用於蛋白質捕獲的微流控晶片的製作方法

2023-05-01 04:23:36 1

本實用新型涉及一種與神經退行性疾病產生有關的蛋白質例如β-澱粉樣蛋白、tau蛋白、a-突觸核蛋白等的捕獲中採用的裝置。

背景技術：

世界人口在不斷的老齡化，據世界衛生組織統計，目前全球有3560萬痴呆患者，到2030年這一數字將增加一倍，2050年這一數字將增加至三倍以上。痴呆類型包括阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病等神經退行性疾病。普遍認為大量錯誤摺疊的蛋白質，如β-澱粉樣蛋白（amyloid beta）、tau蛋白、a-突觸核蛋白（α-synuclein）在細胞內聚集是神經退行性疾病產生的物質基礎。因此在開發針對這些疾病的治療藥物的過程中，需要有一種簡單易用的方法捕獲這些蛋白，並實時監控這些物質對於蛋白質聚集的影響。

水凝膠是由交聯的聚合物鏈形成的三維聚合物空間網狀結構。它不溶於水但親水性使其能夠容納大量的水。此外，可以通過調節聚合物濃度和前體的分子量來改變孔徑。其內部多孔結構可以將藥物分子包裹在聚合物網絡內。此外，這種結構也可以作為細胞封裝的支架：其納米級孔徑可以允許後續向細胞供應營養物，但同時防止較大物質如抗體或酶的滲透。此外，水凝膠的生物相容性使其能更好地模擬蛋白質摺疊的自然環境。

水凝膠通常分為物理凝膠和化學凝膠兩種。其中物理凝膠包括熱可逆凝膠，其在常溫下呈穩定的凝膠態，但加熱後可轉變為溶液。但是，其中溫度的改變可能影響蛋白質反應速度，破壞蛋白質結構。而化學凝膠使用較多的包括含有甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯基團的超支化聚丙三醇（hPG）和聚乙二醇（PEG）。通過將這些大分子單體與光引發劑一同暴露於紫外線下進行快速交聯，或利用加熱手段引發自由基進行聚合。綜上，無論是利用加熱或紫外線輻照的方法，均會影響蛋白質反應，從而使得檢測結果不準確。此外，現有常規的物理凝膠和化學凝膠捕獲方法捕獲的不僅有錯誤摺疊程度高的蛋白質寡聚物和纖維，也會捕獲錯誤摺疊程度低的小分子蛋白質和部分小尺寸單體，無法對錯誤摺疊程度高的蛋白質寡聚物和纖維進行針對性研究。

技術實現要素：

本實用新型所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種在蛋白質捕獲過程中採用的微流控晶片，基於該晶片並按照合適的工藝可以實現對錯誤摺疊程度高的蛋白質寡聚物和纖維進行針對性捕獲，以及同時可以獲得更準確的分析結果。

為解決以上技術問題，本實用新型採取的技術方案如下：

一種用於蛋白質捕獲的微流控晶片，包括晶片本體，微流控晶片還包括形成於晶片本體上且在一端部相交匯構成第一聚焦區的第一微通道、第二微通道和第三微通道，形成於晶片本體上且在一端部相交匯構成第二聚焦區的第四微通道、第五微通道和第六微通道，形成於晶片本體上的第七微通道，其中第四微通道的另一端與第一聚焦區連通，第七微通道的一端與第二聚焦區連通。

優選地，在各微通道的進口端設置有過濾器。

優選地，第一微通道、第二微通道和第三微通道分別用於通入超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液以及帶有標記的待捕獲蛋白肽溶液，第五微通道和第六微通道內用於通入油相物質。

優選地，晶片本體由聚二甲基矽氧烷構成。

優選地，微流控晶片還包括用於將各微通道封閉的表面平整的基底。

優選地，基底為顯微鏡用載玻片。

本實用新型微流控晶片可通過軟刻蝕法製作，具體步驟如下：

i)將設計好的第一微通道、第二微通道、第三微通道、第四微通道、第五微通道以及第六微通道印刷在醋酸膜上，並將醋酸膜放置於塗覆有光刻膠的矽晶片頂部，經過紫外光照射，得到晶片模板；

ii)將聚二甲基矽氧烷預聚物和其交聯劑灌注在所述晶片模板上，進行固化，將固化的聚二甲基矽氧烷模具剝離晶片模板，並對各所述微通道的出入口進行壓力穿孔，之後運用表面平整的基底對各微通道進行密封；

iii)將表面疏水劑注入各微孔通道並靜置，使得微通道表面疏水即得所述微流控晶片。

利用本實用新型進行蛋白質捕獲的一種方法如下：

（1）使超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液、帶有標記的待捕獲蛋白肽單體溶液分別注入微流控晶片的第一微通道、第二微通道和第三微通道中，三者在第一聚焦區混合得到混合液，所述混合液經第四微通道流至第二聚焦區並被從第五和第六微通道注入的油相物質包裹，獲得微液滴，所述微液滴內，所述超支化聚丙三醇和雙巰基聚乙二醇發生巰基-烯的點擊化學反應形成水凝膠，得到外層為油相內層為含有蛋白肽溶液的微凝膠；

（2）對所述微凝膠進行培養使其中的蛋白肽單體發生摺疊聚集，得到外層為油相內層含有不同摺疊程度的聚合蛋白的微凝膠；

（3）向經過步驟（2）的體系中加入脫乳化劑以破壞所述油相外層並進行清洗以除去所述微凝膠內小於所述微凝膠孔道的聚合蛋白或未聚合蛋白，即得捕獲了蛋白的水凝膠微籠，所述捕獲了蛋白的水凝膠微籠可用於後續的檢測分析。

根據本實用新型所述蛋白肽單體為人β澱粉樣蛋白1-40，人β澱粉樣蛋白1-42，tau蛋白或a-突觸核蛋白。

根據本實用新型所述油相物質優選為選自氟化液、礦物類油、植物油及脂肪酸中的一種或多種的組合。

根據本實用新型的一個具體且優選方面，所述脫乳化劑為全氟辛醇油，所述清洗採用pH 7-8的磷酸緩衝溶液，在離心旋杯柱中進行清洗。

根據本實用新型，聚乙二醇雙胺、超支化聚丙三醇的分子量可根據需要的微籠孔徑來設計。優選地，所述聚乙二醇雙胺的分子量為1-5 kDa，超支化聚丙三醇的分子量為10-30 kDa。更優選地，所述聚乙二醇雙胺的分子量為2-3 kDa，超支化聚丙三醇的分子量為15-25 kDa。

根據本實用新型，所述微凝膠的大小約為30-80微米，優選為40-60為微米，更優選為45-55微米。

由於以上技術方案的實施，本實用新型與現有技術相比具有如下優點：

本實用新型創新提出的微流控晶片，可以為採用巰基-烯點擊反應結合微流控技術捕獲蛋白質提供必要的裝置，其可獲得單分散性的水凝膠蛋白質捕獲微籠。

附圖說明

圖1為微流控晶片的結構示意圖，其中，1、晶片本體；2、第一微通道；3、第二微通道；4、第三微通道；5、第四微通道；6、第五微通道；7、第六微通道；8、過濾器；A、第一聚焦區；B、第二聚焦區；

圖2顯示了利用微流控晶片製備外層為油相內層為含有蛋白肽溶液的微凝膠的示意圖；

圖3為實施例製備的微液滴和微籠的光學顯微鏡圖；

圖4為實施例製備的微液滴和微籠經光學顯微鏡圖觀察並繪製的粒徑分布圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本實用新型做進一步詳細的說明，但本實用新型並不限於以下實施例。實施例中未註明的條件為常規實驗條件。

實施例1 微流控晶片的設計和製作

微流控晶片設計為如圖2所示，其包括晶片本體1，形成於晶片本體1上且在一端部相交匯構成第一聚焦區A的第一微通道2、第二微通道3和第三微通道4，形成於晶片本體1上且在一端部相交匯構成第二聚焦區B的第四微通道5、第五微通道6和第六微通道7，以及形成於晶片本體1上的第七微通道9，其中第四微通道5的另一端與第一聚焦區A連通，第七微通道9的一端與第二聚焦區B連通。在第一至第六微通道7的進口端分別設置有過濾器8。本例中，過濾器8的過濾精度為1微米。

以軟刻蝕法製作微流控晶片，具體步驟如下：

i)將設計好的各微通道印刷在醋酸膜上，並將醋酸膜放置於塗覆有光刻膠的矽晶片頂部，經過紫外光照射，即得晶片模板；

ii)將聚二甲基矽氧烷預聚物和其交聯劑灌注在晶片模板上，進行固化；將固化的聚二甲基矽氧烷模具剝離晶片模板，並對各所述微通道的出入口進行壓力穿孔，之後運用表面平整的基底（例如顯微鏡用載玻片）對各微通道進行密封；

iii)將表面疏水劑（如玻璃鍍膜劑Aquapel）注入微孔道並靜置5分鐘，使得通道表面疏水，最後加裝過濾器即得微流控晶片。

實施例2 微流控晶片應用於捕獲人β澱粉樣蛋白1-42蛋白

（1）製備外層為油相內層為含有蛋白肽溶液的微凝膠

將2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、聚乙二醇雙胺（2 kDa）以及超支化聚丙三醇（20 kDa）分別溶解在pH 7.4的Napi緩衝溶液中，獲得濃度分別為21g/L、300g/L和1000g/L的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、聚乙二醇雙胺以及超支化聚丙三醇的水溶液。

將2-亞氨基硫烷鹽酸鹽水溶液與聚乙二醇雙胺水溶液以體積比0.75:1混合，室溫下攪拌30分鐘，使二者反應轉化成雙巰基聚乙二醇，得到雙巰基聚乙二醇水溶液。

將超支化聚丙三醇水溶液及雙巰基聚乙二醇水溶液分別注入200微升固定針氣密注射器中。

用HiLyte Fluor™ 488對人β澱粉樣蛋白1-42肽單體側鏈的N-末端進行螢光標記，並溶解於1wt%的氨水中做為預備蛋白肽單體溶液。將預備蛋白肽單體溶液以pH 7.4的磷酸緩衝溶液稀釋成所需濃度（如5微米），得到HiLyte Fluor™ 488修飾的人β澱粉樣蛋白1-42的水溶液（以下簡稱蛋白肽溶液），注入注射器，並置於冰浴中。

參見圖2，取超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液、蛋白肽溶液分別以流速200微升/小時注入微流控晶片的第一微通道、第二微通道和第三微通道，三者在晶片的第一聚焦區混合得到混合液。混合液自第四微通道流入第二聚焦區，並在第二聚焦區被以流速2000微升/小時注入的氟化液HFE-7500包裹形成單分散微液滴(微液滴的光學顯微鏡圖參見圖3A，粒徑分布圖參見圖4A，微液滴大小為約48微米，且呈現非常好的單分散性)，微液滴從第七微通道流出收集。微液滴在晶片上的生成過程通過安裝在IX71倒置顯微鏡的單色幻影V7.2相機進行成像。然後利用LabVIEW 8.2計算液滴的生成頻率，約為1.2千赫茲。在這過程中， 超支化聚丙三醇和雙巰基聚乙二醇在微液滴中發生巰基-烯的點擊化學反應，並快速形成水凝膠。

（2）培養

將步驟（1）製備得到的外層為油相內層為含有蛋白肽溶液的微凝膠置於37℃下培養一定時間，使蛋白肽摺疊聚集。當培養結束，冰浴冷卻60秒淬滅反應。

（3）破壞微凝膠的油相外層並進行清洗

向經過步驟（2）的體系中加入全氟辛醇油，打開微液滴的油相外層，並用pH 7.4的磷酸緩衝溶液於離心旋杯柱（0.45微米孔徑）中清洗3次，並保存在pH7.4的磷酸緩衝溶液中，得到內含高程度聚合蛋白的水凝膠微籠，(水凝膠微籠的光學顯微鏡圖參見圖3B，對應的粒徑分布圖參見圖4B，微籠大小為約47微米，且呈現非常好的單分散性)。

上述實施例只為說明本實用新型的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人士能夠了解本實用新型的內容並據以實施，並不能以此限制本實用新型的保護範圍。凡根據本實用新型精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本實用新型的保護範圍之內。