一種豬細小病毒滅活疫苗的製備方法
2023-04-30 22:43:26 1
專利名稱：一種豬細小病毒滅活疫苗的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種豬細小病毒滅活疫苗的製備方法，尤其是一種豬細小病毒滅活疫苗的純化、濃縮工藝的設計方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
豬細小病毒(PPV)能夠引起母豬繁殖障礙疾病，導致母豬產死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母豬不育等。目前該病已呈世界性分布，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。德國學者Mayr首次最早發現了 PPV，我國學者潘雪珠等1983年成功實現該病毒的分離。目前PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、產生抗體時間長、不需要低溫保存的優點；弱毒疫苗免疫效力較強、產生抗體快、用量少、成本低，但安全性較差；基因工程亞單位疫苗免疫源性較好，但成本和技術要求都比較高；基因工程活病毒載體疫苗可以同時預防兩種病或多種病的、能夠誘導較強的免疫反應，但生產技術複雜、成本較高；基因疫苗生產工藝簡單、免疫劑量小、成本低廉、可構建多基因或多價疫苗，但其安全性受到廣泛關注。由於滅活疫苗的存在上述優點，因此該方法得到了廣泛的應用。我國均普遍使用豬細小病毒滅活疫苗,使用的主要滅活劑有福馬林、￠-丙內酯(^-PL) ,N-乙醯乙烯亞胺(AEI)、二乙烯亞胺(BEI)等。有試驗表明，豬細小病毒用福馬林滅活後製成疫苗的保護效果不如用N-乙醯乙烯亞胺滅活後製成疫苗的保護效果好；用^-丙內酯滅活疫苗的保護力較好。免疫佐劑也是影響豬細小病毒滅活疫苗免疫效果的重要因素，但幾種佐劑的混合物，如油佐劑、SDS、L-121、氫氧化鋁和油乳劑的混合物以及SDS、氫氧化鋁的混合物作佐劑的疫苗產生的抗體滴度均較低。目前經常採用的佐劑是蜂膠、氫氧化鋁和油水乳劑。豬細小病毒滅活多聯疫苗的使用較為廣泛，主要有豬細小病毒-豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒-乙腦病毒等二聯苗，因為除了豬細小病毒外，豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸症候群障礙病毒(PRRSV)、乙腦病毒(JEV)等均能引起母豬的繁殖障礙，而且多聯苗的使用可以簡化免疫程序，降低臨床應激反應，適合規模化養豬。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種解決豬細小病毒的濃縮、純化及滅活的工藝設計問題；提供一種安全可行的疫苗生產方法，使該疫苗的生產能夠不再依賴傳統工藝從而生產出高滴度的毒液，提高抗原含量，滿足免疫生產要求。本發明解決上述技術問題的技術方案如下一種豬細小病毒滅活疫苗的製備方法，包括以下步驟(I)將豬細小病毒液從原料罐中放入微濾系統進行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述滲透液中不含有細菌及細胞碎片雜質，所述濃縮液返回原料罐，當豬細小病毒液固含量大於或等於lg/L後，將豬細小病毒液排出；(2)將通過步驟(I)處理的滲透液，進行超濾處理，進一步濃縮毒液，直到病毒血凝價達到到28 213時停止濃縮，得到濃縮液；(3)將步驟(2)處理完的濃縮液用微濾系統再過濾，處理完後得到血凝價為28 213的細小病毒毒液；(4)將步驟(3)得到的細小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活後病毒液製備成疫苗產品。血凝實驗(HA)是指病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細胞發生凝集，這種凝集紅細胞的現象成為血凝，也稱為直接雪凝反應，利用這種特性設計的實驗稱血凝實驗，病毒血凝價是指血凝試驗的檢測結果。固含量，又叫「不揮發份含量」，是乳液或塗料在規定條件下烘乾後剩餘部分佔總 量的質量百分數。在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。進一步，所述微濾膜孔徑為IOOnm 220nm，超濾膜孔徑為5KD 200KD。進一步，所述的微濾和超濾膜分離材料可以是有機膜材料也可以是無機膜材料。主要包括陶瓷材料、金屬材料及有機高分子材料。其中有機高分子主要有醋酸纖維素、磺化聚碸、磺化聚醚碸、聚醯胺、聚乙烯醇或聚哌嗪醯胺；無機氧化物材料主要有氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯以及氧化鉿。進一步，所述微濾及超濾的操作條件為溫度5 50°C，壓力0. 01 0. 5MPa，膜面流速I 5m/ s。進一步，在步驟(4)中，所述細小病毒毒液的滅活包括收集步驟(3)得到的細小病毒毒液，採用二乙烯亞胺作為滅活劑，滅活劑濃度為0. I % I %，滅活溫度為25 38°C，滅活時間為24 120小時。進一步，在步驟(4)中，所述將濃縮及滅活後病毒液製備成疫苗產品的具體步驟為(I)油相製備取注射用白油90 98份，加硬脂酸鋁I 3份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-804 8份，混合後，在壓強為0. IMP 0. 15MP、溫度為115 130°C的條件下，滅菌備用；(2)水相製備取濃縮後滅活的病毒液90 98份，加入滅菌的吐溫-802 8份，充分搖動，直到吐溫-80完全溶解；(3)乳化取油相2 4份置於乳化罐中，攪拌的同時緩慢加入水相I份，持續攪拌30 70分鐘，攪拌速度600 1200r/min，後通過剪切機2 3次剪切，剪切速度3000 5000r/min,即製成豬細小病毒滅活疫苗。本發明的有益效果是本發明的技術方案用於豬細小病毒滅活疫苗的純化、濃縮工藝設計，提高了疫苗的抗原含量、去除了雜蛋白，改善了疫苗的免疫效果，同時減少了注射疫苗時動物的應激反應；使動物在獲得疫病保護的同時不影響相關生產性能，增加了養殖戶的收益，具有廣泛的社會效益和經濟效益。
具體實施例方式以下對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。
實施例I本實施案例說明豬細 小病毒毒液製備的方法I、細胞製備從液氮罐中取出細胞置37°C水浴中快速融化，將細胞移入裝有10%胎牛血清細胞生長液的細胞瓶中，37°C培養，當長成良好單層時用胰酶消化液消化細胞，按I 2傳代逐級擴大。將擴大培養的種子細胞接種到15000ml毫升轉瓶中，每瓶加IOOOml含10%新生牛血清的細胞生長液，37°C培養，轉瓶速度為6 12轉/小時，待長成良好單層後，用胰酶消化液消化細胞，按I : 3分瓶傳代。2、病毒繁殖取F13代BJ-2株PPV生產種毒，按2%接種量接種於生長良好的ST細胞，同時加入含2%胎牛血清的細胞維持液，37°C培養，每天觀察細胞病變(CPE)情況。3、收穫與保存接毒後每天觀察細胞生長和病變(CPE)的情況，並做好詳細記錄。培養至72 96小時，當CPE達到70-80%時收穫培養物，反覆凍融2 3次，_20°C以下保存備用，時間不超過6個月。實施例2本實施案例說明豬細小病毒純化、濃縮的方法取血凝價為28的豬細小病毒液20000毫升，進行純化、濃縮，測定血凝價，比較其濃縮前後的差異。具體步驟如下(I)將原料液加入孔徑為0. 22微米的微濾系統進行過濾，濃縮液返回原料罐，大約10分鐘後將原料液排出；收集滲透壓，此時觀察滲透液、清澈、明亮，既已除去細胞碎片等雜質，進入下一步超濾濃縮步驟。(2)細小病毒毒液的超濾濃縮將已預處理的滲透液，用lm2的截留分子量為30KD的聚醚碸平板膜包濃縮，進一
步濃縮毒液，濃縮參數見下表
權利要求
1.一種豬細小病毒滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，其製備步驟具體如下 (1)將豬細小病毒液從原料罐中放入微濾系統進行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述滲透液中不含有細菌及細胞碎片雜質，所述濃縮液返回原料罐，當豬細小病毒液固含量大於或等於lg/L後，將豬細小病毒液排出； (2)將通過步驟(I)處理的滲透液，進行超濾處理，進ー步濃縮毒液，直到病毒血凝價達到到28 213時停止濃縮，得到濃縮液； (3)將步驟(2)處理完的濃縮液用微濾系統再過濾，處理完後得到血凝價為28 213的細小病毒毒液； (4)將步驟(3)得到的細小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活後病毒液製備成疫苗產品。
2.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，所述微濾膜孔徑為IOOnm 220nm，超濾膜孔徑為5KD 200KD。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述的微濾和超濾的膜為陶瓷材料、金屬材料、有機高分子材料、無機氧化物材料。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，所述有機高分子材料為醋酸纖維素、磺化聚碸、磺化聚醚碸、聚醯胺、聚こ烯醇或聚哌嗪醯胺。
5.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，所述無機氧化物材料為氧化鋁、氧化鈦、氧化錯、氧化鉿。
6.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，所述微濾及超濾的操作條件為溫度5 50°C，壓カO. 01 O. 5MPa，膜面流速I 5m/s。
7.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，在步驟(4)中，所述細小病毒毒液的滅活包括收集步驟(3)得到的細小病毒毒液，採用ニこ烯亞胺作為滅活劑，滅活劑濃度為O.1% 1%，滅活溫度為25 38°C，滅活時間為24 120小時。
8.根據權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，在步驟(4)中，所述將濃縮及滅活後病毒液製備成疫苗產品的具體步驟為 (1)油相製備取注射用白油90 98份，加硬脂酸鋁I 3份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-80 4 8份，混合後，在壓強為O. IMP O. 15MP、溫度為115 130°C的條件下，滅菌備用； (2)水相製備取濃縮後滅活的病毒液90 98份，加入滅菌的吐溫-802 8份，充分搖動，直到吐溫-80完全溶解； (3)乳化取油相2 4份置於乳化罐中，攪拌的同時緩慢加入水相I份，持續攪拌30 70分鐘，攪拌速度600 1200r/min，後通過剪切機2 3次剪切，剪切速度3000 5000r/min,即製成豬細小病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種豬細小病毒滅活疫苗的製備方法，其製備步驟具體如下(1)將豬細小病毒液從原料罐中放入微濾系統進行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述濃縮液返回原料罐，當豬細小病毒液固含量大於或等於1g/L後，將豬細小病毒液排出；(2)將滲透液進行超濾處理，進一步濃縮毒液，直到病毒血凝價達到到28～213時停止濃縮，得到濃縮液；(3)將濃縮液用微濾系統再過濾，處理完後得到血凝價為28～213的細小病毒毒液；(4)將細小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活後病毒液製備成疫苗產品。本發明提供一種安全可行的疫苗生產方法，使該疫苗的生產能夠不再依賴傳統工藝從而生產出高滴度的毒液，提高抗原含量，滿足免疫生產要求。
文檔編號A61P31/20GK102688485SQ20111027610
公開日2012年9月26日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者傅元華, 沈明君, 潘傑, 範娟, 錢鍾 申請人:揚州優邦生物製藥有限公司