一種分級沉澱提取糜蛋白酶原的方法
2023-05-18 19:17:16
一種分級沉澱提取糜蛋白酶原的方法
【專利摘要】本發明公開了一種用分級沉澱提取糜蛋白酶原的方法，其原理在於高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化層，降低其溶解度，使之從溶液中沉澱出來。而硫酸銨因其溶解度大，溫度係數小和不易使蛋白質變性而應用最廣。因此，本發明選擇硫酸銨分級沉澱法對糜蛋白酶原提取工藝進行了研究、改進，使得製備糜蛋白酶原的收率提高到0.5％～0.6％。
【專利說明】一種分級沉澱提取糜蛋白酶原的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地說涉及一種應用硫酸銨分級沉澱提高糜蛋白酶原收率的方法。
【背景技術】
[0002]糜蛋白酶原是糜蛋白酶的前體，它屬於絲氨酸蛋白酶，分子量為25000道爾頓。糜蛋白酶又稱胰凝乳蛋白酶，分子量為42000道爾頓，用於肽鏈的酶解，專門水解肽鍵，屬於肽鏈內切酶，水解產率很高，但其專一性小於胰蛋白酶。其固體狀態較穩定，呈白色棒狀結晶；而水溶液極不穩定，pH在5~8時，其活力最強，也最易失去活性。
[0003]糜蛋白酶為胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質，作用、用途與胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力強、毒性低、不良反應小。一般用於手術後創口或創傷癒合、抗炎及防止局部積血、水腫、扭傷血腫、乳房手術後局部腫脹、鼻炎、中耳炎等。也可用於白內障摘除、松解睫狀肌韌帶，以減少膜破裂和視網膜損傷。此外，糜蛋白酶與胰蛋白酶或其他化學藥劑共同治療各種炎症具有協同作用，故常用於外科創傷及眼睛消腫治療。
[0004]本發明人自2008年開始對糜蛋白酶的生產工藝進行試驗研究，特別是在其前體糜蛋白酶原的生產過程中，不斷探索，力求優化完善工藝參數，使糜蛋白酶原收率提高到
生產工藝穩定，質量可控。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種分級沉澱提取糜蛋白酶原的方法，是為了解決糜蛋白酶原提取工藝收率低、活性低的缺點，改進糜蛋白酶原提取的工藝，從而提高收率，減少蛋白活性損失。
[0006]為解決上述技術問題，本發明採用以下技術方案予以實現:
[0007]—種分級沉澱提取糜蛋白酶原的方法，其特徵在於:選用硫酸銨分級沉澱，改進糜蛋白酶原提取工藝，將糜蛋白酶原收率提高到0.5%~0.6%，更好的保持了蛋白的活性。在發明技術方案中，其特徵還在於所述提取工藝包括如下步驟:
[0008]1)原料預處理
[0009]胰臟洗淨後，立即浸入預先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0010]2)蛋白浸潰提取
[0011]2.1)取預處理過的胰臟投入絞肉機中絞碎成胰漿(必要時應絞3次)，加入胰漿2倍量的冰冷硫酸，置冷室中，多次攪拌，浸潰提取。
[0012]2.2)浸潰物過濾後，濾渣再用I倍量的冰冷硫酸重複上述過程，再進行過濾，棄濾渣，合併2次濾液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達到40%飽和度，冷室放置，過夜。
[0013]2.3)虹吸上清液，底層沉澱加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過濾，上清液和濾液合併，得提取液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達到70%飽和度，冷室放置過夜。
[0014]3)分級沉澱[0015]次日上層清液棄去，底層沉澱減壓過濾至幹，加入3倍於濾餅重的冰水使之溶解，重複用硫酸銨40%和70%飽和度分級沉澱。
[0016]4)結晶
[0017]4.1)取第二次70%飽和度沉澱濾餅，加入1.5倍於濾餅重的冰水溶解，並加入0.5倍濾餅重量的飽和硫酸銨溶液，用氫氧化鈉調節PH5.0，於25°C恆溫箱中靜置，保溫，進行結晶。
[0018]4.2)將結晶減壓抽濾，乾燥後得糜蛋白酶原。
[0019]經核算，所得糜蛋白酶收率約為0.5%~0.6%。
[0020]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
[0021]選用硫酸銨分級沉澱提取糜蛋白酶原，可以提高提取糜蛋白酶原的效率，並且使其理化性質和生物活性保持穩定，從而有利於下一步對糜蛋白酶原進行精製，最終使糜蛋白酶的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得糜蛋白酶原收率提高到0.5%~0.6%，節約成本，提高了經濟效益。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，而不以任何方式限制。
[0023]實施例1
[0024]I)原料預處理
[0025]胰臟洗淨後，去掉脂肪、結締組織等雜物，立即浸入預先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0026]2)蛋白浸潰提取
[0027]2.1)將預處理過的胰臟投入絞肉機中絞碎成胰漿，稱重後積滿IOOkg投入反應罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I~2h攪拌I次，浸潰提取24h。
[0028]2.2)浸潰物用粗濾袋(或二層紗布)過濾，濾幹後，得到濾渣86kg。再用86L冰冷硫酸重複上述過程，再進行過濾，棄濾渣，合併2次濾液共270L，加入固體硫酸銨65.34kg,使硫酸銨濃度達到40%飽和度，冷室放置，過夜。
[0029]2.3)虹吸上清液，底層沉澱加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過濾，上清液和濾液合併，得提取液264L，加入固體硫酸銨54.12kg，使硫酸銨濃度達到70%飽和度，冷室放置過夜。
[0030]3)分級沉澱
[0031]次日上層清液棄去，底層沉澱減壓過濾至幹稱重46.68kg，加入140L冰水使之溶解，重複用硫酸銨40%和70%飽和度分級沉澱。
[0032]4)結晶
[0033]4.1)取第二次70%飽和度沉澱濾餅9.6kg，加入14.4L冰水溶解，並加入4.8L飽和硫酸銨溶液，用5mo 1/L氫氧化鈉調節PH5.0,於25°C恆溫箱中靜置，保溫48h進行結晶。
[0034]4. 2)將結晶減壓抽濾，乾燥後得糜蛋白酶原0.55kg。
[0035]經核算，所得糜蛋白酶原收率為0.55%。
[0036]實施例2
[0037]I)原料預處理[0038]胰臟洗淨後，去掉脂肪、結締組織等雜物，立即浸入預先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0039]2)蛋白浸潰提取
[0040]2.1)將預處理過的胰臟投入絞肉機中絞碎成胰漿，稱重後積滿IOOkg投入反應罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I~2h攪拌I次，浸潰提取24h。
[0041]2.2)浸潰物用粗濾袋(或二層紗布)過濾，濾幹後，得到濾渣88kg。再用88L冰冷硫酸重複上述過程，再進行過濾，棄濾渣，合併2次濾液共275L，加入固體硫酸銨66.55kg,使硫酸銨濃度達到40%飽和度，冷室放置，過夜。
[0042]2.3)虹吸上清液，底層沉澱加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過濾，上清液和濾液合併，得提取液268L，加入固體硫酸銨54.94kg，使硫酸銨濃度達到70%飽和度，冷室放置過夜。
[0043]3)分級沉澱
[0044]次日上層清液棄去，底層沉澱減壓過濾至幹稱重48.67kg，加入146L冰水使之溶解，重複用硫酸銨40%和70%飽和度分級沉澱。
[0045]4)結晶
[0046]4.1)取第二次70%飽和度沉澱濾餅9.8kg，加入14.7L冰水溶解，並加入4.9L飽和硫酸銨溶液，用5mol/L氫氧化鈉調節PH5.0,於25°C恆溫箱中靜置，保溫48h進行結晶。
[0047]4.2)將結晶減壓抽濾，乾燥後得糜蛋白酶原0.58kg。
[0048]經核算，所得糜蛋白酶原收率為0.58%。
[0049]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。
【權利要求】
1.一種分級沉澱提取糜蛋白酶原的方法，應用硫酸銨分級沉澱法對糜蛋白酶原提取工藝進行了研究、改進通過工藝參數的研究、改進，提高了蛋白提取的效率，減少了蛋白活性的損失。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述糜蛋白酶原是通過以牛胰或豬胰等為原料，將原料依次經過預處理、蛋白浸潰提取、分級沉澱、結晶製備得到的。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述提取工藝包括如下步驟: (1)胰臟洗淨後，立即浸入預先冰凍好的硫酸溶液保存； (2)將上述胰臟絞成胰漿，加入冰冷硫酸置於冷室中，攪拌後浸潰提取； (3)過濾,濾液中加入硫酸銨,冷室放置過夜後,減壓過濾； (4)硫酸銨分級沉澱後，恆溫箱中靜置結晶，減壓抽濾，得糜蛋白酶原。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，胰臟在絞碎前，始終在冰冷的硫酸溶液中保存。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述硫酸溶液的濃度均為0.0125mol/L。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，為了更好的提取蛋白，硫酸銨沉澱可反覆進 行。
7.如權利要求3所述的方法，其特徵在於對操作的低溫條件要求嚴格，更好的保護蛋白的活性。
8.如權利要求1~6所述的方法，其特徵在於:所得糜蛋白酶原收率提高到0.5%~.0.6%。
【文檔編號】C12N9/76GK103740688SQ201310643457
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月30日 優先權日:2013年11月30日
【發明者】劉乃山, 李靜潔, 劉君, 劉振海 申請人:青島康原藥業有限公司