使用電泳的快速均相免疫測定的製作方法

2023-05-19 14:28:01

專利名稱：使用電泳的快速均相免疫測定的製作方法
使用電泳的快速均相免疫測定
相關申請因此，在本公開中，多相測定包括在檢驗過程期間將抗體-靶蛋白複合物結合到表面，並隨後在測量樣品中蛋白質的量之前清洗 掉任何殘餘的未結合樣品和抗體。在另一方面，均相測定允許樣品和 抗體混合在一起並允許結果在沒有任何結合到表面或者清洗情況下被 測定。每種方法既有明確的益處，也有明確的局限(Ronkainen-Matsuno， 等2002)。均相測定可以是非常快的、容易適應於新的蛋白質和平臺， 並且可以很有成本效益。局限包括潛在的較低特異性和靈敏性。另外， 這些方式一般局限於小的靶抗原。目前檢測和/或測定溶液中分子濃度的方法沒有將短的測定 時間、高的靈敏性和測定較大樣品體積的能力進行結合，所述測定較 大樣品體積的能力是檢測和/或定量以非常低的濃度存在的靶分子所需 要的。在本領域存在提高分子檢測和/或分子濃度測定的分析技術的需 要。
發明概述圖l-在等式中使用的符號列表。在大多數情況下，數量以用 釐米'克'秒為單位(c'g's單位)。圖7A-等式6a將顆粒的斯維德貝格係數(Svedberg Coefficient )定義為它的沉降速度除以離心加速度。圖8B-等式7b從等式6b計算IgG抗體的遷移率。
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圖9-螢光素(a)與第一抗體(b)結合而形成信號產生抗體 (Signal Generating Antibody) (c)。圖不是按比例的，並且單個圖表示 反應中特定成分的存在，不表示每種成分的化學計量的量。

圖10-生物素衍生物(d)與第二抗體(e;)結合而形成捕獲抗體 (f)。圖不是按比例的，單個圖表示在反應中特定成分的存在，不表示 每種成分的化學計量的量。圖15-在每個圖中的深色痕跡代表在捕獲層中生物素化的葡聚糖存在下的FITC標記的中性抗生物素蛋白濃度，而淡色痕跡代表在捕獲層中沒有生物素化的葡聚糖存在下的FITC標記的中性抗生物素蛋白濃度。圖16-來自人IL-6完整夾心測定的劑量反應數據。
雖然以上的實例描述了IL-6的EVEIA技術的應用，但是技術 人員將會意識到所描述的方法、組合物和裝置可以容易地應用於檢測 和/或測定任何選擇的分子的濃度，所述選擇的分子的抗體是商業可得 的或者容易製備的。在要求保護的方法的實踐中應用的、針對各種靶 分子的抗體生成雜交瘤的商業來源，在本領域內是熟知的(例如 American Type Culture Collection, Manassas, VA)。針對實際上任何感興 趣靶的單克隆或者多克隆抗體或者其片段的製備技術也是本領域眾所 周知的，並且可以容易地被技術人員使用，而不需要過多的實驗(參見， 例如，Harlow和Lane， 1988，在此通過引用併入其全部)。
引用的參考文獻 Gold L, Polisky B, Uhlenbeck O， and Yarus M. Diversity of Oligonucleotide Functions. Annual Review of Biochemistry, vol. 64, 1995 (pp 763-797). Harlow， E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988.0077Oda RP and Landers JP. Introduction to Capillary Electrophoresis, in Handbook of Capillary Electrophoresis. Landers JP， editor. CRC Press, 1997 (pp. 1-48).
[0078J Ronkainen隱Matsuno NJ， Thomas JH, Halsall B, Heineman WR. Electrochemical ImmunoAssay Moving into the Fast Lane. Trends in Analytical Chemistry. Vol 21 ， No. 4, 2002 (pp. 213-225).
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10080Shahdeo K and Karnes HT. Combining Immunoassays with Chromatographic and Electrophoretic Separation Techniques — a Review. Mikrochimica Acta ,Vol. 129, 1998 (pp. 19-27).
權利要求
1.一種檢測靶分子的方法，包括a)獲得可能含有所述靶分子的樣品；b)在結合檢測分子的第一結合劑和結合捕獲分子的第二結合劑存在的情況下，對所述樣品進行垂直堆積電泳，其中所述靶分子結合所述第一和第二結合劑而形成複合物；和c)檢測由所述靶分子和第一及第二結合劑形成的所述複合物的存在。
2. 根據權利要求l所述的方法，還包括i)在基本上不帶電荷的聚合物存在下進行所述電泳，所述不帶電 荷的聚合物能夠結合所述捕獲分子而成為所述複合物的部分。
3. 根據權利要求l所述的方法，其中所述結合劑是抗體或者其抗原結合片段。
4. 根據權利要求l所述的方法，其中所述結合劑的一種或者兩種是生物受體或其片段。
5. 根據權利要求3所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
6. 根據權利要求l所述的方法，其中所述靶分子是蛋白質或者多肽。
7. 根據權利要求l所述的方法，其中所述電泳是在最小流體動力學半徑——等於兩倍橫切面面積除以周長——為0.5mm的管、槽或容器 中進行的。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中樣品被裝載在所述管、槽或者容器的頂部，並且所述電泳在密度和/或粘度從所述管、槽或容器的 頂到底部逐漸增加的梯度中進行，所述梯度包括不同密度或粘度 的至少兩個相。
9. 根據權利要求7所述的方法，其中所述樣品被裝載在所述管、槽或者容器的底部或底部附近，並且所述電泳在密度和/或粘度從所述 管、槽或容器的頂到底部逐漸增加的梯度中進行，所述梯度包括 不同密度或粘度的至少兩個相。
10. 根據權利要求8或9所述的方法，其中所述梯度包括樣品層、捕獲 層和堆積層。
11. 根據權利要求10所述的方法，其中所述梯度包括與所述捕獲層混 合的樣品層和堆積層。
12. 根據權利要求10所述的方法，其中所述捕獲分子是生物素，並且 所述電泳在生物素結合蛋白存在的情況下進行。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述生物素結合蛋白選自抗生 物素蛋白、鏈酶抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。
14. 根據權利要求12或13所述的方法，其中所述電泳在結合生物素的 中性聚合物存在下進行。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述複合物包括靶分子，第一 結合劑，第二結合劑，選自抗生物素蛋白、鏈酶抗生物素蛋白或 中性抗生物素蛋白的多價生物素結合劑以及一種或者多種結合生 物素的聚合物。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述複合物的形成導致了質荷 比增加和所述靶分子與複合物的電泳遷移率的降低。
17. 根據權利要求15所述的方法，其中所述複合物形成包括靶分子、 第一結合劑、第二結合劑、多價生物素結合劑和一種或多種結合生物素的聚合物在溶液中自組裝而形成可檢測的低遷移率複合 物。
18. 根據權利要求15所述的方法，其中所述複合物在所述堆積層聚集以增進檢測。
19. 根據權利要求18所述的方法，其中所述複合物在所述堆積層變得基本不動。
20. 根據權利要求18所述的方法，其中不是複合物部分的第一結合劑 遷移穿過所述堆積層並且與所述複合物分離。
21. 根據權利要求l所述的方法，還包括ii) 測量所述複合物中所述檢測分子的量以確定所述樣品中所 述靶分子的濃度。
22. 根據權利要求l所述的方法，其中所述檢測分子是螢光、發光、化 學發光、放射性核或產生螢光、發光、化學發光或者顏色產物的 酶。
23. 檢測靶分子的裝置，包括a) 垂直布置的管、槽或容器，其具有至少0.5 mm的流體動力學 半徑；b) 在所述試管、槽或容器內密度逐漸增加的梯度，所述梯度包括 樣品層、捕獲層和堆積層。
24. 根據權利要求23所述的裝置，還包括i) 靶分子、結合檢測分子的第一結合劑和結合捕獲分子的第二結 合分子，其中所述靶分子、第一和第二結合分子能夠在所述樣品層中 形成複合物；ii) 所述捕獲層中的基本不帶電荷的聚合物，其能夠結合所述捕獲 分子而成為所述複合物的部分。
全文摘要
本發明涉及檢測和/或測定靶分子濃度的方法、組合物和裝置。在優選的實施方式中，所述方法包括允許靶分子形成具有結合到檢測分子的第一結合劑和結合到捕獲分子的第二結合劑的複合物，允許所述複合物進一步與能夠結合到所述捕獲劑、基本上不帶有電荷的聚合物結合，和進行垂直梯度電泳以與未結合靶、第一和第二結合劑以及聚合物分離所述複合物。完整的複合物通過電泳聚集在堆積層並且所述檢測分子被檢測和/或定量。因為複合物含有高質荷比，所以它在堆積層變為基本不動，而未結合成分遷移穿過堆積層並與複合物分離。這提供了非常快速和靈敏的測定，所述測定可以在短時間內檢測非常低濃度的靶分子。
文檔編號G01N33/00GK101680865SQ200880011244
公開日2010年3月24日 申請日期2008年1月31日 優先權日2007年2月7日
發明者B·范特-赫爾, S·P·蒂雷爾 申請人:裡澤爾診斷公司