蕩，加入70ul Protein A懸濁液，孵育30min，將免疫沉澱複合物離心，4000rpm，5min，4℃；(6)用1ml NP40-RIPA(無NaF，NaVO4)洗滌，重複3次，用1ml 1x激酶緩衝液洗滌一次；(7)將免疫沉澱複合物離心，4000rpm，5min，4℃，加入同位素標記的ATP；(8)加50ul/Rx Histone H1 mix入複合物，室溫下孵育15min，加入10ul 5x上樣緩衝液，煮沸變性5min；(9)行SDS-PAGE電泳，180V，1h；(10)去除凝膠的兩端，置於幹膠器上30min，依據phosphor-imaging說明顯影。
實驗結果激酶分析試驗檢測發現複方中藥可引起CNE-1和CNE-2細胞CDK-2激酶水平改變，其中5mg/ml複方中藥引起CNE-1激酶水平降低最為明顯而1.25mg/ml複方中藥引起CNE-2激酶水平降低最明顯。
7.miRNA表達譜晶片檢測複方中藥對CNE-2細胞miRNA表達的影響實驗分組CNE-2；複方中藥(10mg/ml)處理48h的CNE-2。
實驗步驟(1)樣品RNA抽提，取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，吸去PBS後用TRIZOL試劑抽提RNA；(2)RNA質量檢測a.紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260NM和280NM的吸收值，以計算濃度並評估純度；b.用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性；(3)製備螢光標記探針採用miRCURYARRAY標記試劑盒，用標記酶將CY3或CY5螢光基團標記microRNA，可以得到用於與晶片雜交的螢光探針。(4)晶片雜交在標準條件下將標記好的探針和miRCURY的microRNA晶片雜交；(5)圖像採集和數據分析使用GenePix 4000B晶片掃描儀掃描晶片的螢光強度，並將實驗結果轉換成數字型數據保存，使用配套軟體對原始數據進行分析運算。
實驗結果CNE-2經10mg/mL的複方中藥處理48h後，經miRNA表達譜晶片檢測，從Cy3和Cy5信號圖像可以直接讀出miRNA表達譜，從Cy3/Cy5比的信號圖像可以得到兩個樣本之間的差異表達；經miRNA晶片檢查發現複方中藥處理的CNE-2與正常CNE-2間miRNA表達差異如下表所示，見表10；我們選出log2(Sample B/Sample A)2的miRNA進行靶點預測發現hsa-miR-450存在7個可能的靶基因，但進一步的驗證工作需要深入探討。
表10 複方中藥對CNE-2細胞的miRNA的影響
權利要求
1.一種用於治療惡性腫瘤的中藥組合物，其特徵是由下述重量份的原料藥製成，莪朮15份、半枝蓮30份、柴胡10份、黃芩10份、法夏15份、黨參30份、甘草5份、大棗10份、生薑6份。
2.根據權利要求1所述的用於治療惡性腫瘤的中藥組合物，其特徵是所述的中藥組合物為口服液、片劑、膠囊、散劑。
3.權利要求2所述的用於治療惡性腫瘤的中藥組合物的製備方法，其特徵是包括下述步驟(1)原料藥加8倍量的水，用水蒸汽蒸餾提取揮髮油2次，每次提取時間為2h；(2)藥渣與揮髮油合併共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，濾過，濾液濃縮成1g生藥/ml的濃縮液或將濃縮液乾燥成清膏後，加常用藥用輔料壓片或裝填膠囊或裝袋。
全文摘要
本發明公開了一種用於治療惡性腫瘤的中藥組合物，屬抗腫瘤藥物領域，其技術要點是由下述重量份的原料藥製成，莪朮15份、半枝蓮30份、柴胡10份、黃芩10份、法夏15份、黨參30份、甘草5份、大棗10份、生薑6份；本發明的中藥組合物可將原料藥按常規煎熬、濃縮或醇提、濃縮等加工製成口服液、片劑、膠囊、散劑等；本發明的新複方中藥在臨床應用已經顯示較好的抗腫瘤和改善病人狀態功效，組份中的原料藥資源豐富，可用於輔助治療肝癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤。
文檔編號A61K9/08GK101073663SQ20071002697
公開日2007年11月21日 申請日期2007年2月16日 優先權日2007年2月16日
發明者楊惠玲, 陳澤雄, 夏洪平 申請人:中山大學