預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法

2023-05-01 06:36:26

專利名稱：：預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法
技術領域：
：本發明涉及預防家禽傳染病的疫苗，尤其涉及一種預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法。
背景技術：
：雞新城疫、雞呼吸型和腎型傳染性支氣管炎對養雞業危害十分嚴重，目前僅有相應的單項滅活苗，如雞新城疫滅活苗、傳染性支氣管炎(單價)滅活苗，需要單獨分別注射，使用很不方便，防疫成本高。
發明內容本發明目的在於提供一種可預防雞新城疫、呼吸型和腎型傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法。本發明採用以下述技術方案來實現上述目的預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法，選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M^和H化9腎型變異株，製備二聯疫苗的步驟如下(1)、將新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株稀釋後接種SPF雞胚尿囊腔內，收取胚液，作為毒種；(2)、將LaSota株、Mw株和,99株毒種稀釋後分別接種易感雞胚尿囊腔，分別收穫LaSota株、M41株和HN99株雞胚病毒尿囊液；(3)、將病毒尿囊液分別濃縮；(4)、濃縮病毒液分別加入滅活劑滅活，然後等量混合，用乳化法製成單相油乳劑滅活疫苗。所述的乳化法為將體積份數92—95份的獸用白油、5—8份的司本-80和佔獸用白油與司本-80總重量1%—3%的硬脂酸鋁混合、加熱熔化並滅菌後冷卻為油相；將3種滅活濃縮病毒液等量混合併充分振蕩，加入佔其體積百分比4%—5%的吐溫-80混合為水相；按水相與油相體積比1:3—4的比例，乳化製成單相油乳劑滅活疫苗。滅活劑為體積百分比濃度O.1%—0.2%的甲醛水溶液，滅活時間為12一24小時。雞腎型傳染性支氣管炎HN99株病毒為新分離鑑定的病毒，其具有以下特徵(1)在電鏡下見有冠狀病毒粒子，直徑90105nm，有囊膜，周圍有長約18nm的梨狀突出，呈放射狀排列；(2)、發病雞症狀除呼吸道症狀外，大部份死雞均有腎臟腫大、尿酸鹽沉積、花斑腎等病變；(3)、病毒分離物對NDVLaSota株病毒的繁殖產生幹擾-,(4)、病毒分離物對1%雞紅細胞不產生凝集；(5)、回歸SPF雞試驗可出現呼吸道症狀和腎腫、花斑腎等病變；(6)、特異性血清中和結果證明，病雞的病毒分離物與HN99陽性血清呈陽性反應，而與NDVLaSota株、IBDVB^株、AIVH具株均呈陰性反應；(7)、將HN99株陽性血清與EID5。的Mw株、Holte株、Gray株、T株和地方分離株湖北株、哈爾濱株、山東株、北京株、上海株、天津株等病毒做血清中和試驗，結果顯示，HNg9株陽性血清與T株、湖北株、天津株和山東株呈陽性反應，與其他株病毒均呈陰性反應。本發明選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株，其中HN99腎型變異株為新分離鑑定的病毒，該病毒株免疫原性良好，能有效預防雞腎型傳染性支氣管炎傳染病，保護率達到80100%;該病毒株特異性強，專門預防雞腎型傳染性支氣管炎，這是其他病毒株不能替代的。疫苗製備還應用了超濾濃縮技術，打一針該疫苗可預防雞新城疫、呼吸型傳染性支氣管炎、腎病變型傳染性支氣管炎等三種傳染病，和現有的打三針單項疫苗才能預防這三種傳染病比較，該發明經濟使用，簡化了免疫程序，降低了防疫成本。本發明所述的雞傳染性支氣管炎病毒株於2006年5月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱CGMCC，保藏編號CGMCCNo.1729，分類命名雞腎型傳染性支氣管炎病毒，英文名稱為AvainnephropathogenicInfectiousbronchitisvirusHN99Strain，拉丁文名禾爾為TarpeiapuHi，保藏單位地址北京市海澱區中關村北一條13號，郵編100080。具體實施例方式預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法，選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株，製備二聯疫苗的步驟如下1、毒種的來源(1)雞新城疫採用LaSota株，效檢用強毒為F48E9，由河南農業大學提供。毒種的標準及保存方法同"中華人民共和國獸用生物製品規程"(以下均簡稱"規程")中"雞新城疫低毒力活疫苗製造及檢驗規程"1項的規定。(2)傳染性支氣管炎製造及檢驗均採用標準強毒M"株和地方分離株麗99株，均由河南農業大學提供。標準強毒Mw株和地方分離株麗99株毒力及毒種標準如下病毒含量M^株和麗99株毒種對10日齡SPF雞胚尿囊腔內接種的感染劑量均》1065EID5。/0.lml。感染判定標準是按接種後雞胚在24144小時內全部或部分死亡，存活的雞胚以胎兒出現失水、蜷縮、發育小或腎腫、尿酸鹽沉積等特異性病痕為標準。免疫原性免疫攻毒法毒價》10"EIDs。/0.lml的M"株和,99株易感雞胚尿囊毒，經滅活後，分別按1:3(水相油相)的比例製成油乳劑滅活疫苗，按每羽份免疫15日齡SPF雞8隻，三周後，連同條件相同的對照雞4隻，分別攻擊M"株和麗99株強毒，每隻雞氣管注射M^株或HN的株強毒尿囊液各0.2ml，觀察10天，對照雞全部發病，免疫雞保護6/8以上，或免疫雞全部保護，對照雞發病3/4。病毒分離試驗上述免疫雞和對照雞攻毒後67天採集氣管、肺臟和腎臟拭子，處理後分別接種雞胚，進行病毒分離，分離不到病毒的雞判為保護。免疫雞》8/10分離不到病毒，而對照雞》8/10的雞分離到病毒。純淨毒種按"中華人民共和國獸用生物製品質量標準"(以下均簡稱"標準")的附錄301頁檢驗，無細菌、黴菌及支原體和外源病毒汙染。特異性M,'株和朋99株毒種分別與M4,株和HN99株型特異性血清中和後，接種雞胚不引起死亡或感染。保存在-15"C以下，溼毒保存期6個月，M"株凍幹毒為3年，HN99株暫定為2年，-8(TC以下凍幹毒至少可保存IO年。2、試驗用雞二聯苗安全試驗、檢驗用雞，均採用SPF雞或易感雞。3、攻擊用強毒及攻毒方法NDVF4sE9株強毒，用前以SPF胚傳2代，毒價ELD5。為10—770.lml，肌肉或皮下注射。IBVMu株強毒，用SPF雞胚傳2代，其毒價》10"EID5。/0.lml，對l-7日齡SPF雛雞，以10倍稀釋的強毒氣管內滴入0.2ml，觀察10天，80%以上的雛雞出現典型的支氣管炎等症狀為發病標準。IBV麗99株強毒，對雞胚的毒價》10"EID5。/0.lml。攻毒時將毒種作IO倍稀釋，對17日齡SPF雞IO只氣管內滴入O.2ml，觀察10天，80%以上的雛雞出現咳嗽，甩鼻等支氣管炎症狀或支氣管、肺臟充血或出血，或有腎腫、尿酸鹽沉積等發病症狀。4、EID5、HI、HA測定方法HI、HA測定方法參照"規程"附錄40頁。EIDs。的測定方法同"規程"附錄47頁。5、制苗用毒種製備和生產用種子批的建立(1)NDVUSota株制苗用毒種製備和種子批的建立同"規程"中"雞新城疫低毒力活疫苗製造及檢驗規程"的2.1項。(2)IBVM^株和HNM株的制苗用毒種製備和種子批的建立。毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水稀釋100倍，尿囊腔內接種10-11日齡SPF雞胚，每胚O.lml。接種後3072小時，收取活胚和死胚胚液，選擇經檢驗無菌，對雞胚毒價》10"EID5。，對1%雞紅細胞凝集試驗為陰性的胚液作毒種用，註明收穫日期、毒種代次。毒種鑑定按前述項目進行，應符合規定。毒種保存在-15r以下條件，使用期不超過6個月。毒種繼代不超過3代。6、制苗用病毒液的製備及檢驗(1)NDVLaSota株病毒液的製備及檢驗同"規程"中"雞新城疫低毒力活疫苗製造及檢驗規程"2.2、2.3、2.4項。(2)IBVMw株和HN99株病毒液的製備及檢驗制苗用材料選擇發育良好的1011日齡易感雞胚作為制苗用材料。雞胚接種將Mw株和HN99株毒種分別用滅菌生理鹽水稀釋至10—2103，分別接種易感雞胚尿囊腔，每胚O.lml，接種後密封針孔，置37"C繼續孵育，停止翻蛋。孵育與觀察雞胚接種後，30小時前照蛋1次，棄去死胚，以後每隔48小時照蛋一次，死亡的雞胚隨時挑出，至72小時不論死亡與否，全部取出，氣室向上，置於28"C，冷卻1224小時。收穫分別收穫M"株和朋99株雞胚液。將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然後以無菌方法剝除氣室部位卵殼，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取雞胚液，每若干個胚的胚液混合為一組，置於滅菌瓶中，每毫升加入青黴素、鏈黴素各1000單位，放28'C感作412小時。在收穫胚液的同時應逐個檢查雞胚，凡胎兒腐敗，胚液混濁及有任何汙染可疑者棄去不用。雞胚病毒液的檢驗經處理後的Mw株和麗99株雞胚病毒液，分別按照"規程"附錄50頁進行無菌檢查(可不移植)，應無菌生長；胚液對1%雞紅細胞應無凝集；對10日齡易感雞胚尿囊腔內接種EIDs。應《10—"A),lml。符合以上規定的方可作為制苗用病毒液。7、病毒液的濃縮與滅活(1)濃縮設備使用美國密理博公司的MINI-PELLICON標準超濾設備。該設備由兩部分裝置組成。其一是病毒尿囊液預過濾裝置，此裝置使用平板式293圓盤過濾器，該濾器用316L不鏽鋼製造，全不鏽鋼接口。運行成本低，病毒液殘留體積很小，可夾持預過濾及除菌過濾膜數片。由於NDVLaSota株和IBVM"株、麗99株雞胚尿囊液的黏度高，採用常規的除菌濾膜流量很低，時間長會導致病毒液丟毒，因此，使用0.45"m孔徑的MILLIPORE的AP2529325型號專用預過濾膜，對病毒尿囊液進行粗濾，可濾除尿囊液中的雜質和很多微生物。結合生產後期的病毒滅活步驟，可達到無菌效果。其二是病毒液超過濾濃縮裝置，該裝置使用316L不鏽鋼膜包夾具及管路，全部採用衛生接口，內外表面電拋光處理。動力裝置使用不鏽鋼蠕動泵和矽膠蠕動泵管。超濾濃縮使用分子量為500K-800K的超濾膜包，可截留ND、IB等病毒粒子。此超濾膜包採用低蛋白吸附改良纖維材料，其蛋白吸附量僅為國際通用的聚醚碸材料的1/41/5。本超濾裝置的進液口和回流口及透過口均配有隔膜壓力表及隔膜閥，可控制系統的壓力，保證超濾濃縮過程的安全和高效。同時膜包夾具為直立式結構，系統排放容易，殘留體積小，再加上最後用滅菌生理鹽水衝洗、頂洗病毒液，使病毒液損耗極小。(2)超濾濃縮工藝方法粗濾將病毒尿囊液先用滅菌的100目/cm2的不鏽鋼漏鬥濾過，除去大顆粒雜質，或用30005000rpm/min的離心機離心30min，去除沉渣，吸取上清液至一消毒的容器內。預過濾將293圓盤平板濾器及管道等高壓蒸汽消毒(12rC，30min)，把盛有病毒液的容器通過管道與濾器連接充入除菌的空氣加壓後，(一般控制在0.05upa)，病毒液在一定壓力下通過平板濾器的濾膜，從出口流出。用消毒的容器收集從平板濾器濾過後流出的病毒液，完成預過濾。超濾濃縮先將超濾裝置用蒸餾水反覆衝洗乾淨，然後用1N濃度的氫氧化鈉溶液浸泡過夜12小時以上，使用時先用消毒的蒸鎦水反覆衝洗，將NaOH衝洗乾淨，使衝洗後的廢棄液近中性。然後將預過濾的病毒液容器通過消毒管道與超濾裝置連接，開啟蠕動泵，使其流量達到4L/分鐘，這樣高的流速保證超濾膜包較長的使用壽命和最佳的超濾效果。經超濾濃縮的病毒液盛入密閉的容器內，並反覆循環通過超濾裝置，直至達到要求的濃縮終點。(3)濃縮效果測定3種病毒濃縮前和濃縮後，用測血凝價HA或EIDM、TCIDs。等方法進行檢查，並確定濃縮終點。濃縮終點的確定以抗原量表示如下NDV濃縮終點的確定"雞新城疫滅活疫苗製造及檢驗規程"中規定，單相油苗中LaSota株尿囊液的病毒含量為108QEID5。，由此可知，二聯苗中LaSota株的濃縮終點的病毒含量應》3X10"EID5。。IBVM"株和HN99株濃縮終點的確定從"M"株和HI^株免疫原性、保存期測定"試驗可知，IBVM^株或,99株單相油苗中的病毒含量為10">EID5(,，由此可知，二聯苗中M"株或麗99株的濃縮終點的病毒含量為應》3X10fiOEID5O。3種病毒液按上述濃縮終點進行濃縮，濃縮後的病毒應達到濃縮終點的要求，同時對濃縮過程中的廢棄液應隨時抽樣進行檢查，檢査其EIDs。應為零值。(4)濃縮病毒液的滅活與檢驗濃縮後的3種病毒液，分別加入10%的甲醛水溶液，使其最終濃度為O.1%，當苗溫升至37""C時開始計算滅活時間，共滅活16小時。滅活後的3種病毒液，分別接種雞胚，進行HA、EIDs。測定，證明病毒已徹底滅活。同時按"規程"P50頁方法作無菌檢驗。證明無細菌生長者，方可作為制苗抗原。8、二聯苗的乳化與分裝(1)油相製備獸用白油為杭州煉油廠生產，司本-80為上海大眾製藥廠生產，硬脂酸鋁為上海遠航化工廠生產。以上三種成份混合、加熱熔化至透明，經高壓滅菌後冷卻備用。(2)水相製備經檢驗合格後的3種滅活濃縮病毒液，等量混合併充分振蕩均勻，加入滅菌冷卻後的吐溫-80(上海大眾製藥廠生產)，混合均勻備用。(3)疫苗的乳化應用"規程"(P8485)方法，把水相、油相混合後用膠體磨或與勻漿泵配合使用的方法，進行乳化。乳化工具膠體磨JTM50為瀋陽新光機械廠製造，勻漿泵為上海東華機械廠製造。使用前先用0.5%甲醛溶液浸泡消毒8小時以上，用前以滅菌的熱蒸餾水衝洗乾淨。用後用熱水反覆衝洗，徹底消除殘留油苗。具體乳化法為將體積份數92—95份的獸用白油、5—8份的司本-80和佔獸用白油與司本-80總重量1%—3%的硬脂酸鋁混合、加熱熔化並滅菌後冷卻為油相；將3種滅活濃縮病毒液等量混合併充分振蕩，加入佔其體積百分比4%—5%的吐溫-80混合為水相；按水相與油相體積比1:3—4的比例，乳化製成單相油乳劑滅活疫苗。各實施例具體成分配比如下:tableseeoriginaldocumentpage10三批疫苗0203、0204、0205，分別作如下試驗。(1)二聯苗的物理性狀檢驗劑型將三批二聯苗滴於冷水表面，不分散為W/0型，分散為0/W型。粘度用出口內徑1.2毫米的lml吸管，在室溫條件下吸取lml二聯苗，計算垂直放出0.4ml所需的時間。穩定性將二聯苗以3000rpm離心15分鐘，觀察疫苗分層情況。將疫苗放37"C條件下經21天，觀察疫苗分層情況。(2)無菌檢驗按"規程"附錄50頁的方法對三批二聯苗進行無菌檢驗。(3)安全試驗用3周齡的SPF雞，肌肉注射二聯苗2ml(4羽份)，觀察二周，並進行解剖，記錄試驗雞的反應情況和剖檢情況。(4)效力檢驗ND效力檢驗每批疫苗用1月齡SPF雞15隻(NDHI〈1:4)，其中10隻各皮下或肌肉注射二聯苗20ixl，另5隻不免疫作為對照，3周後，每隻雞肌肉注射ND強毒F48E9/E2，劑量為105ELD5Q，觀察14天，記錄免疫雞與對照雞存活與死亡情況。IB效力試驗每批疫苗用3周齡SPF雞16隻，皮下或肌肉注射二聯苗一羽份(0.3ml)，另外8隻不免疫作為對照。三周後其中8隻免疫雞連同對照雞4隻，氣管內滴入Mw含毒尿囊液(EIDs。》10670.lml)O.2ml，觀察1周，記錄免疫雞與對照雞的反應和死亡情況。另外8隻免疫雞和4隻對照雞氣管內滴入麗99株病毒液EID5。》10670.lml)O.2ml，觀察1周，記錄免疫雞與對照雞的反應和剖檢情況。(5)二聯苗不同免疫劑量試驗取上述二聯苗三批，每批苗分別按0.1，0.2，0.3，0.4的劑量，分別免疫3周齡非免疫雞，3周後照上述方法測定免疫雞抗體水平，並攻擊強毒，觀察並記錄免疫雞和對照雞的抗體水平、反應和病變情況。10、二聯苗的實驗室檢驗結果(1)二聯苗物理性狀檢驗結果劑型02030205三批二聯苗檢驗樣品滴於冷水表面，基本不分散，為W/0(油包水)型。粘度用出口內徑1.2毫米的1毫升吸管，在室溫條件下吸取3批二聯苗各lml，垂直放出0.4ml所需的時間均在8秒以內，符合"規程"中"雞新城疫滅活疫苗製造及檢驗規程"中關於油乳劑的粘度要求。穩定性3批二聯苗以3000rpm離心30分鐘，疫苗不分層、不破乳。二聯苗在28X:保存一年，2(TC25。C保存半年，疫苗不分層，37°C放一個月不分層，二個月疫苗表面有2mm左右的油層，搖蕩後即成均勻的乳劑。結果如表l。表l二聯苗物理性狀檢驗結果tableseeoriginaldocumentpage12(3)安全試驗用3周齡的SPF雞，肌肉注射二聯苗2ml(4羽份)。疫苗注射後部分試驗雞出現短時間精神不振，12小時後即恢復正常。共觀察3周，所有試驗雞精神良好，吃喝正常。三周後捕殺，所有臟器未見異常變化。注射局部有少量未吸收的疫苗，但無腫脹潰爛。試驗證明疫苗安全，結果如表3。表3二聯苗安全檢驗結果tableseeoriginaldocumentpage13注"-"表示無反應，"±"表示有少量未吸收疫苗。(4)效力試驗ND效力試驗每批疫苗用1月齡SPF雞10隻，其中5隻皮下注射，5隻肌肉注射，劑量為二聯苗20W，另5隻不免疫作為對照，34周後，每隻雞肌肉注射ND強毒F48E9/E2，105ELD5。，觀察14天，對照雞全部死亡，三批疫苗免疫雞全部保護，達到"規程"中"雞新城疫油乳劑滅活疫苗製造及檢驗規程"的效力檢驗標準。IB效力試驗每批疫苗用3周齡SPF雞16隻，皮下和肌肉注射各8隻，每隻劑量0.3ml，三周後其中8隻免疫雞(4隻肌肉注射，4支皮下注射)連同條件相同的對照雞4隻，氣管內注射M^含毒尿囊液(EK10-"/0.lml)0.2ml，觀察二周，結果免疫雞保護7/8以上。M41株對照雞全發病，發病雞有咳嗽、甩頭等典型支氣管炎症狀，2隻雞解剖後支氣管、肺臟有充血、出血等病變，另外8隻免疫雞和對照雞4隻，氣管內注射麗99株含毒尿囊液(EID5Q《1(T70.lml)，觀察二周，結果免疫雞全保護，對照雞3/4發病，發病雞有咳嗽、呼吸快、甩頭等支氣管炎症狀，其中1隻雞有腎腫、1隻雞支氣管、肺臟充血和出血的解剖症狀。符合"國家質量標準"中"雞傳染性支氣管炎滅活疫苗"效力檢驗標準的要求。詳細結果見表4。表4二聯苗效力試驗疫苗效檢免疫劑量免疫ND攻毒前抗體攻毒對照結批號項目(ml)雞數HI(L0g2)保護情況果ND0.02108.510/100/5活合格0203M410.387/84/4發病HN990.388/83/4發病ND0.02108.2510/100/5活合格0204M410.388/84/4發病HN990.388/83/4發病ND0.02108.510/100/5活各格0205M410.387/84/4發病HN卵0.388/83/4發病注攻毒劑量NDV:FE9-E2，105ELD5，肌肉注射。IBV:M"E4和,99株，含毒尿囊液(EK1(T65/0.lml)氣管內滴入0.2ml，並施行冷剌激。11、二聯苗不同免疫劑量的效力試驗用二聯苗0203、0204、0205三批疫苗，分別用0.1、0.2、0.3、0.4的免疫劑量，按照第2.6.4項效力檢驗的方法，免疫試驗雞。21天後，採血測定NDHI,並分別攻擊ND、IBM"和,99強毒，觀察攻讀結果。如tableseeoriginaldocumentpage15從表5的結果可以看出，三批二聯苗免疫O.l0.4ml，試驗雞攻毒後，免疫試驗雞ND攻毒後，保護7/1010/10，IBM^和HN^攻毒保護6/88/8，攻毒結果均達到"規程"和"標準"的規定標準。12、二聯苗實驗室試驗結果分析(1)IBVM"株和朋99株基礎種毒代數為最高代次Es，生產用種毒最高代次為第3代；凍幹毒在-18"C以下，保存期至少3年，生產用毒種(雞胚尿囊液)在-15"C以下保存，不超過6個月。(2)二聯苗制苗用病毒液的製備用"規程"中的方法測定，NDVLaSota株雞胚尿囊液的病毒含量》10"EID5。，HA》1:640;IBVM"株、麗99株雞胚尿囊液的病毒含量^Ur。EID5。。三種病毒液經無菌檢驗均無菌生長，符合制苗的要求。(3)二聯苗3種病毒液的濃縮試驗結果二聯苗中3種病毒液用美國密裡博超濾裝置濃縮病毒的工藝是可行的。選用適宜孔徑的超濾膜包，用測定病毒含量或HA的方法，按照予先設計的濃縮終點，可以達到濃縮NDV、IBV3種病毒液的目的。濃縮後的廢棄液，採用檢査EIDs。的方法，證明濃縮後的排放液中不含病毒，濃縮效果較為理想。(4)二聯苗濃縮病毒液的滅活試驗證實，3種濃縮病毒液，採用0.1%甲醛溶液，在37T條件下滅活16小時後，LaSota株、M41株、HN9g株病毒滅活液0.2ml接種雞胚，結果雞胚在規定時間內，全部健活，3種病毒液經滅活後均失去活性，證明滅活徹底。(5)二聯苗的乳化與分裝二聯苗三種滅活後的病毒液等量混合後，按照水相油相為l:3的比例，用膠體磨分別乳化後，再經勻漿機充分乳化並混合均勻，可以製備出理想的單相油乳劑滅活疫苗。13、疫苗的田間試驗田間試驗中使用的產品批數、批號0203、0204、0205三批試驗時間和地點鄭州市滎陽雞場2002年6月份主要試驗內容和結果三批二聯苗分別免疫羅曼90日齡和210日齡產蛋雞各1000隻，每隻肌肉注射O.5ml。注射後共觀察14日，所有注射雞均無全身症狀出現，吃食、飲水正常，210日齡產蛋雞產蛋率未受影響。少數雞因注射時抓雞有應激反應，當天不產蛋，但次日即恢復正常。所有免疫雞的注射部位反應正常，無紅腫或潰爛現象。說明三批二聯苗對開產前母雞和正在產蛋的雞使用後無不良的全身症狀和局部症狀出現，產蛋率不受影響。試驗證明，三批二聯苗使用安全。三批二聯苗免疫後第三周，採血測定抗體，NDHI(iQg2)由原來的7.08.25升至9.011.5，IB中和抗體價由原來的1:8升至1:161:32。試驗證明，三批二聯苗免疫三周後，NDHI、IB中和抗體上升到較高的水平。4個月後回訪客戶，免疫雞均未發生ND、IB這二種傳染病。三批二聯苗免疫7日齡非免疫雛雞各500隻，每雞注射0.3ml，注射後觀察14日，所有免疫雞均未出現任何全身症狀和局部症狀，免疫雛雞飲食、精神正常，發育正常，注射部位未有紅腫、潰爛等異常情況，證明二聯苗對雛雞安全性良好。上述三批二聯苗免疫雛雞二周後按"規程"和"標準"的方法，分別用,F』9強毒105ELD5。的劑量和IBVM"株和麗99株強毒尿囊液0.2ml分別以肌肉注射和氣管滴入法進行攻擊，結果三批二聯苗ND免疫雛雞均全保護，對照死亡5/5，傳支M"和HN99均保護8/8，對照3/4發病，證明二聯苗對雛雞免疫效果較好。14、二聯苗中試生產及檢驗結果按照"農業部獸用新生物製品管理辦法"的要求，在完成實驗室的基礎上，在北京獸醫生物藥品廠進行了二聯苗的中間試產，共試製二聯苗6批，並參照"中華人民共和國獸用生物製品規程"(以下簡稱"規程")和"中華人民共和國獸用生物製品質量標準"(以下簡稱"國標")的方法對6批疫苗進行了安全試驗、效力試驗、物理性狀檢測、無菌檢驗等，各項檢驗結果均達到了"規程"和"國標"的要求。詳細結果見表6、7、8。表6二聯苗中試物理性狀檢驗及無菌檢驗tableseeoriginaldocumentpage17表7:tableseeoriginaldocumentpage18注(一)表示無異常反應。表8二聯苗中試生產效力檢驗tableseeoriginaldocumentpage1915、二聯苗大面積區域性試驗利用中試生產的6批二聯苗，在河南省漯河市陽光禽業有限公司、南陽市蒲山種雞場、南陽市馮樓種雞場、康佳種雞場、漯河市日日紅禽業有限公司等5個種雞場，進行了大面積的區域性試驗。共注射羅曼、海蘭、海賽、AA等品種的種雞46000隻。注射後觀察23周，注射雞的精神、採食、飲水都正常，注射當日產蛋率因應激反應下降23個百分點，次日即恢復正常。注射部位基本無腫脹、潰爛、發炎等情況。注射後NDHl較注射前上升34l。g2，從區域性試驗用戶的反應情況，證明二聯苗安全性好，效力可靠。詳細結果見表9。表9二聯苗區域性試驗情況疫苗批號試驗雞場注射品種、曰齡注射數量(只)局部反應全身反應注射前NDHIG。g2)注射後NDHI(bg2)0601漯河市陽光種雞場海蘭、1102000無異常反應精神、飲食正常6.09.0康佳種雞場海賽、1253000無異常反應精神、飲食正常8910130602漯河市陽光種雞場海蘭、1102000無異常反應精神、飲食正常6.09.00603南陽蒲山種雞場海蘭、開產刖3000無異常反應精神、飲食正常67911康佳種雞場海賽、1253000無異常反應精神、飲食正常8910130604南陽蒲山種雞場海蘭、開產前3000無異常反應精神、飲食正常679110605漯河日R紅種雞場AA、185000無異常反應精神、飲食正常68810南陽馮樓種雞場羅曼開產後半年10000無異常反應精神、飲食和產蛋正常91110140606南陽馮樓種雞場羅曼開產後半年10000無異常反應精神、飲食和產蛋正常9111014漯河日日紅種雞場AA、185000無異常反應精神、飲食正常68810權利要求1、預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株，製備二聯疫苗的步驟如下(1)、將新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株稀釋後接種SPF雞胚尿囊腔內，收取胚液，作為毒種；(2)、將LaSota株、M41株和HN99株毒種稀釋後分別接種易感雞胚尿囊腔，分別收穫LaSota株、M41株和HN99株雞胚病毒尿囊液；(3)、將病毒尿囊液分別濃縮；(4)、濃縮病毒液分別加入滅活劑滅活，然後等量混合，用乳化法製成單相油乳劑滅活疫苗。2、如權利要求l所述的預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述的乳化法為將體積份數92—95份的獸用白油、5—8份的司本-80和佔獸用白油與司本-80總重量1%—3%的硬脂酸鋁混合、加熱熔化並滅菌後冷卻為油相；將3種滅活濃縮病毒液等量混合併充分振蕩，加入佔其體積百分比4%—5%的吐溫-80混合為水相；按水相與油相體積比1:3—4的比例，乳化製成單相油乳劑滅活疫苗。3、如權利要求1或2所述的預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，滅活劑為體積百分比濃度0.1%—0.2%的甲醛水溶液，滅活時間為12—24小時。全文摘要本發明涉及預防家禽傳染病的疫苗，尤其涉及一種預防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯滅活疫苗的製備方法，選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和HN99腎型變異株製備二聯滅活疫苗，製備步驟如下將兩種病毒稀釋後分別接種SPF雞胚尿囊腔內，收取活胚和死胚的胚液作為毒種，稀釋後分別接種易感雞胚的尿囊腔，分別收穫病毒尿囊液，然後通過超濾裝置濃縮，濃縮後病毒液分別加入甲醛水溶液滅活後混合，用乳化法製成疫苗。使用本發明可同時預防雞新城疫、雞腎型和呼吸型傳染性支氣管炎，可減少打針次數，降低防疫成本，使用方便，經濟實用。文檔編號A61K39/12GK101099864SQ200610018069公開日2008年1月9日申請日期2006年7月3日優先權日2006年7月3日發明者崔保安,張素梅,徐端紅,莉王,王學斌,舒德廣,高文明,魏佔勇申請人:河南農業大學