檢測納米材料細胞毒性的方法
2023-05-19 04:13:46
專利名稱：檢測納米材料細胞毒性的方法
技術領域：
本發明涉及一種毒性檢測方法，特別涉及檢測納米材料細胞毒性的方法。
背景技術：
近年來納米技術、納米材料飛速發展，越來越受到人們的重視。納米材料是指材料 的幾何尺寸達到是納米級尺度水平，包括納米粉，納米線、納米薄膜，並且具有特殊性 能的材料。當粒子的大小進入納米量級後，將表現出強烈的小尺寸效應，表面效應、量 子尺寸等效應，因而與傳統材料相比納米材料的性質發生了很大的變化，其生物效應也 發生了質的轉變。納米材料己經進入我們的生活，甚至進入人體。但是對於納米材料的 危險度的評價信息卻嚴重缺乏。事實上，當今世界上己經有很多國家的政府和科學家注 意並且考慮到這個問題，越來越多的科學研究人員開始關注探討納米尺度物質的生物效 應、對環境和健康的影響問題。在納米材料中，包括碳納米管、碳納米纖維在內的碳納 米材料--直是近年來科學的前沿領域之一。因此，了解碳納米管可能對人和動物健康的 毒性是非常有必要的，研究其可能導致的生物組織的性質的改變及毒性具有相當重要的 科研和實際意義。
近年來各國科學家相繼開展了碳納米管的細胞毒性研究。目前，碳納米管的細胞毒 性研究主要是指示劑染料比色法如四氮甲唑藍(MTT)、乳酸脫氫酶(LDH)、 Alamar 藍、血球計數法等。這些方法通常對實驗操作人員具有很高的要求，操作複雜，操作過 程中有可能對細胞就產生了創傷，靈敏度低，可重複性差，耗時長，用量大，所需器材 繁多，成本高。同時，大量研究發現四氮甲唑藍及四氮甲唑藍還原後的甲瓚(Formazan)、 中性紅、卟啉等染料分子與碳納米管壁之間具有很強的範德華作用力，電子顯微鏡可以 觀察到染料分子吸附在碳管管壁上，從而不能精確檢測到指示劑分子，這就導致了測試 結果的不準確，有可能得到完全相反的結果。
通過以上分析可知，目前檢測納米材料細胞毒性的方法存在的問題還很多，有利於 市場推廣的檢測方法目前尚未有見。
發明內容
本發明的目的在於提供一種檢測納米材料細胞毒性的方法，此方法易於實現檢測的 高通量和高靈敏度，分析速度快，體積小、試樣用量少、成本低並且無須昂貴的生化標記材料、對細胞無創傷性、可以實現在線控制和連續檢測的非標記細胞分析方法。 為達到上述目的，本發明採用以下技術方案 本發明的一種檢測納米材料細胞毒性的方法，其中
(1) 將待檢測細胞種在底部帶有微電子傳感器的若干個孔板上，然後，將孔 板放在細胞分析系統的檢測裝置上；
(2) 監測細胞生長曲線，以得到細胞與孔板的微電極表面貼壁或生長情況；
(3) 在細胞貼壁2 — 30小時後，加入經滅菌處理過的納米材料的培養液或者 緩衝液，繼續監測細胞生長曲線。
本發明的一種檢測納米材料細胞毒性的方法，其中所述孔板的個數為6 — 200個。 本發明的一種檢測納米材料細胞毒性的方法，其中所述待檢測細胞在孔板中的密
度為lxl4-lxl07個/cm2。
本發明的一種檢測納米材料細胞毒性的方法，其中所述納米材料為單壁碳納米管、
多壁碳納米管、碳纖維或石墨。
本發明的一種檢測納米材料細胞毒性的方法，其中所述細胞分析系統為Roche 公司生產的xCELLigence系統。
本發明納米材料毒性檢測方法的優點是全過程自動、實時監測；無需標記；對細 胞無創傷性；高信息含量；高精確性和高重複性；易於操作。並且該方法可用於檢測多 個對象，實現了檢測的高通量和高靈敏度，具有體積小、試樣用量少，成本低廉。本發 明方法的檢測裝置操作簡單、方便，可廣泛用於高通量、高靈敏度的碳納米材料毒性方 面的檢測，加快了分析速度，並且易於實現在線控制和檢測自動化。
圖1為分別加入不同濃度的單壁碳納米管後，Balb/c3T3細胞的生長曲線，反應了 不同濃度的單壁碳納米管對Balb/c3T3細胞的毒性的影響；
圖2為分別加入相同濃度的單壁碳納米管、多壁碳納米管和經賴氨酸修飾的多壁碳 納米管後，Balb/c3T3細胞的生長曲線，反應了相同濃度的單壁碳納米管、多壁碳納米 管和經賴氨酸修飾的多壁碳納米管對Balb/c3T3細胞的毒性的影響。
具體實施例方式
下面將結合實施例參照附圖進行詳細說明，以對本發明方法的目的、特徵和優點有 深入的理解。
下面以實施例說明檢測碳納米材料對細胞毒性的過程，本實施例以碳納米管對
4Balb/c3T3細胞為例進行說明。
所採用的細胞分析系統為Roche公司生產的xCELLigence系統。首先，在底部帶 有微電子細胞傳感器的96孔板上種上密度為lxl0"個/cr^的Balb/c3T3細胞，然後將 孔板放在細胞分析系統的檢測裝置上，細胞會在孔板中的微電極表面貼壁或生長，貼壁 程度緊密與否都會引起微電極阻抗發生變化。因此，黏附在微電極表面的細胞越多，細 胞指數(CI)值越大。同樣，細胞與微電極表面黏附越緊密伸展，電阻抗增加越大。測 量微電極間阻抗可得到細胞在微電極上生長狀態的重要信息。當細胞生物狀態發生變化 時，系統可以實時並自動獲取其模擬電信號，並可以轉換成數位訊號以進行進一步的分 析。細胞與微電極間的相互作用產生的阻抗與孔內細胞數量、細胞形態以及細胞黏附質 量相關，如圖1和圖2的縱坐標所示，阻抗的大小用的細胞指數CI進行衡量，圖l和 圖2的橫坐標表示細胞的生長時間，當細胞貼壁約23小時後，在孔板中加入經過滅菌 的碳納米管的培養液溶液，繼續在細胞分析系統上監測細胞生長曲線。
圖1為在孔板內加入七種不同濃度的單壁碳納米管溶液後，對Balb/c3T3的細胞毒 性作用。由曲線可以看出，不用濃度單壁碳納米管對細胞的生長產生了不同程度的影響， 導致細胞數量、細胞形態及其黏附情況有明顯不同。系統可動態檢測單壁碳納米管的細 胞毒作用及起作用時間。
圖2為在孔板內加入濃度為50ug/ml的單壁碳納米管、多壁碳納米管或經賴氨酸修 飾的多壁碳納米管後，Balb/c3T3細胞的生長曲線，反應出相同濃度的單壁碳納米管、 多壁碳納米管或經賴氨酸修飾的多壁碳納米管對Balb/c3T3的細胞毒性作用大小有明顯 差異，其中最上邊的一條曲線為加有經賴氨酸修飾的多壁碳納米管的Balb/c3T3細胞的 生長曲線；中間的一條為加有多壁碳納米管的Balb/c3T3細胞的生長曲線；最下邊的一 條曲線為加有單壁碳納米管的Balb/c3T3細胞的生長曲線。
以上描述是對本發明的解釋，不是對發明的限定，本發明所限定的範圍參見權利要 求，在不違背本發明的精神的情況下，本發明可以作任何形式的修改。
權利要求
1. 一種檢測納米材料細胞毒性的方法，其特徵在於(1)將待檢測細胞種在底部帶有微電子傳感器的若干個孔板上，然後，將孔板放在細胞分析系統的檢測裝置上；(2)監測細胞生長曲線，以得到細胞與孔板的微電極表面貼壁或生長情況；(3)在細胞貼壁2—30小時後，加入經滅菌處理過的納米材料的培養液，繼續監測細胞生長曲線。
2. 如權利要求2所述的檢測納米材料細胞毒性的方法，其特徵在於所述孔板的個數為6—200個。
3. 如權利要求2所述的檢測納米材料細胞毒性的方法，其特徵在於所述待檢測細胞在孔板中的密度為lxl0、lxl(^個/cm2。
4. 如權利要求l所述的檢測納米材料細胞毒性的方法，其特徵在於所述納米材料為單壁碳納米管、多壁碳納米管、碳纖維或石墨。
5. 如權利要求1所述的檢測納米材料細胞毒性的方法，其特徵在於所述細胞分析系統為Roche公司生產的xCELLigence系統。
全文摘要
本發明涉及一種檢測納米材料細胞毒性的方法，包括將待檢測細胞種在底部帶有微電子傳感器的若干個孔板上，然後，將孔板放在細胞分析系統的檢測裝置上；監測細胞生長曲線，以得到細胞與孔板的微電極表面貼壁或生長情況；在細胞貼壁2-30小時後，加入經滅菌處理過的納米材料的培養液或者緩衝液，繼續監測細胞生長曲線，本發明的檢測納米材料對細胞毒性方法的優點是全過程自動、實時監測；無需標記；對細胞無創傷，該方法可用於檢測多個對象，具有體積小、試樣用量少，成本低廉、檢測裝置操作簡單、方便，可廣泛用於高通量、高靈敏度的碳納米材料毒性方面的檢測，加快了分析速度，並且易於實現在線控制和檢測自動化。
文檔編號C12Q1/18GK101487040SQ200910078298
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月24日 優先權日2009年2月24日
發明者任冬梅, 銘 李, 王軍兵, 董益陽 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院