精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗及其製備方法

2023-05-18 19:06:01 2

專利名稱：精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種疫苗，特別涉及精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗，還涉及該 疫苗的製備方法。
背景技術：
以精子抗原為基礎的疫苗開發代表了一種大有希望的避孕途徑。精子抗原在避孕 疫苗開發上的應用在於其精子特異性，參與人類生育，並可在生殖道局部產生足以能夠終 止受精的免疫應答。精子蛋白Ropporin特異性表達於人和小鼠的睪丸組織中，主要定位在精子鞭 毛主段和末段纖維鞘的內側面。Ropporin由212個胺基酸殘基組成，其中，N端序列與 PKA(cAMP-dependent protein kinase)調節亞基R II a的二聚化結構保持高度同源性， C端序列與Rhophilin的PDZ結構域結合。Rhophilin能同時與Ropporin和小G蛋白酶 Rho結合，三者不僅共同定位在精子纖維鞘上，而且在體外能結合成複合體，Ropporin和 Rhophilin在精子細胞RhoA信號轉導通路中起到支架作用。此外，Ropporin還可以通過高 度保守的R II a同源結構域與多種APAKs保持高度親和力。由於RhoA信號轉導通路和多 種APAKs參與精子運動、獲能和頂體反應，因此，推測Ropporin在這些生理活動中可能發揮 重要作用，可能成為男性不育篩選和治療的靶點，尤其是免疫避孕的新靶點。0X40配體(0X40L)屬TNF家族成員，為II型跨膜糖蛋白。0X40/0X40L作為一對 重要的免疫共刺激分子，為T、B細胞的激活提供了重要的第二信號。它們的相互作用能促 進CD4+T細胞的活化、增殖、遷移並延長其壽命，還能促進生發中心的形成和樹突狀細胞的 分化成熟。免疫刺激複合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、膽固醇及磷脂混合後自發形成 的一種直徑為30 40nm的球形籠狀顆粒，具有佐劑和抗原遞呈的雙重功能，可大幅度提高 抗原的免疫原性。文獻報導，以ISCOM為佐劑製得的DNA疫苗誘導的中和抗體水平和免疫 保護力明顯高於裸DNA，可能的機制是經ISCOM包裹的DNA能免受體內核酸酶的降解，從而 保證該DNA在機體內持續表達。另外，ISCOM的結構特性使其更易於定居在淋巴組織內，從 而有利於抗原遞呈細胞的吞噬。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種精子特異性蛋白Ropporin的基因疫 苗；目的之二在於提供所述精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗的製備方法。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案1、精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗，該疫苗是由Ropporin和0X40L雙基因 共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激複合物型疫苗。進一步，所述Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體是在含有內部核糖體 進入位點IRES的雙基因共表達真核載體的IRES上遊和下遊分別插入Ropporin全長cDNA和B細胞激活因子全長cDNA ；進一步，所述Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇 及卵磷脂的質量比為5 10 1 1。2、所述精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗的製備方法，包括以下步驟a、Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體的構建將Ropporin全長cDNA插入含有IRES的雙基因共表達真核載體的IRES上遊，再將0X40L全長cDNA插入該真核載 體的IRES下遊，即得Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體；b、免疫刺激複合物的製備將Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體用磷 酸鹽緩衝液即PBS溶解後，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有 Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img和卵 磷脂0. lmg，冰浴超聲處理使溶液充分混勻並乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成 的免疫刺激複合物，也即Ropporin的基因疫苗。進一步，所述步驟a的具體方法為aURopporin全長cDNA的克隆提取人成熟精子細胞總RNA，逆轉錄得到總cDNA， 再以該總cDNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列為上下遊引物，PCR擴增 兩端分別帶有Pst I和EcoR I酶切位點的Ropporin全長cDNA，PCR條件為94°C預變性5 分鐘 』然後94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最後72°C延伸 10分鐘；PCR產物經純化後克隆入ρΤ-Easy載體，得重組載體pT-Ropporin ；a2、0X40L全長cDNA的克隆提取人脾臟組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該 總cDNA為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列為上下遊引物，PCR擴增兩端分 別帶有BamH I和Sal I酶切位點的B細胞激活因子全長cDNA，PCR條件為94°C預變性5 分鐘 』然後94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最後72°C延伸 10分鐘；PCR產物經純化後克隆入ρΤ-Easy載體，得重組載體pT_0X40L ；a3、重組真核載體的構建自步驟al所得重組載體pT-Ropporin中用Pst I和 EcoR I雙酶切出Ropporin全長cDNA，經純化後與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的真核 載體pStar連接，得重組載體pStar-Ropporin ；再自步驟b所得重組載體pT_0X40L中用 BamH I和Sal I雙酶切出0X40L全長cDNA，經純化後與同樣用BamH I和Sal I雙酶切 的重組載體pStar-Ropporin連接，即得Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體 pStar-Ropporin-IRES-0X40L。本發明的有益效果在於本發明的精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗能夠抑 制精子的運動，特異性降低BALB/c小鼠的平均產仔率和產仔數，且製備方法簡單、成本低 廉，在免疫避孕領域具有良好的應用前景。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中圖1為PCR擴增Ropporin全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖2為PCR擴增0X40L全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖3為免疫組織化學檢測Ropporin ；
圖4為免疫螢光檢測Ropporin ；圖5為運動精子的百分率檢測；圖6為繁殖配對實驗中雌性BALB/c小鼠的平均產仔數；圖7為繁殖配對實驗中雌性BALB/c小鼠的平均產仔率。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。一、Ropporin基因疫苗的製備1、Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體的構建(1) Ropporin 全長 cDNA 的克隆根據GenBank登錄號為ΝΜ_017578的Ropporin基因序列，設計併合成如下引物以 PCR擴增兩端帶有酶切位點的Ropporin全長cDNA 上遊引物Fl 5『-atctgcagatggctcagac agataagcca-3，(SEQ ID No. 3)，下劃線部分為 Pst I 酶切位點；下遊引物 Rl :5』_tacgaattc ttactccagctgaaccctgg-3』 (SEQ ID No. 4)，下劃線部分為EcoR I酶切位點；從健康男性志 願者精液中分離出成熟精子，用RPMI 1640培養基常規培養，收集細胞，PBS洗滌3次，用總 RNA提取試劑盒提取精子細胞總RNA ；將所得精子總RNA逆轉錄為cDNA，再以該cDNA為模 板、採用上下遊引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR總體系為50 μ L，PCR條件為94°C預變性 3分鐘，然後94°C變性1分鐘、58°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共30個循環，最後72°C 延伸7分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與pT Easy 載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽 性克隆，提取質粒，委託上海生工生物工程技術服務有限公司測序驗證，將插入了 Ropporin 全長cDNA序列(SEQ ID No. 1)的陽性克隆質粒命名為重組載體pT-Ropporin ；PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，其中M泳道為DNA分子量標準，1泳 道為PCR產物，可見PCR產物在約630bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(2) 0X40L 全長 cDNA 的克隆根據GenBank登錄號為NM_003326的0X40L基因序列，設計併合成如下引物以PCR 擴增兩端帶有酶切位點的0X40L全長cDNA 上遊引物F2 5，-RatcRRatccatRRaaaRRRtccaa ccc-3』 (SEQ ID No. 5)，下劃線部分為 BamH I 酶切位點；下遊引物 R2 :5』 -acgcgtcgactcaa aggacacagaattcacca-3』 (SEQ ID No. 6)，下劃線部分為 Sal I 酶切位點；按 Trizol 試劑盒 說明書提取人脾臟組織總RNA，反轉錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，採用上下遊引物 F2和R2進行PCR擴增，PCR總體系為50 μ L，PCR條件為94°C預變性5分鐘；然後94°C變 性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最後72°C延伸10分鐘。PCR產物 經瓊脂糖凝膠電泳鑑定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與ρΤ-Easy載體連接，連接產物 轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，委 託上海生工生物工程技術服務有限公司測序驗證，將插入了 0X40L全長cDNA序列(SEQ ID No. 2)的陽性克隆質粒命名為重組載體PT-0X40L。PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，其中M泳道為DNA分子量標準，1泳道為PCR產物，可見PCR產物在約550bp處呈單一特異性條帶，與目的片段大小相符。(3) Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體的構建根據Ropporin和0X40L全長cDNA兩端所設計的酶切位點，先將Ropporin全長cDNA插入含有內部核糖體進入位點IRES的雙基因共表達真核載體pStar的IRES上遊，再 將0X40L全長cDNA插入pStar載體的IRES下遊。具體方法為先將重組載體pT-Ropporin 用Pst I和EcoR I雙酶切，雙酶切產物經凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與同樣經Pst I 和EcoR I雙酶切的真核載體pStar連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含 有氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，Pst I和EcoR I雙酶切鑑定，將陽性克 隆質粒命名為重組載體pStar-Ropporin ；再將重組載體pT_0X40L用BamH I和Sal I雙酶 切，雙酶切產物經凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與同樣經BamH I和Sal I雙酶切的重 組載體pStar-Ropporin連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨苄青黴 素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，BamH I和Sal I雙酶切鑑定，將陽性克隆質粒命名 為Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體pStar-Ropporin-IRES_0X40L。2、ISCOM 的製備將Ropporin 和 0X40L 雙基因共表達重組真核載體 pStar-Ropporin-IRES_0X40L 用磷酸鹽緩衝液即PBS溶解後，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中 含有Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img 和卵磷脂0. lmg，冰浴超聲處理使溶液充分混勻並乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為 形成的ISC0M，也即Ropporin基因疫苗。二、Ropporin基因疫苗的體內免疫及檢測將雄性BALB/c小鼠隨機分為實驗組和空白對照組，每組5隻；實驗組以本發明的 Ropporin基因疫苗為免疫原，空白對照組以PBS為免疫原；兩組小鼠按100 μ L的劑量行腹 腔免疫，每隔2周免疫1次，連續免疫3次；末次免疫後第14天尾靜脈採血，用間接ELISA 法測定血清抗體效價。(1)免疫組織化學檢測Ropporin取小鼠睪丸組織(0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm)置中性福馬林溶液中，4°C固定12小 時，脫水後石蠟包埋、切片(5mm)，行免疫組織化學檢測將蠟切片脫蠟至水，用體積分數為 3%的過氧化氫溶液室溫孵育5 10分鐘，蒸餾水衝洗，PBS浸泡5分鐘，再用體積分數為 5 10%的正常山羊血清的PBS稀釋液封閉，室溫孵育10分鐘，傾去封閉液，再滴加前述獲 得的免疫小鼠血清，37°C孵育1 2小時，PBS衝洗，再滴加稀釋的生物素標記二抗(用含 有體積分數為的牛血清白蛋白的PBS稀釋)，37°C孵育10 30分鐘，PBS衝洗，再滴加 稀釋的辣根過氧化氫酶標記鏈黴卵白素(用PBS稀釋)，37°C孵育10 30分鐘，PBS衝洗， DAB顯色，自來水充分衝洗，復染，封片，置顯微鏡下觀察，拍片。結果如圖3所示，其中A為空白對照組，B為實驗組，可見Ropporin在睪丸組織 中有表達，其主要表達在睪丸組織的圓形精子細胞階段，採用本發明疫苗免疫獲得的抗 Ropporin抗體能夠有效結合精子細胞。(2)免疫螢光檢測Ropporin將純化精子均勻塗在載玻片上，丙酮固定15分鐘，用含有體積分數為0. 的 Triton-IOO的PBS(即PBST)洗滌後，再加入過氧化物酶抑制劑滅活內源性過氧化物酶，PBS洗滌後，置非免疫動物血清溼盒內封閉10分鐘，再加入前述獲得的血清(稀釋度為 1 300，以體積分數為的胎牛血清稀釋)，4°C孵育過夜，PBS洗滌後，再加入異硫氰酸 螢光素標記二抗，室溫下孵育40分鐘，PBS洗滌後，用體積分數為90%的甘油封片，置螢光 顯微鏡下觀察，拍片。結果如圖4所示，其中A為空白對照組，B為實驗組，可見採用本發明疫苗免疫獲 得的抗Ropporin抗體結合在精子鞭毛的主段和末段上。(3)抗體結合試驗將純化精子轉移到Biggers-Whitten-Whittingham(Bffff)培養液中，使其分布均 勻，密度約為IX IO6個/mL，加入採用本發明疫苗免疫獲得的抗CatSperl抗體並使抗體終 濃度分別為5μ g/mL和10 μ g/mL，每一抗體濃度設立3個復孔，同時設空白對照組(不加入 抗CatSperl抗體)，37°C孵育，分別在孵育1、2、4小時後用計算機輔助精子分析系統計算運 動精子數量，每個孔隨機檢測3個視野，實驗重複6次，將數據進行統計分析。結果如圖5所示，採用本發明疫苗免疫獲得的抗CatSperl抗體孵育精子1、2、4小 時後，運動精子數均較空白對照組明顯減少並且成劑量依賴性，表明採用本發明疫苗免疫 獲得的抗Ropporin抗體可以抑制精子的運動。三、繁殖配對試驗將雄性BALB/c小鼠隨機分為實驗組、陰性對照組和空白對照組，每組10隻；實驗 組以本發明的Ropporin基因疫苗為免疫原，陰性對照組以無關對照OVA基因疫苗(以OVA 全長cDNA代替Ropporin全長cDNA按照本發明基因疫苗的製備方法製得)為免疫原，空白 對照組以PBS為免疫原；各組小鼠按100 μ L的劑量行腹腔免疫，每隔1周免疫1次，連續免 疫3次，末次免疫1周後，將雌、雄BALB/c小鼠按每籠2 1的雌雄比例合籠交配，2周後將 雌、雄BALB/c小鼠分開單獨飼養，觀察雌鼠產仔率和產仔數。結果如圖6和圖7所示，實驗組的雌性BALB/c小鼠的平均產仔率為24%，平均產 仔數為3. 2隻；陰性對照組的雌性BALB/c小鼠的平均產仔率為92%，平均產仔數為7. 1隻； 空白對照組的雌性BALB/c小鼠的平均產仔率為94%，平均產仔數為6. 8隻，表明本發明的 Ropporin基因疫苗能夠特異性降低BALB/c小鼠的平均產仔率和產仔數。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參 照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明 的精神和範圍。
權利要求
精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗，其特徵在於該疫苗是由Ropporin和OX40L雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激複合物型疫苗。
2.根據權利要求1所述精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗，其特徵在於所述 Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體是在含有內部核糖體進入位點IRES的雙基 因共表達真核載體的IRES上遊和下遊分別插入Ropporin全長cDNA和B細胞激活因子全 長 cDNA。
3.根據權利要求1所述精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗，其特徵在於所述 Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂的質量比為 5 10 1 I0
4.權利要求1所述精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗的製備方法，其特徵在於包 括以下步驟a、Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體的構建將Ropporin全長cDNA插入 含有IRES的雙基因共表達真核載體的IRES上遊，再將0X40L全長cDNA插入該真核載體的 IRES下遊，即得Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體；b、免疫刺激複合物的製備將Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體用磷酸 鹽緩衝液即PBS溶解後，加入皂苷Quil A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有 Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體0. 5mg、皂苷Quil A lmg、膽固醇0. Img和卵 磷脂0. lmg，冰浴超聲處理使溶液充分混勻並乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成 的免疫刺激複合物，也即Ropporin的基因疫苗。
5.根據權利要求4所述精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗的製備方法，其特徵在 於所述步驟a的具體方法為al、Ropporin全長cDNA的克隆提取人成熟精子細胞總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以 該總cDNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列為上下遊引物，PCR擴增兩端分 別帶有Pst I和EcoR I酶切位點的Ropporin全長cDNA, PCR條件為94°C預變性5分鐘； 然後94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最後72°C延伸10分 鍾；PCR產物經純化後克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT-Ropporin ；a2、0X40L全長cDNA的克隆提取人脾臟組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總 cDNA為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列為上下遊引物，PCR擴增兩端分別帶 有BamH I和Sal I酶切位點的B細胞激活因子全長cDNA，PCR條件為94°C預變性5分鐘； 然後94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最後72°C延伸10分 鍾；PCR產物經純化後克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_0X40L ；a3、重組真核載體的構建自步驟al所得重組載體pT-Ropporin中用Pst I和EcoR I雙酶切出Ropporin全長cDNA，經純化後與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的真核載 體pStar連接，得重組載體pStar-Ropporin ；再自步驟b所得重組載體pT_0X40L中用 BamH I和Sal I雙酶切出0X40L全長cDNA，經純化後與同樣用BamH I和Sal I雙酶切 的重組載體pStar-Ropporin連接，即得Ropporin和0X40L雙基因共表達重組真核載體 pStar-Ropporin-IRES-0X40L。
全文摘要
本發明涉及一種疫苗，特別涉及精子特異性蛋白Ropporin的基因疫苗，該疫苗是由Ropporin和OX40L雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil A、膽固醇及卵磷脂組成的免疫刺激複合物型疫苗，能夠抑制精子的運動，特異性降低BALB/c小鼠的平均產仔率和產仔數，在免疫避孕領域具有良好的應用前景；本發明還涉及該疫苗的製備方法，操作簡便，成本低。
文檔編號C12N15/85GK101816798SQ20101014396
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月9日 優先權日2010年4月9日
發明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學