去甲斑蝥素在治療慢性腎小球腎炎藥物中的新用途的製作方法

2023-05-01 12:16:36 4

本發明涉及醫學技術領域，涉及抗腫瘤藥物-去甲斑蝥素的新用途，具體涉及去甲斑蝥素在治療慢性腎小球腎炎藥物中的新用途。

背景技術：

慢性腎小球腎炎是目前導致我國終末期腎病(esrd)的主要病因，蛋白尿及腎間質纖維化是導致其進展為esrd的重要獨立危險因素，因此減輕蛋白尿及腎間質纖維化是延緩和阻斷慢性腎小球腎炎進展的關鍵環節[1-2]。目前臨床常用的治療慢性腎小球腎炎的藥物包括糖皮質激素、免疫抑制劑及raas阻斷劑等，這些藥物雖具有一定的降尿蛋白作用，但其對腎間質纖維化的治療作用不確定，且具有一定的毒性或其他副作用，造成患者依從性下降、疾病容易復發或進展[3-6]。為此，尋找有效減少尿蛋白並逆轉腎間質纖維化，且副作用少、依從性好、價格適中的治療藥物，具有重要的臨床意義。

去甲斑蝥素(norcantharidin，nctd)是我國傳統中藥斑蝥素(cantharidin，ctd)的衍生物，它較斑蝥素毒性降低，能明顯減輕對泌尿系統強烈的刺激性，保留了其升高白細胞的作用，並且藥理作用更為明確[7]。目前nctd在臨床上主要應用於治療肝癌、結腸癌等消化道腫瘤。研究報導nctd對動物正常體細胞無毒副作用，且能夠改變成纖維細胞形態，提示nctd可能對纖維化起作用[8]。我們既往將nctd首創性應用於蛋白負荷腎病大鼠、糖尿病腎病大鼠和梗阻性腎病大鼠等慢性腎臟病動物模型以及腎間質纖維化細胞模型，在國際上首次發現nctd具有降低尿蛋白以及減輕腎間質纖維化的作用[10-12]，故推測nctd可成為治療慢性腎臟病極有前景的新型藥物。

參考文獻：

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技術實現要素：

為解決目前尚無理想藥物延緩腎臟纖維化和腎功能衰竭，本發明首次將我國傳統應用於治療肝癌、結腸癌等消化道腫瘤疾病的傳統中藥衍生物去甲斑蝥素應用到對慢性腎小球腎炎患者的治療，與經典治療慢性腎小球腎炎藥物纈沙坦和雷公藤聯用治療慢性腎臟病，解決目前慢性腎小球腎炎藥物治療副作用較多、依從性差且對腎間質纖維化作用不明確等技術問題。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：

去甲斑蝥素在治療慢性腎小球腎炎藥物中的新用途，用於治療慢性腎小球腎炎。

去甲斑蝥素在治療慢性腎小球腎炎藥物中的新用途，包括：按照患者尿蛋白/尿肌酐比值，將去甲斑蝥素與慢性腎小球腎炎治療藥物聯用。

所述的慢性腎小球腎炎治療藥物包括纈沙坦和雷公藤的一種或兩者組合物。

所述的患者尿蛋白/尿肌酐比值為0.2-2.92g/gcr。

所述的患者尿蛋白/尿肌酐比值為0.2-0.95g/gcr時，將所述的去甲斑蝥素與纈沙坦聯用。

所述的患者尿蛋白/尿肌酐比值為0.95-2.92g/gcr時，將所述的去甲斑蝥素與纈沙坦和雷公藤聯用。

所述的去甲斑蝥素與慢性腎小球腎炎治療藥物聯用時以口服方式給藥。

所述的去甲斑蝥素與慢性腎小球腎炎治療藥物聯用時的藥物劑量為：所述的去甲斑蝥素為15mgtid，所述的纈沙坦為80mgqd，所述的雷公藤為20mgtid。

本發明具有如下優點：

1、本發明中去甲斑蝥素在治療慢性腎小球腎炎藥物中的新用途副作用小且可減輕腎間質纖維化，與經典的慢性腎小球腎炎治療藥物纈沙坦和雷公藤聯用發揮協同作用，能有效降低慢性腎小球腎炎患者的蛋白尿，且無明顯肝腎毒性及骨髓抑制等嚴重不良反應，安全性較好，可以為臨床治療慢性腎小球疾病提供新的治療方法。

2、去甲斑蝥素對動物正常體細胞無毒副作用，且能夠改變成纖維細胞形態，解決目前慢性腎小球腎炎藥物治療副作用較多，依從性差且對腎間質纖維化作用不明確等技術問題，提供了慢性腎小球腎炎治療新的治療途徑。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發明中nctd聯合治療前後慢性腎小球腎炎患者臨床緩解率變化圖，其中，pr：部分緩解，cr：完全緩解，a：單用纈沙坦組(arb組)與纈沙坦+nctd聯合治療組(nctd組)臨床緩解率對比，b：雷公藤+纈沙坦組(tw組)與雷公藤+纈沙坦+nctd組(twnc組)臨床緩解率對比；

圖2為本發明中nctd聯合治療前後慢性腎小球腎炎患者尿蛋白/尿肌酐比值變化，其中，a：單用纈沙坦組(arb)與纈沙坦+nctd聯合治療組(nctd組)尿蛋白/尿肌酐比值變化對比，b：雷公藤+纈沙坦組(tw)與雷公藤+纈沙坦+nctd組(twnc組)尿蛋白/尿肌酐比值變化對比；

圖3為本發明中nctd對慢性腎小球腎炎患者尿蛋白/尿肌酐比值下降程度的影響，其中，a：arb+nctd組在治療4周、8周、12周時尿蛋白/尿肌酐比值下降程度均大於arb組，其差異有統計學意義；b：arb+tw+nctd組在治療4周、8周、12周比arb+tw組尿蛋白/尿肌酐比值下降程度更高，其差異顯著；註：p<0.05，p<0.001，尿蛋白/尿肌酐比值下降程度＝治療前up/ucr-治療後up/ucr；

圖4為本發明中nctd對慢性腎小球腎炎患者腎小球濾過率的影響對比圖，其中，a：arb+nctd組與arb組腎小球濾過率組內與組間比較均無差異；b：arb+tw+nctd組與arb+tw組腎小球濾過率組內與組間比較均無差異；

圖5為本發明中nctd對慢性腎小球腎炎患者血白蛋白的影響對比圖，其中，a:arb+nctd與arb組血白蛋白組內與組間比較均無差異；b:arb+tw+nctd組與arb+tw組血白蛋白組內與組間比較均無差異；

圖6為本發明中nctd對小鼠腎臟纖維化的he染色對比圖，其中，a：正常組；b：uuo7d組；c：uuo7d+nctd(0.075mg/kg/d)組；d：uuo7d+nctd(0.15mg/kg/d)組；

圖7為本發明中nctd對小鼠腎臟纖維化的masson染色對比圖，其中，a：正常組；b：uuo7d組；c：uuo7d+nctd(0.075mg/kg/d)組；d：uuo7d+nctd(0.15mg/kg/d)組；

圖8為本發明中nctd對小鼠腎臟纖維化的免疫組化-fn蛋白表達對比圖，其中，a：正常組；b：uuo7d組；c：uuo7d+nctd(0.075mg/kg/d)組；d：uuo7d+nctd(0.15mg/kg/d)組；

圖9為本發明中nctd對小鼠腎臟纖維化的免疫組化-col-i蛋白表達對比圖，其中，a：正常組；b：uuo7d組；c：uuo7d+nctd(0.075mg/kg/d)組；d：uuo7d+nctd(0.15mg/kg/d)組；

圖10為本發明中nctd對小鼠腎臟纖維化的qrt-pcr對比圖，其中，nc：正常組；u7：uuo組；n7d：uuo+低劑量nctd組；n7g:uuo+高劑量nctd組。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

實施例1nctd的臨床試驗

由於關於nctd的臨床試驗目前尚處於剛剛起步階段，考慮到患者的安全性，目前先與其他治療慢性腎小球腎炎藥物聯用，待觀察到明顯療效後，再設置單獨nctd治療組。

1.1對象

採用單中心、隨機、平行對照方式，選取年齡在18歲到55歲之間的患者64例，臨床診斷符合慢性腎小球腎炎。

1.2方法

根據患者隨機尿蛋白/尿肌酐比值(urinaryprotein/creatinineratioup/ucr)分為2組：(1)尿蛋白/尿肌酐比值在0.2-0.95g/gcr組，其中對照組單用纈沙坦治療(簡稱arb組)，治療組為纈沙坦聯合去甲斑蝥素治療(簡稱arb+nctd組)；(2)尿蛋白/尿肌酐比值在0.95-2.92g/gcr組，其中對照組為纈沙坦和雷公藤聯合治療(簡稱arb+tw組)，治療組為纈沙坦、雷公藤、去甲斑蝥素三藥聯合治療(簡稱arb+tw+nctd組)；療效的評價指標為治療4周、8周、12周患者的有效緩解率(包括完全緩解率及部分緩解率)、尿蛋白/尿肌酐比值下降程度、血白蛋白、腎小球濾過率的變化情況，以及採用elisa法檢測治療前和治療12周的血和尿tgf-β1水平，並記錄治療過程中出現的藥物不良反應事件。

其中，纈沙坦為北京諾華製藥有限公司生產，國藥準字h20040217；雷公藤多甙片為浙江得恩德製藥有限公司生產，國藥準字z33020422；去甲斑蝥素華北製藥股份有限公司生產，國藥準字h13023495。

1.3結果

1.3.1nctd對有效緩解率的影響如圖1所示，(1)arb和arb+nctd兩組在治療4周、8周時有效緩解率無明顯差異；治療12周時arb組和arb+nctd組有效率分別為41.7％和83.3％，差異有統計學意義(p<0.05)，如附圖1(a)所示；(2)arb+tw+nctd組在治療4周、8周、12周有效緩解率均高於arb+tw組，分別為66.7％和81.25％、80％和93.75％、86.7％和93.75％，但差異無統計學意義(p＞0.05)，如附圖1(b)所示。

1.3.2nctd對尿蛋白/尿肌酐比值下降情況的影響如表1和圖2所示，(1)arb組在治療4周時尿蛋白/尿肌酐比值與治療前比較無明顯變化(p＞0.05)，治療8周、12周時與治療前比較尿蛋白/尿肌酐比值下降且有統計學差異(p<0.05)。arb+nctd組在治療4周、8周、12周時分別與治療前相比，尿蛋白/尿肌酐比值均有明顯下降且差異顯著(p<0.001)；(2)arb+tw組在治療4周時與治療前比較尿蛋白/尿肌酐比值下降(p<0.05)，治療8周、12周時與治療前相比有顯著下降(p<0.001)。②arb+tw+nctd組在治療4周、8周、12周時尿蛋白/尿肌酐比值較治療前均有顯著下降(p<0.001)。

各組尿蛋白/尿肌酐比值下降程度如圖3所示：①arb+nctd組下降尿蛋白/尿肌酐比值下降程度明顯大於arb組，且在治療4周、8周、12周後均有差異(p<0.05)(圖4-5)；②arb+tw+nctd組尿蛋白/尿肌酐比值下降程度較arb+tw組在治療4周、8周、12周均下降顯著，差異有統計學意義(p0.05；#示與治療前比較有統計學差異，p<0.05；&示與治療前比較有顯著統計學差異，p<0.01。

1.3.3nctd對腎小球濾過率的影響如圖4所示，(1)arb和arb+nctd組患者在治療前腎小球濾過率水平分別為104.68±24.20、109.61±17.94(p＞0.05)。在治療4周、8周、12周時兩組患者腎小球濾過率與治療前相比，無明顯變化(p＞0.05)；兩組進行組間比較，腎小球濾過率無統計學差異(p＞0.05)；(2)arb+tw與arb+tw+nctd組患者治療前腎小球濾過率分別為68.51±20.77、70.11±19.23，無統計學差異，在治療4周、8周、12周時與治療前比較無明顯上升或下降趨勢(p＞0.05)。兩組進行組間比較，腎小球濾過率無差異(p＞0.05)。

1.3.4nctd對血白蛋白變化的影響圖5所示，(1)arb組與arb+nctd組患者治療前血白蛋白無明顯差異，在治療4周、8周、12周時與治療前相比無明顯變化(p＞0.05)，兩組間進行組間比較，無明顯差異(p＞0.05)；(2)arb+tw組與arb+tw+nctd組患者在治療前兩組血白蛋白無差異(p＞0.05)，在治療4周、8周、12周時與治療前相比較無明顯變化(p＞0.05)，兩組患者血白蛋白組間比較無明顯差異(p＞0.05)。

1.3.5nctd對血和尿tgf-β1水平的影響如表2所示，(1)arb組與arb+nctd組患者血、尿tgf-β1水平治療12周後與治療前比較有下降明顯，且差異有統計學意義(p<0.05)，兩組間血、尿tgf-β1水平進行組間比較無差異(p＞0.05)；(2)arb+tw組和arb+tw+nctd組血、尿tgf-β1水平治療12周後與治療前相比有明顯下降(p<0.05)，但兩組血、尿tgf-β1水平進行組間比較無明顯差異(p＞0.05)。

表2各組治療前與治療12周後血和尿tgf-β1變化情況

註：*示4各組治療12周後與治療前相比，差異有統計學意義，p0.05。

1.3.6不良事件：nctd聯合治療過程中不良反應少見，最常見的不良反應為胃腸道反應，但患者可耐受；少數出現肝功能異常，在加用護肝藥後可好轉；各組中均未出現白細胞減少、血小板減少、貧血、肌酐倍增、感染等不良反應。

實施例2nctd的小鼠試驗

腎臟纖維化是慢性腎小球腎炎患者的臨床症狀之一，目前還沒有理想藥物能夠延緩腎臟纖維化和腎功能衰竭，將nctd單獨用於慢性腎小球腎炎患者的臨床治療還尚待研究，本實施例通過小鼠試驗證明nctd對延緩腎臟纖維化的作用，從而進一步明確nctd在治療慢性腎小球腎炎的新用途。

2.1對象

取8周大體重約20-22g的c57bl/6j雄性小鼠18隻，分為4組：正常組，單側輸尿管結紮(uuo)組，單側輸尿管結紮+低劑量去甲斑蝥素腹腔注射(uuo+低劑量nctd)組，單側輸尿管結紮+高劑量去甲斑蝥素腹腔注射(uuo+高劑量nctd)組。

2.2方法

將上述分組的小鼠分別予如下處理：1)正常組：常規麻醉消毒後沿腹正中線打開腹腔，暴露左側腎臟，游離輸尿管但不結紮輸尿管，術後每日予0.015ml/g生理鹽水腹腔注射一次，7天後處死，取左側腎臟；2)uuo組：常規麻醉消毒後沿腹正中線打開腹腔，暴露左側腎臟，游離輸尿管，於靠近左腎下極處及左腎下極膀胱間結紮輸尿管，然後於兩結紮點間剪斷輸尿管，術後每日予0.015ml/g生理鹽水腹腔注射一次，7天後處死，取左側腎臟；3)uuo+低劑量nctd組：常規麻醉消毒後沿腹正中線打開腹腔，暴露左側腎臟，游離輸尿管，於靠近左腎下極處及左腎下極至膀胱間結紮輸尿管，然後於兩結紮點間剪斷輸尿管，術後每日予0.075mg/kg去甲斑蝥素(濃度為10μg/ml)腹腔注射一次，7天後處死，取左側腎臟；4)uuo+高劑量nctd組：常規麻醉消毒後沿腹正中線打開腹腔，暴露左側腎臟，游離輸尿管，於靠近左腎下極處及左腎下極至膀胱間結紮輸尿管，然後於兩結紮點間剪斷輸尿管，術後每日予0.15mg/kg去甲斑蝥素(濃度為10μg/ml)腹腔注射一次，7天後處死，取左側腎臟。

然後將上述小鼠部分腎臟石蠟包埋，製成石蠟切片進行he、masson染色觀察腎組織形態學變化免疫組化檢測纖維化相關指標fn,col-i蛋白表達；其餘部分腎臟提取rna檢測fn,col-imrna表達。

2.3結果

2.3.1uuo術後小鼠腎臟腎小管擴張、上皮細胞脫落、腎間質炎細胞浸潤及纖維化較正常組明顯增多，予nctd後上述組織病理變化減輕，且高劑量組效果優於低劑量組(見附圖6、7)；

2.3.2uuo術後小鼠腎臟纖維化指標fn及col-i蛋白表達較對照組明顯升高，予nctd後fn及col-i蛋白表達較uuo組明顯降低，且高劑量組表達低於低劑量組(見附圖8、9)；

2.3.3uuo術後小鼠腎臟纖維化指標fn及col-imrna表達較對照組明顯升高，予nctd後fn及col-imrna表達較uuo組明顯降低(見附圖10)。

綜上所述，通過本發明的測試數據可以看出nctd治療能有效降低慢性腎小球腎炎患者的蛋白尿，小鼠實驗證明nctd能夠有效延緩腎臟纖維化，且無明顯肝腎毒性及骨髓抑制等嚴重不良反應，安全性較好，可以為臨床治療慢性腎小球疾病提供新的治療方法。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施例對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。