鮑魚殼抗氧化性水溶性物質提取方法

2023-05-01 12:54:16 1

專利名稱：鮑魚殼抗氧化性水溶性物質提取方法
技術領域：
本發明屬於水溶性多糖提取及鮑魚殼廢物利用技術領域，更具體涉及一種鮑魚殼
抗氧化性水溶性物質提取方法。
背景技術：
從目前研究結果來看，氧自由基不僅與衰老有關而且與人類大部分常見疾病有 關，從人類死亡率最高的心腦血管疾病到癌症以及愛滋病，無一不和自由基有密切關係。通 過防止自由基產生以及清除已有自由基達到防病治病的目的。現在人工合成的抗氧化劑， 具有一定毒性和誘變性，重複使用受到很大的限制，所以國內外研究人員正在尋找安全，有 效地天然抗氧化劑。 鮑魚屬於軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、鮑螺科(Haliotidae)、 鮑屬(Haliotis)。鮑魚殼有機基質分為水溶性有機基質(WSM)和非水溶性有機基質(water insoluble matrix, WISM);—般對於鮑魚殼的處理為研磨後藥用或直接丟棄，利用率低下， 未見鮑魚殼中多糖成分提取以及抗氧化性分析的報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種廢棄鮑魚殼具有抗氧化性水溶性多糖的提取方法；解決 現有技術中對於鮑魚殼的處理一般為研磨後藥用或直接丟棄，利用率低下的問題，提取方 法簡單，該提取物具有天然抗氧化活性，可以製成抗氧化劑；鮑魚殼資源豐富，提取容易，具 有開發潛力。 本發明提取方法的步驟包括所述提取方法的步驟包括鮑魚殼經過溶解、抽濾 去沉澱後加入有機溶劑沉澱、離心分離、重溶、三氯乙酸法脫蛋白、膜分離去鹽與色素得到 抗氧化水溶性物質，即水溶性多糖。 本發明的優點為提取物為多糖，每lkg鮑魚殼粉得率最終獲得精多糖6. 67mg。本 提取物中的活性多糖是由甘露糖；核糖；鼠李糖；葡萄糖；半乳糖、半乳糖醛酸、巖藻糖或阿 拉伯糖等中的一種或多種的雜多糖，具有較高的清除超氧自由基的活性，可以製成抗氧化 劑，鮑魚殼資源豐富，提取容易，具有開發潛力；也對鮑魚殼資源充分利用，變廢為寶，成本 低廉。
具體實施例方式
鮑魚殼原料所有種類鮑魚殼。
提取方法的具體步驟包括 (1)將乾燥的鮑魚殼粉碎，加水浸泡，並於6(TC -85°〇下充分攪拌提取，攪拌提取 時間為1-5小時，抽濾去殘渣；提取2-3次，將上清液合併，凍幹為粉末，該粉末為鮑魚殼水 溶性基質凍乾粉； (2)取步驟(1)得到的鮑魚殼可溶性基質凍乾粉溶於適量水中，製成鮑魚殼水溶性基質水溶液，加入三倍體積的無水乙醇，保持溫度為4t:的條件下靜置1-12小時，離心分
離收集沉澱，離心分離按照10000rpm離心10min ;對上清重複以上離心分離步驟2_3次， 將沉澱匯總後用無水乙醇清洗，用蒸餾水溶解至完全重溶得到鮑魚殼水溶性多糖粗提物；
(3)取步驟(2)中獲得重溶的粗多糖提取物利用三氯乙酸法脫蛋白，每10ml重溶 的粗多糖提取物加入(體積濃度)5% _15%三氯乙酸溶液5!111，搖勻於41:的條件下靜置 1-12小時，10000rpm離心10min，上清液即為去蛋白溶液; (4)取步驟(3)中獲得去蛋白水溶液用1KD膜流水透析24-72小時除鹽和色素後，
於-60°C -S(TC真空冷凍乾燥得到抗氧化水溶性物質，即水溶性多糖。 其中，步驟(1)中的鮑魚殼用粉碎機粉碎成60-120目的粉末。 步驟(1)中的加水浸泡時鮑魚殼粉末與水的體積比為1:2-1: 8。 步驟(2)中的鮑魚殼可溶性基質凍乾粉與溶解用水的用量比例為每lOmg乾粉約
溶於lml-5ml水中。 多糖含量的測定以苯酚-硫酸比色法 (1)5%苯酚溶液配製準確稱取5g苯酚，於100ml容量瓶中用蒸餾水定容。
(2)標準曲線的制定以105t:乾燥至恆重的葡萄糖為標準品，精密稱量，用蒸 餾水溶解定容，使其濃度為0. lmg/mL。將標準溶液分別稀釋成0. 01、0. 02、0. 04、0. 06、 0. 08mg/ml的溶液。分別取各濃度標準溶液0. 5ml置於具塞試管中，加入加入5%苯酚試液 0. 5ml，搖勻後迅速加入濃硫酸2. 5mL，搖勻後靜置至室溫，於490nm處測定吸光度；另取蒸 餾水O. 5mL，加苯酚和硫酸，同上操作為空白對照。以葡萄糖的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐 標，繪製標準曲線。回歸方程為Y = 7. 5686X-0. 0031(R2 = 0.9994)， Y為吸光度，X為多 糖濃度。 (3)樣品溶液中多糖含量測定取0. 5ml樣品溶液置於試管中，加入5%苯酚試液 0. 5ml，搖勻後，迅速加入濃硫酸2. 5mL，搖勻後靜置至室溫，於490nm處測定吸光度(Y)代入 回歸方程得到X，即為樣品溶液中多糖的濃度。
反相高效液相色譜(RP-HPLC)單糖組成分析 (1)對照品溶液精密稱取8(TC乾燥至恆重的甘露糖，核糖，鼠李糖，葡萄糖醛酸、 葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖醛酸對照品各2mg，置同一離心管中，加水 lml溶解並定容，精密量取25iU置5ml離心管中，加0. 6mol/L氫氧化鈉溶液25 yl，混 勻，再加0. 4mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-甲醇溶液50 y 1，混勻，7(TC水浴 100min ;室溫冷卻lOmin後加O. 3mol/L鹽酸50 yl中和，加水600 yl，混勻，加氯仿lml，渦 旋3min，離心(8000Xg)5min，取水相。自上述"加氯仿lml"起重複操作3次，水相即為對 照品溶液。 (2)供試品溶液精密稱取PS-1適量，加水稀釋製成約25mg/ml的溶液，精密量取 100iil置安瓿中，加2mol/L三氟乙酸150iil，封口，ll(TC水解2h，冷卻至室溫。打開安瓿， 加甲醇200 ii 1，用氮氣吹乾，重複操作3次。剩餘物中加水50 ii 1溶解，搖勻，量取25 iU， 按對照品溶液配製方法，自上述"置5ml離心管中，加0. 6mol/L氫氧化鈉溶液25 y l"起操 作，所得水相即為供試樣品溶液，經過0. 2 ii m濾膜過濾後進行色譜分析。
(3)色譜條件色譜柱C18柱(4. 6mmX 250mm);流動相為0. lmol/L磷酸鹽緩衝液 (p朋.7)-乙月青(83 : 17);流速lml/min ;檢測波長254nm ;柱溫30°C ;進樣量20iU，通過
4與標準品比對處峰時間來判定成分，通過比對峰面積來確定含量。 以下是本發明的實施例，進一步說明本發明，但是本發明不僅限於此。 實施例1 鮑魚殼水溶性基質提取物的製備與純化 閩產皺紋盤鮑殼衝洗乾淨，自然晾乾後，粉碎機粉碎成60-120目的粉末。稱取3kg 粉末放入6L蒸餾水中，6(TC攪拌溶解2h，取出混合液抽濾，殘渣再用水提取兩次後合併到 混合液裡，去掉沉澱後的上清液凍幹成粉末，該凍乾粉即為鮑魚殼水溶性基質，共為0. 3g。
每lg凍乾粉溶於50ml水中，加入三倍體積的無水乙醇，4t:保溫12小時，此後在 4°C ， 10000rpm下離心分離10分鐘，收集沉澱，對上清再醇沉1次，將兩次沉澱合併後用無水 乙醇清洗，此後用100mL蒸餾水重溶。
對重溶液脫蛋白5%三氯乙酸法工作液水溶液(v : v) = i : 2，混勻後於4t:
保溫12小時，10000rpm離心10min，上清液即為去蛋白溶液；用1KD膜流水透析24小時除 鹽和色素後於-60°C —8(TC真空冷凍乾燥即得到水溶性多糖，為20mg ;其中多糖的含量為 7mg(約為35% )。 該水溶性多糖為淡黃色粉末，水溶性較好，不溶於乙醇，乙醚等。
實施例2 鮑魚殼水溶性基質提取物的製備與純化 閩產皺紋盤鮑殼衝洗乾淨，自然晾乾後，粉碎機粉碎成60-120目的粉末。稱取3kg 粉末放入18L蒸餾水中，8(TC攪拌溶解3h，取出混合液抽濾，殘渣再用水提取兩次後合併到 混合液裡，去掉沉澱後的上清液凍幹成粉末，該凍乾粉即為鮑魚殼水溶性基質，共0. 9g。
每lg凍乾粉溶於50ml水中，加入三倍體積的無水乙醇，4t:保溫12小時，此後在 4°C ， 10000rpm下離心分離10分鐘，收集沉澱，對上清再醇沉1次，將兩次沉澱合併後用無水 乙醇清洗，此後用100mL蒸餾水重溶。
對重溶液脫蛋白10%三氯乙酸法工作液水溶液(v : v) = i : 2，混勻後於
4t:保溫12小時，10000rpm離心10min，上清液即為去蛋白溶液；用1KD膜流水透析24小時 除鹽和色素後於-6(TC—8(TC真空冷凍乾燥即得到水溶性多糖，共60mg其中多糖的含量為 20mg(約為33. 3% )。 該水溶性多糖為淡黃色粉末，水溶性較好，不溶於乙醇，乙醚等。
實施例3 鮑魚殼水溶性基質提取物的製備與純化 閩產皺紋盤鮑殼衝洗乾淨，自然晾乾後，粉碎機粉碎成60-120目的粉末。稱取3kg 粉末放入24L蒸餾水中，7(TC攪拌溶解4h，取出混合液抽濾，殘渣再用水提取兩次後合併到 混合液裡，去掉沉澱後的上清液凍幹成粉末，該凍乾粉即為鮑魚殼水溶性基質，共0. 8g。
每lg凍乾粉溶於50ml水中，加入三倍體積的無水乙醇，4t:保溫12小時，此後在 4°C ， 10000rpm下離心分離10分鐘，收集沉澱，對上清再醇沉1次，將兩次沉澱合併後用無水 乙醇清洗，此後用100mL蒸餾水重溶。
對重溶液脫蛋白15%三氯乙酸法工作液水溶液(v : v) = i : 2，混勻後於4t:
保溫12小時，10000rpm離心10min，上清液即為去蛋白溶液；用1KD膜流水透析24小時除 鹽和色素後於-60°C —8(TC真空冷凍乾燥即得到水溶性多糖，為52mg ;其中多糖的含量為
518mg(約為34. 6% )。 該水溶性粗多糖為淡黃色粉末，水溶性較好，不溶於乙醇，乙醚等。 抗氧化活性測定 02— 體系中抗氧化活性測定 試管中依次加入1. 0ml 75,1/L磷酸鹽緩衝液(pH = 7. 8)，待測樣品0. 2ml， 0. lmol/L鹽酸羥胺溶液0. lml， 75mmol/L黃嘌呤氫氧化鈉溶液0. lml， 0. 1U/ml黃嘌呤氧化 酶0. lml，搖勻後置於37。C水浴30min，加入2. 0mL顯色劑，靜置10min於530nm處測定吸光 度Ai ;0. 2ml蒸餾水代替待測樣品，其它不變，測得吸光度Ao。以2. 3ml雙蒸水代替黃嘌呤
氧化酶和顯色劑，其它不變，用以調零。清除率計算根據公式
(乂o—乂0
抑制率(％) = 乂0 式中Ai為加入抗氧化劑後的吸光度；Ao為未加入抗氧化劑的吸光度。 研究表明經粗提後鮑魚殼多糖的抗氧化性較鮑魚殼可溶性基質有顯著提高，見表
1中，提取多糖具有較強的超氧自由基清除活性。提取多糖超氧自由基清除能力較強；具體
結果見表2中。 表1粗提後鮑魚殼WSM抗氧化性結果數據表
A53002- /%
WSM濃縮液0. 11675. 77
WSM —次醇沉上清0. 33230. 33
WSM —次醇沉粗多糖0. 08781. 74 說明上清和多糖都重溶到所取濃縮液的體積。 表2鮑魚殼WSM多糖提取物與VC抗氧化性比較結果數據表
樣品/mg/ml02— /%IC50約為
多糖0.0135.100.15mg/ml
0.141.90
1.092. 24
Vc0.0118. 350. 045mg/ml
0.175. 02
1.095. 22 說明多糖濃度由苯酚_硫酸法測定後調整獲得。
權利要求
一種鮑魚殼抗氧化性水溶性物質提取方法，其特徵在於所述提取方法的步驟包括鮑魚殼經過溶解、抽濾去沉澱後加入有機溶劑沉澱、離心分離、重溶、三氯乙酸法脫蛋白、膜分離去鹽與色素得到抗氧化水溶性物質，即水溶性多糖。
2. 根據權利要求1所述的鮑魚殼抗氧化性水溶性物質提取方法，其特徵在於所述提 取方法的具體步驟包括(1) 將乾燥的鮑魚殼粉碎，加水浸泡，並於6(TC _851:下充分攪拌提取，攪拌提取時間 為1-5小時，抽濾去殘渣；提取2-3次，將上清液合併，凍幹為粉末，該粉末為鮑魚殼水溶性 基質凍乾粉；(2) 取步驟(1)得到的鮑魚殼可溶性基質凍乾粉溶於適量水中，製成鮑魚殼水溶性基 質水溶液，加入三倍體積的無水乙醇，保持溫度為4t:的條件下靜置1-12小時，離心分離收 集沉澱，離心分離按照10000 rpm離心10min ;對上清重複以上離心分離步驟2-3次，將沉 澱匯總後用無水乙醇清洗，用蒸餾水溶解至完全重溶得到鮑魚殼水溶性多糖粗提物；(3) 取步驟(2)中獲得重溶的粗多糖提取物利用三氯乙酸法脫蛋白，每10ml重溶的粗 多糖提取物加入體積濃度為5% _15%三氯乙酸溶液5!111，搖勻於41:的條件下靜置1-12小 時，10000 rpm離心10min，上清液即為去蛋白溶液;(4) 取步驟(3)中獲得去蛋白水溶液用1KD膜流水透析24-72小時除鹽和色素後， 於-6(TC -S(TC真空冷凍乾燥得到抗氧化水溶性物質，即水溶性多糖。
3. 根據權利要求2所述的鮑魚殼抗氧化性水溶性多糖提取方法，其特徵在於所述步 驟(1)中的鮑魚殼用粉碎機粉碎成60-120目的粉末。
4. 根據權利要求2所述的鮑魚殼抗氧化性水溶性多糖提取方法，其特徵在於所述步 驟(1)中的加水浸泡時鮑魚殼粉末與水的體積比為1:2-1: 8。
5. 根據權利要求2所述的鮑魚殼抗氧化性水溶性多糖提取方法，其特徵在於所述步 驟(2)中的鮑魚殼可溶性基質凍乾粉與溶解用水的用量比例為每10mg乾粉溶於lml-5ml 水中。
6. 根據權利要求1或2所述的鮑魚殼抗氧化性水溶性物質提取方法，其特徵在於所 述抗氧化水溶性物質，即水溶性多糖為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、 巖藻糖或阿拉伯糖中的一種或多種的混合物。
全文摘要
本發明提供一種鮑魚殼抗氧化性水溶性多糖提取方法；屬於解決水溶性多糖提取和鮑魚殼廢物利用技術領域；解決現有技術中對於鮑魚殼的處理一般為研磨後藥用或直接丟棄，利用率低下的問題；提取方法的步驟包括所述提取方法的步驟包括鮑魚殼經過溶解、抽濾去沉澱後加入有機溶劑沉澱、離心分離、重溶、三氯乙酸法脫蛋白、膜分離去鹽與色素得到水溶性多糖，可以製成抗氧化劑；鮑魚殼資源豐富，提取容易，具有開發潛力。
文檔編號C08B37/00GK101724092SQ20091031210
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月23日 優先權日2009年12月23日
發明者伍久林, 張其清, 梁紅寶, 郭葳 申請人:福州大學