誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島β樣細胞分化並穩定表達胰島素的方法及其專用誘導液的製作方法
2023-05-19 00:24:21 1
專利名稱：誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島β樣細胞分化並穩定表達胰島素的方法及其專用誘導液的製作方法
技術領域：
本發明涉及誘導幹細胞分化的技術領域，具體涉及一種誘導人胎肝間充質 幹細胞向胰島3樣細胞分化並穩定表達胰島素的方法及其專用誘導液。
背景技術：
糖尿病已成為21世紀威脅人類生命健康的主要殺手。目前在針對糖尿病 病因病理的各種治療措施中，服用藥物和注射胰島素是常用的方法，但是服用 藥物和注射胰島素不僅會帶來沉重的經濟負擔，而且會引起嚴重的併發症； 近年來，移植胰島治療糖尿病初見療效，但面臨著組織來源不足和免疫排斥 反應兩大難題。基因/細胞治療越來越受到人們的關注。胰-十二指腸同源盒1 基因(PDX1)是決定胰腺分化發育和胰島功能的主要調節基因。因此是這一 治療最具希望的候選基因。
利用PDX1對非P細胞進行直接或間接修飾很可能是今後糖尿病基因治 療中極具潛力的一個發展方向。PDX1基因可以在不同載體的介導下直接導入 體內，誘導非P細胞中內源性胰島素的表達。但是以病毒為載體的介導方式在 臨床應用中存在安全問題，因此迫切需要一種安全的、高效的介導方法。
其中TAT蛋白轉導域是一種倍受矚目的跨膜遞送載體的方式。它不但自 身可以跨膜進入細胞，而且能把與它融合的其它超過50種的蛋白和其它外源 物質帶入細胞。TAT是一種來源於人類免疫缺陷病毒HIV-1的轉錄激活因子，
能夠有效引導肽段或者蛋白質穿透細胞膜，其分子中具有蛋白轉導作用的結構 是一個富含鹼性胺基酸的多肽片段，這一多肽片段稱為蛋白轉導結構域。其氨
基酸序列為YGRKKRRQRRR。它可以非常高效將與其融合的蛋白質轉入各 種細胞及細胞核中並發揮該蛋白質的功能。通過TAT蛋白轉導域技術將PDX1 蛋白導入到人胎肝間充質幹細胞內，獲得有功能的胰島素產生細胞，將為糖尿 病的幹細胞治療提供一種新的種子細胞。 發明內容為了克服上述現有技術的缺點和不足，本發明的目的首先是提供一種用於
誘導人月臺肝間充質幹細胞(mesenchymal stem cells derived from human fetal liver, hFL-MSCs)向胰島P樣細胞分化的誘導液。本發明的另一目的是提供 一種誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島P樣細胞分化並穩定表達胰島素的方法。
本發明的目的通過以下的技術方案實現 一種誘導液，是在細胞培養液中 添加TAT-PDX1融合蛋白得到的。
所述TAT-PDX1融合蛋白可從市售渠道或通過重組蛋白純化技術得到。
所述TAT-PDX1融合蛋白的摩爾濃度優選20 mol/L。所述細胞培養液優選 含3%~5%體積濃度胎牛血清(FCS)的DMEM/F12培養液。
一種誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島P樣細胞分化並穩定表達胰島素的 方法，包括以下步驟
(1) 分離、純化並傳代擴增人胎肝間充質幹細胞；
(2) 將步驟(1)中第3代以後的人胎肝間充質幹細胞，於上述的誘導液 中培養3-5天，然後加入高糖DMEM/F12培養基(市售即可，通常葡萄糖含 量一般為4500mg/L)中繼續培養10天以上即得到胰島P樣細胞團。
步驟(2)中所有培養基的加入量參照常規細胞培養時培養基的加入量。 步驟(1)的優選方案是先採用分歩離心法，再用羥乙基澱粉沉降法分 離出人胎肝間充質幹細胞；然後將間充質幹細胞重新懸浮於完全培養基中，反 復吹打使細胞分散成單細胞懸液，然後接種培養；細胞達到70% 80%融合時， 用胰酶進行消化處理，然後按1 : 2~3比例傳代培養；
(2)取步驟(1)中第3代以後的達到80% 卯％融合的人胎肝間充質幹 細胞，消化、接種後，按加入所述誘導液，每8小時換誘導液一次，連續4天， 然後加入含體積分數為10。/。胎牛血清的高糖DMEM/F12培養基中繼續IO天以 上即得到胰島3樣細胞團。
步驟(1)更優選的方案包括，所述的完全培養基優選含有10% FCS、 2mmol/L谷胺醯胺、20mmol/LHEPES (中文名4-羥乙基哌嗪乙磺酸英文名 4畫(2勿droxyerhyl)piperazine-l-erhanesulfonic acid )的DMEM/F12培養基；所 述的接種培養的優選方案是將細胞按1.5X 106/(^2接種於25 cn^培養瓶中，在 37°C、 5% C02的培養箱中培養，培養3天後首次更換培養液，棄去未貼壁 細胞，以後每2 3天換液l次；所述用胰酶進行消化處理優選包括如下過程
5加入質量濃度為0.25%的胰酶，浸沒所有細胞後倒掉胰酶，然後再加入上述胰
酶，倒去大部分，僅剩剛好覆蓋細胞的胰酶，在37"C繼續消化1 3分鐘，
然後加入完全培養基終止消化。
步驟(2)更優選的方案包括所述消化是用質量濃度為0.25 %的胰酶消 化；所述接種是按l :2比例接種於25cn^之培養瓶，所述誘導液的加入量為 2ml每瓶(25cm2)。
本發明所述的人胎是指已死亡的離體胎兒，胎兒時期的MSCs因為增殖能 力更強，可塑性更好，且免疫原性低，無成瘤性，因而具有顯著的優越性，在 體外將其初步誘導為能分泌胰島素的胰島P樣細胞，再移植到糖尿病患者體內 進一步發育可望實現血糖水平的調節。
相對於現有技術，本發明的有益效果體現在以下幾個方面
本發明提供的誘導液中添加了 TAT-PDX1融合蛋白，誘導人胎肝間充質幹 細胞得到的胰島P樣細胞團能夠穩定表達胰島素，克服了現有技術加入的細胞 因子較多，胰島素表達不穩定等不足；直接使用融合蛋白，也避免了病毒轉染 方法中涉及的生物安全性問題。
圖1是倒置顯微鏡下所見未誘導的hFL-MSCs形態圖。
圖2是倒置顯微鏡下所見誘導10天後的胰島P樣細胞團的形態圖。
圖3是誘導後所得的胰島P樣細胞團雙硫腙染色陽性表達圖。
圖4是誘導後所得的胰島e樣細胞團的胰島素/C-肽陽性表達圖(細胞爬
片)；其中圖a是C-肽陽性表達圖；圖b是胰島素的陽性表達圖；圖C為細胞
核染色；圖d為圖a、圖b與圖c的合圖。
圖5是RT-PCR鑑定誘導的胰島3樣細胞團胰島相關基因表達的電泳圖。 圖6是培養中的胰島P樣細胞團釋放的胰島素累積分泌量的變化圖 圖7是葡萄糖刺激後的胰島P樣細胞團釋放的胰島素的變化圖。 圖8是腎包膜下細胞移植對糖尿病小鼠血糖影響的曲線圖。
具體實施例方式
實施例1誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島e樣細胞分化 (1)人胎肝間充質幹細胞的分離、純化及擴增無菌生理鹽水衝洗胎兒， 剪去臍帶後置於大燒杯中，用體積分數為75%的酒精浸泡5分鐘，超淨臺中無菌取出胎肝，PBS衝洗血液數次，剪除包膜，將剩餘肝組織剪碎，用尖嘴吸
管吸取含2。/。(體積分數)FCS的Hank液衝洗肝組織，收集肝組織懸液入50ml 或15ml無菌離心管中，吸管反覆吹打以離散細胞，50Xg離心5分鐘，沉澱 即為肝實質細胞，取上清液轉入另一離心管(去除肝實質細胞)，500Xg離 心5分鐘，棄上清液，沉澱即為肝非實質細胞，重複上述步驟兩次。將獲得 的肝非實質細胞用含2%FCS的Hank液重懸，與6%的羥乙基澱粉按照4: 1 的體積比混勻，室溫下靜置30分鐘，RBC通過疊連下沉，有核細胞浮於上清 中，取上清於另一離心管中，500g離心5分鐘，棄上清，將沉於管底的細胞 用含2%FCS的Hank液重懸，1500r/min離心5分鐘，同法再洗1次。收集 細胞重懸於完全培養基(DMEM/F12， 10% (體積分數)FCS， 2mmol/L谷胺 醯胺，20mmol/LHEPES)中，反覆吹打使細胞分散成單細胞懸液，取20" L 用於細胞計數及細胞活力測定，最後按1.5Xl(^/cn^接種於25cmn咅養瓶中， 在37"C、 5%(302的培養箱中培養。3天後首次更換培養液，棄去未貼壁細 胞。以後每2 3天換液l次。細胞達到70% 80%融合時，用D-PBS清洗 後，加入lmL質量濃度為0.25%的胰酶(從胰酶配製過程來看，似乎應該是 質量濃度，請發明人校核)，浸沒所有細胞後倒掉，再加入lmL質量濃度為 0.25 %的胰酶，倒去大部分，僅剩少量胰酶覆蓋細胞，在37'C消化1 5分鐘， 鏡下觀察作用程度，及時加入新鮮全培養液終止消化。傳代按1:2 3比例傳代 培養。定期觀察，換液。傳代標記為P1、 P2、 P3等。
(2)誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島0樣細胞分化取第3代以後的達 到80。/。 90X融合之胎肝MSCs，用質量濃度為0.25%的胰酶消化細胞，按1 : 2比例接種於25cn^特殊處理之培養瓶中，每瓶加5mL誘導液(含20M的 TAT-PDX1蛋白及3。/。 5。/。FCS的DMEM/F12培養液)，每8小時一次，連續 4天，然後加入含體積分數為0.1胎牛血清的高糖DMEM/F12培養基中繼續 培養，培養10天以上。
實施例2對實施例1所得胰島樣細胞團的鑑定
(1)誘導前後細胞的形態變化圖1是倒置顯微鏡下所見未誘導的 hFL-MSCs形態圖。圖2是倒置顯微鏡下所見誘導10天後的胰島P樣細胞團 的形態圖。從圖1可以看出未經誘導的MSCs呈長梭形，平行排列；從圖2 可以看出誘導10天的hFLMSCs聚集成胰島樣細胞團。
7(2) 雙硫腙(Dithizone， DTZ)染色
取實施例1所得的胰島樣細胞團，PBS洗2次後，加入5ml PBS和50^1 雙硫腙工作液(V/V， 1%)， 37'C孵育10分鐘，在倒置顯微鏡下觀察並拍照。
胰島3細胞的胞漿中富含鋅離子，鋅離子是形成2-鋅-胰島素六聚體的必 需成分，也是胰島P細胞行使其功能的必要因素之一。DTZ能特異地與鋅離 子鰲合，形成紫紅色的絡合物，是體外鑑定胰島e細胞的方法之一。圖3是倒 置顯微鏡下所見的誘導後所得的胰島P樣細胞團形態圖，圖3顯示誘導後的胰 島樣細胞團被染成棗紅色，說明細胞內富含鋅離子，與胰島e細胞具有相似之 處，也說明這些細胞具備合成、分泌胰島素的前提條件。
(3) 雷射共聚焦顯微鏡觀察胰島素/C-肽的表達
圖4是誘導後所得的胰島P樣細胞團的胰島素陽性表達圖；其中圖a是 C-肽的陽性表達圖；其中圖b是胰島素的陽性表達圖；圖c為胞核被特異性核 染料DAPI染色圖；圖d為圖a、圖b與圖c的合圖。從圖4可以看出，誘導 後的細胞胰島素/C-肽呈陽性表達。
(4) 利用RT-PCR鑑定胰島素相關基因的表達
應用Primer5.0軟1牛設計了 (3-actin， pdx-l， insulin, NeuroD， nkx2.2， pax4， nkx6.1， pax6， isl-l，等引物，由上海生工公司合成，序列如下(各序列表可 見SEQNo.l國16):
基因上遊引物r下遊引物產物大 小(bp)Tm (°C)
pdxlcaa gga ccc atg cgc gtt cca gcggaa etc ctt etc cag etc tag cag ct45459
NeuroDeg cca cga cac gag gaa ttc gcggc atg tec tgg ttc tgc tea gg76658
nkx2.2tgg acg egg tgc aga gec tgcag gtc ctg ggc ttt gag eg51359
pax4cac etc tct gec tga gga cac ggt gactg cct cat tec aag cca tac agt ag44458
nkx6.1aga gag tea ggt caa ggt ctg gttact tgt get tct tea tea get gcg21555
pax6cag tea cag egg agt gaa tea gcgec ate ttg cgt agg ttg ccc tg56256
isl-lcgt ctg att tec eta tgt gtt ggttc ttg ctg aag ccg atg ctg23352
insulinget gca tea gaa gag gec ate agcg tct agt tgc agt agt tct cca g39554
P-actincgt aaa gac etc tat gec aaage cat gec aaa tgt etc at28655
8圖5是RT-PCR鑑定誘導細胞胰島相關基因表達的電泳圖，RT-PCR鑑 定結果顯示誘導細胞在不同時間點序貫表達pdx-l， insulin, NeuroD， nkx2.2， pax4， nkx6.1， pax6， isl-1等基因。其中pdxl是啟動胰島發育的關鍵基因， NeuroD， nkx2.2， pax4， nkx6.1和pax6在胰島前體細胞中有所表達，是胰島 e細胞發育、成熟過程中特徵性的基因；isl-l， insulin是胰島P細胞特徵性表 達的基因；因此，這幾種基因的聯合表達說明誘導的細胞己初步具備了胰島e 細胞的分子特徵。
(5)用放射免疫分析法檢測培養液上清中胰島素的累積分泌量，及葡萄 糖刺激的胰島素分泌的情況
取加入TAT-PDX1蛋白後每天收集的培養液上清，以放射免疫法測定胰島 素累積分泌量。結果加入TAT-PDX1蛋白後，胰島素累積分泌量逐漸增加，而 且隨著時間延長分泌量維持在較高水平(見圖6)。加入葡萄糖刺激後第1周， 細胞對葡萄糖的刺激可以產生反應;第2 4周細胞胰島素基礎分泌量和刺激後
胰島素分泌量均顯著增加，且可以維持在較高水平，提示細胞對葡萄糖的刺激 更加敏感(見圖7)。
實施例3本方法所得的胰島P樣細胞的小鼠腎包膜下移植實驗 取生理鹽水，未誘導的hFLMSCs以及誘導10天的胰島P樣細胞，移植 到糖尿病小鼠腎包膜下。觀察移植後不同細胞對糖尿病小鼠血糖值的影響。圖 8提示胰島e樣細胞移植後糖尿病小鼠血糖明顯下降，且能維持較長時間，而 生理鹽水，未誘導的hFLMSCs移植後對糖尿病小鼠無降糖作用。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
9SEQUENCE LISTING
〈110〉 暨南大學
誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島e樣細胞分化並穩定表達胰島素的方法及其專用誘導液 16
Patent Inversion 3. 3
1
24
■
PDXl上遊引物
1
caa gga ccc atg cgc gtt cca gcg 24
2
26
<212〉 DNA
PDX1下遊引物
〈400〉 2
gaa etc ctt etc cag etc tag cag ct 26
3 <211〉 23 DNA
<213〉 NeuroD上遊引物
〈400〉 3
cgg cca cga cac gag gaa ttc gc 23
4
〈211〉 23
DNA
NeuroD下遊引物
〈400〉 4 ggc atg tcc
tgg ttc tgc tea gg 23
<210〉 5
20
〈212〉 DNA
Nkx2.2上遊引物
5 tgg 3Cg cgg
tgc aga gcc tg 20
6
20
〈212> DNA
Nkx2.
2下遊引物
11 6
cag gtc ctg ggc tU gag eg 20
7
<211〉 26
DNA
Pax4上遊引物
〈400〉 7
cac etc tct gcc tga gga cac ggt ga 26
8
〈211> 26
〈212〉 應
Pax4下遊引物
8
ctg cct cat tec aag cca tac agt ag 26
9
24
DNA
Nkx6. l上遊引物
9
aga gag tea ggt caa ggt ctg gtt 24
12 10 〈211〉 24 〈212〉 DNA
〈213> Nkx6. l下遊引物 10
act tgt get tct tea tea get gcg 24
〈210〉 11
23
<212〉 DNA
〈213〉 Pax6上遊引物
11
cag tea cag egg agt gaa tea gc 23
12
〈211〉 23
〈212> 畫A
〈213〉 Pax6下遊引物
12
gcc ate ttg cgt agg ttg ccc tg 23
〈210> 13 23
〈212> DNA
Isl-l上遊引物
<400〉 13
cgt ctg att tcc cta tgt gtt gg 23
14
<211〉 21
DNA
Isl-l下遊引物
〈400> 14
ttc ttg ctg aag ccg atg ctg 21
〈210〉 15
22
<212〉 醒
Insulin上遊引物
15
get gca tea gaa gag gcc ate a 22
16
25
<212〉 腿
〈213〉 Insulin下遊引物
14 16
gcg tct agt tgc agt agt tct cca g 25
17
20
讓
<213〉 e-actin上遊引物
17
cgt aaa gac etc tat gcc aa 加
〈210〉 18 <211〉 20 DNA
〈213>P-actin下遊引物
<400〉 18
age cat gcc aaa tgt etc at 20
1權利要求
1、一種用於誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島β樣細胞分化的誘導液，其特徵在於是在細胞培養液中添加TAT-PDX1融合蛋白得到的。
2、 根據權利要求1所述的用於誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島5樣細胞分 化的誘導液，其特徵在於所述TAT-PDX1融合蛋白的摩爾濃度為15~25mol/L。
3、 根據權利要求2所述的用於誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島P樣細胞分 化的誘導液，其特徵在於所述細胞培養液為含3%~5%體積濃度胎牛血清的 DMEM/F12培養液。
4、 一種誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島0樣細胞分化並穩定表達胰島素的 方法，其特徵在於包括以下歩驟(1) 分離、純化並傳代擴增人胎肝間充質幹細胞；(2) 將步驟(1)中第3代以後的人胎肝間充質幹細胞，於含權利要求l-3 中任一項所述的誘導液中培養3-5天，然後在高糖DMEM/F12培養基中繼續培 養10天以上即得到胰島0樣細胞團。
5、 根據權利要求4所述誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島P樣細胞分化並穩 定表達胰島素的方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 先採用分步離心法，再用羥乙基澱粉沉降法分離出人胎肝間充質幹細 胞；然後將間充質幹細胞重新懸浮於完全培養基中，反覆吹打使細胞分散成單 細胞懸液，然後接種培養；細胞達到70%~80%融合時，用胰酶進行消化處理， 然後按1 : 2 3比例傳代培養；(2) 取步驟(1)中第3代以後的達到80% 90%融合的人胎肝間充質幹細 胞，消化、接種後，加入權利要求1-3中任一項所述誘導液，每8小時換誘導 液一次，連續4天，然後在含體積分數為10。/。胎牛血清的高糖DMEM/F12培養 基中繼續培養10天以上即得到胰島3樣細胞團。
6、 根據權利要求5所述的誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島P樣細胞分化的 方法，其特徵在於所述步驟(1 )中，所述的完全培養基為含有10% FCS、2mmol/L 谷胺醯胺、20mmol/L HEPES的DMEM/F12培養基。
7、 根據權利要求5所述的誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島P樣細胞分化的 方法，其特徵在於所述步驟(1)中，所述的接種培養是將細胞按1.5X106/cm2接種於25 cm2培養瓶中，在37°C 、 5% C02的培養箱中培養，培養3天後首次 更換培養液，棄去未貼壁細胞，以後每2 3天換液1次。
8、 根據權利要求5所述的誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島P樣細胞分化的方法，其特徵在於所述歩驟(1)中，所述用胰酶進行消化處理包括如下過程加入質量濃度為0.25%的胰酶，浸沒所有細胞後倒掉胰酶，然後再加入上述胰酶， 倒去大部分，僅剩剛好覆蓋細胞的胰酶，在37"C繼續消化1 3分鐘，然後加 入完全培養基終止消化。
9、 根據權利要求5所述的誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島P樣細胞分化的 方法，其特徵在於所述步驟(2)中，所述消化是用質量濃度為0.25 %的胰酶 消化；所述接種是按1 : 2比例接種於25cn^之培養瓶。
10、 根據權利要求9所述的誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島3樣細胞分化 的方法，其特徵在於所述步驟(2)中，所述誘導液的加入量為2ml每瓶。
全文摘要
本發明涉及一種誘導人胎肝間充質幹細胞向胰島β樣細胞分化並穩定表達胰島素的方法及其專用誘導液。本發明所述的方法包括以下步驟分離、純化及擴增人胎肝間充質幹細胞；然後取第3代以後的細胞用專用誘導液誘導，誘導後獲得的胰島β樣細胞團能穩定表達胰島素。所用的誘導液是在細胞培養液中添加TAT-PDX1融合蛋白得到的。本發明的方法在體外將人胎肝間充質幹細胞誘導為能穩定分泌胰島素的胰島β樣細胞。若將所得的胰島β樣細胞移植到糖尿病患者體內可以進一步調節血糖水平，從而實現糖尿病的細胞治療。因此，該領域的研究具有廣闊的臨床應用前景，能帶來較大的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12N5/08GK101580818SQ200910037689
公開日2009年11月18日 申請日期2009年3月9日 優先權日2009年3月9日
發明者鏵 姜, 洹 張, 李東升 申請人:暨南大學;鄖陽醫學院