檢測h1和h3亞型流感病毒的核苷酸序列和試劑盒的製作方法
2023-05-01 09:11:36
專利名稱：檢測h1和h3亞型流感病毒的核苷酸序列和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢測Hl和H3亞型流感病毒的核苷酸序列和試劑盒，尤指快速的基於 LNA和MGB修飾的短探針單重和雙重螢光RT-PCR檢測核苷酸序列和試劑盒，不僅適用於不 同動物組織樣本中Hl和H3亞型流感病毒的準確檢測，還可適用於不同動物活體樣本(主 要為拭子樣品)H1和H3亞型流感病毒的檢測，可用於動物Hl和H3亞型流感病毒的篩查， 出入境檢疫等，屬於檢驗檢疫領域。
背景技術：
自1934年首次分離出甲型流感病毒以來，由Hl或H3亞型的流感病毒已引起多次 世界性的人和動物的大流行以及大流行間期的小流行。Hl和H3亞型流感病毒感染宿主範 圍廣，主要感染宿主包括人，禽，豬、馬以及其他多種動物。而且其中一些毒株具有在多種動 物間傳播的能力，例如引起人類歷史上多起大流感流感的病原均可在人、豬之間傳播。從 1989年和1990年發生於我國的馬流感疫情中分離出的H3N8亞型的馬流感毒株(A/馬/吉 林/1/89)，該毒株的6個基因片段為禽源片段。2009年全球大流行的甲型Him流感病毒 是一個新型流感變異株，目前研究已經證明該毒株可自然感染豬、犬貓等哺乳動物。目前採用TaqMan探針螢光RT-PCR對流感病毒Hl和H3亞型進行快速分型檢測已 經成為目前流感病毒快速檢測篩查的首選方法。但TaqMan方法一般要求探針Tm值明顯高 於引物Tm值，因此在設計引物探針時探針序列往往較長。但對於流感病毒，不同感染宿主 的病毒序列之間以及新型變異毒株與經典毒株的HA序列存在很大差異，這使得很多採用 長探針的Hl和H3核酸檢測方法在檢測不同來源的Hl和H3亞型病毒方面受到局限。採用短探針可有效解決毒株變異導致的Hl和H3亞型流感病毒分型方法通用性較 差的問題。但採用短探針必須在不改變序列的情況下提高探針的Tm值。近期，鎖核酸 (locked nucleic acid，LNA)作為一種新穎的核苷酸衍生物在生物學研究領域引起了 人們的廣泛關注，它是一種特殊的雙環狀核苷酸衍生物，結構中含有一個或多個2' -0， 4' -C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體，核糖的2' -0位和4' -C位通過不同的縮水 作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，並連接成環形，這個環形橋鎖定了呋喃糖 C3' _內型的N構型，降低了核糖結構的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結構的穩定性。對 DNA、RNA有很好的識別能力和強大的親和力。LNA和DNA、RNA互補的雙鏈有很強的熱穩定 性(ΔΤπι = 3 8°C )，具有抗3'脫氧核苷酸酶降解的穩定性，合成方法相對簡單，部分或 完全修飾的LNA寡核酸鏈可用氨基磷酸法在DNA自動合成儀上合成。在通過對不同來源的Hl亞型流感病毒的HA基因進行序列比對的基礎上，發現Hl 亞型流感病毒HA基因尾部存在12nt的保守區，適合通過LNA修飾後作為短探針用於螢光 RT-PCR 檢測。但在對H3亞型流感病毒的HA基因進行序列比對時，發現可以利用14nt簡併短探 針建立螢光RT-PCR方法，由於存在兼併鹼基，因此採用在探針3'修飾MGB(Minor Groove
4Binder)來提高探針的Tm值。本發明首次將單重和雙重基於LNA和MGB的短探針螢光RT-PCR技術應用於Hl和 H3亞型流感病毒檢測，提供了針對Hl和H3亞型流感病毒的基於LNA和MGB的短探針、簡併 引物和試劑盒。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的檢測針對Hl和H3亞型流 感病毒核苷酸序列，包括引物序列和基於LNA和MGB的短探針序列。本發明的另一個目的是提供快速、準確、使用方便的檢測Hl和H3亞型流感病毒的 單重和雙重檢測試劑盒。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案選擇Hl和H3亞型流感病毒HA基因編碼區特定序列作為靶區域，在多重序列比對 的基礎上，進行引物和探針設計。引物長度為20個鹼基左右，GC含量為50%-60%，引物 內無二級結構和重複性，引物間和引物內無互補序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小於 5°C。探針的長度在12 14個鹼基左右，採用LNA或MGB修飾，並標記螢光基團。1組檢測流感病毒Hl亞型的核苷酸序列，如下1)5，-CAG ATT YTG GCG ATC TAY TC-3' (SEQ ID NO 1)2)5，-GAC CCA TTA GAR CAC ATC CAG—3，(SEQ ID NO 2)Y代表嘧啶，此處為T或C ;R代表嘌呤，此處為A或G ；3)5，-[HEX]-CCCC AG GG AG AC-[TAMRA]-3，(SEQ ID NO 3)1組檢測流感病毒H3亞型的核苷酸序列，如下4)5，-TGG ATT TCM TTY GCC ATA TCA T_3' (SEQ ID N 0 4)5)5，-GCA AAT GTT GCA YCT RAT RTT G_3，(SEQ ID NO 5)6)5，-[FAM] -TGG CAR GCC CAC AT_[MGB]_3，(SEQ ID NO 6)Y代表嘧啶，此處為T或C ;R代表嘌呤，此處為A或G ;M此處為A或C ；其中序列1)和2)分別為檢測Hl亞型流感病毒HA基因的正義引物和反義引物， 序列3)為檢測Hl亞型流感病毒HA基因的LNA修飾的螢光短探針，用斜體表示的鹼基用 LNA進行修飾，即第5、7、9、11位的鹼基用LNA進行修飾，探針的5』端標記報告螢光基團 HEX(5-hexachloro-螢光素)，3，端標記淬滅螢光基團TAMRA ；序列4)和5)分別為檢測H3 亞型流感病毒HA基因的正義引物和反義引物，序列6)為檢測H3亞型流感病毒HA基因的 MGB修飾的螢光短探針，探針的5』端標記報告螢光基團FAM(6-carb0Xy-螢光素)，3』端標 記MGB基團。我們採用TaqMan螢光PCR檢測技術建立了 Hl和H3亞型流感病毒單重和雙重檢 測方法，對反應的各種條件進行了優化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+使用濃度的優化，引 物探針濃度的優化，得到以下試劑盒。檢測Hl和H3亞型流感病毒單重和雙重檢測試劑盒，由以下組分組成1)裂解液購自INVITR0GEN公司，按15ml/瓶進行分裝，2瓶/盒。2) RT-PCR反應液，表1為Hl單重反應液配方；表2為H3單重反應液配方；表3為檢測Hl和H3的雙重反應液配方。
表IHl單重反應液配方
權利要求
一組檢測H1和H3亞型流感病毒的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQID NO1至SEQ ID NO6，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別為檢測H1亞型流感病毒HA基因的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO3為檢測H1亞型流感病毒HA基因的LNA修飾的螢光探針，序列SEQ ID NO4和SEQ ID NO5分別為檢測H3亞型流感病毒HA基因的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO6為檢測H3亞型流感病毒HA基因的螢光探針。
2.根據權利要求1所述的檢測Hl和H3亞型流感病毒的核苷酸序列，其特徵在於所 述探針序列SEQ ID NO 3的5，端標記報告螢光基團HEX，3，端標記淬滅螢光基團TAMRA， 第5、7、9、11位的鹼基用LNA進行修飾。
3.根據權利要求1所述的檢測Hl和H3亞型流感病毒的核苷酸序列，其特徵在於所 述探針序列SEQ ID NO 6的5』端標記報告螢光基團FAM，3』端標記MGB基團。
4.一種檢測Hl和H3亞型流感病毒的試劑盒，由以下組分組成1)裂解液2)Hl亞型單重螢光RT-PCR反應液，包括PCR緩衝液、RT緩衝液、MgCL2、dNTP、Hl正義 引物、Hl反義引物和Hl螢光探針3)H3亞型單重螢光RT-PCR反應液，包括RT緩衝液、MgCL2,dNTP、H3正義引物、H3反 義引物和H3螢光探針4)Hl和H3雙重螢光RT-PCR反應液，包括RT緩衝液、MgCL2、dNTP、Hl正義引物、Hl反 義引物、Hl螢光探針，H3正義引物、H3反義引物、H3螢光探針5)RT-PCR酶顆粒6)Taq DNA聚合酶7)DEPC水8)陰性對照流感病毒陰性組織樣品，用0.01mol/L pH7. 2PBS緩衝鹽水製成20%懸 液，70°C作用1小時；9)陽性對照為體外轉錄的非感染性RNA片段，其對應的DNA序列為序列表SEQID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列；其中，Hl正義引物為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，Hl反義引物為序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，Hl螢光探針為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5』 端標記報告螢光基團HEX，3』端標記淬滅螢光基團TAMRA，第5、7、9、11位的鹼基用LNA進行 修飾，H3正義引物為序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，H3反義引物為序列表SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列，H3螢光探針為序列表SEQID No. 6所示的核苷酸序列，其5』端標 記報告螢光基團FAM，3』端標記MGB基團。
5.根據權利要求4所述的檢測Hl和H3亞型流感病毒的試劑盒，其特徵在於，所述Hl 亞型單重螢光RT-PCR反應液包括0. 5 XPCR緩衝液、0. 5 X RT緩衝液、1. 5mmol/L MgCL2, 0. 2mmol/L dNTP、0. 3 μ mol/L Hl 正義引物、0. 3 μ mol/L Hl 反義引物和 0. 3 μ mol/L Hl 熒 光探針；所述H3亞型單重螢光RT-PCR反應液包括1 XRT緩衝液、4mmol/L MgCL2、0. 05mmol/L dNTP、0. 4ymol/L H3 正義引物、0. 4 μ mol/L Η3 反義引物和 0.2 μ mol/L H3 螢光探針；所述Hl和H3雙重螢光RT-PCR反應液，包括1 XRT緩衝液、4mmol/LMgCL2、0. 05mmol/ L dNTP,0. 4 μ mol/L Hl 正義引物、0. 4 μ mol/L Hl 反義引物、 . 3 μ mol/L Hl 螢光探針、·0. 4ymol/L H3正義引物、0. 4 μ mol/L H3反義引物、0. 3 μ mol/L H3螢光探針。
全文摘要
本發明公開了一組檢測H1和H3亞型流感病毒的核苷酸序列和試劑盒。該檢測H1和H3亞型流感病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO6，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分別為檢測H1亞型流感病毒HA基因的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO3為檢測H1亞型流感病毒HA基因的LNA修飾的螢光探針，序列SEQ ID NO4和SEQ ID NO5分別為檢測H3亞型流感病毒HA基因的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO6為檢測H3亞型流感病毒HA基因的螢光探針。本發明進一步提供了含有上述引物和探針的檢測H1和H3亞型流感病毒的試劑盒。本發明所述的試劑盒具有快速、靈敏、特異、通用性好、重複性好及不易汙染的特點。
文檔編號G01N21/64GK101962690SQ201010526978
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月1日 優先權日2010年11月1日
發明者喬彩霞, 劉環, 張偉, 張利峰, 張向東, 張鶴曉, 柏亞鐸, 汪琳, 蒲靜, 谷強, 高志強 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局