一株強毒遲緩愛德華氏菌疫苗株及其應用的製作方法

2023-05-18 21:17:26

專利名稱：一株強毒遲緩愛德華氏菌疫苗株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉水產養殖動物的微生物學及免疫學領域，具體涉及一株遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)菌株 1101 及其應用。
背景技術：
遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)由 Hoshina(1962)首次從獲鱺(Anguillajapanica)中分離，是革蘭氏陰性短桿菌，菌體大小約I μ m (直徑)X 2_3 μ m (長度)，兼性厭氧，與鯰魚愛德華氏菌(E.1ctaluri)和保科愛德華氏菌(E.hoshinae)同屬於腸桿菌科愛德華氏菌屬。遲緩愛德華氏菌對多種魚類具有致病性，已報導可感染的魚類有:斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、大口黑魚盧(Micropterus salmoides)、獲鱺(A.japonica)、鯔魚(Mugil cephalus)、犁齒鯛(Evynnis japonica)、羅非魚(Tilapia nilotica)、奇努克鮭魚(Oncorhynchus tshawytscha)、紅鯛(Chrysophrys major)、五條飾(Seriolaquinqueradiata)、牙鮃(Paralichthys olivaceus)、鯉魚(Cyprinus carpio)、海魚盧(Morone saxatilis)、大菱鮃(Scophthalmus maximus)、古月 It (Clarias batrachus)、錦鯉(Anabas testudineus)、歐洲獲(Anguilla anguilla)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、絲足魚(Trichogaster trichopterus)、地圖魚(Astronotus ocellatus)、劍尾魚(Xiphophorushelleri)和斑馬魚(Danio rerio)等。該菌株另也有感染兩棲類(蟾蜍、牛蛙等)、爬行類(蜥蜴、蛇、海龜、中華鱉等)、鳥類(企鵝、禿鷹、鴕鳥及一些水鳥等)、哺乳類(海獅、海牛、豬、狗、牛、猴子等)的報導。除以上動物外，該菌株可感染人類，引起人的腸胃炎、流行性腹瀉和敗血症等症狀。該菌呈世界性分布，普遍存在於淡水和海水環境中，主要分布在中國、澳大利亞、日本、印度、以色列、馬來群島、美國、巴拿馬等熱帶和亞熱帶國家和地區，該菌是當前水產養殖業中的有著極大危害的病原菌之一。以往採用抗生素和化學藥物等方法進行預防或治療，會帶來諸多問題，如病原的耐藥性、藥物殘留、食品安全及環境汙染等問題。近年來，通過發展疫苗免疫技術為基礎的綜合防控技術體系來達到病害控制已被許多國家認可。相對其他常規致病細菌，遲緩愛德華氏菌具有以下兩個特點。首先，遲緩愛德華氏菌菌株的血清型眾多，且目前對該病原的血清分型尚沒有統一標準。Sakazaki (1967)等對256株遲緩愛德華氏菌的抗原結構進行了分析，認定有17個O抗原群和11個H抗原群。Park(1983)等對從鰻魚中分離的445株遲緩愛德華氏菌進行了 O抗原凝集分析，其中有270株被認為屬於不同4個血清群，即A、B、C、D四個血清型，其中主要從腎臟中分離所得的血清型A的致病力最強。此外，遲緩愛德華氏菌是一種胞內寄生菌，已有報導證實該病原可在機體的上皮及巨噬細胞等細胞中生長並繁殖，具有多種逃避機體的免疫殺傷的性能(Janda 等,1991 和 1995 ；Strauss 等，1997 等;Ling 等,2000 ；Rao 等，2001 ;0kuda 等,2006)。以上兩點，給該病原疫苗開發帶來了一定的困難，但多年來，科技工作者仍然做了大量的工作進行遲緩愛德華氏菌不同種類的疫苗的研究嘗試，並取得了一定的成果。

上世紀90年代以來，國內外就開展了許多遲緩愛德華氏菌疫苗的研究工作，不同學者採用各自分離的遲緩愛德華氏菌菌株製備的滅活疫苗所產生的免疫保護力存在相當大的差異。Gutierrez和Miyazaki (1994)用福馬林滅活的遲緩愛德華氏菌SH-89133菌株注射免疫日本鰻的相對保護率(RPS)僅為12.5-25% ;Sun等(2011)報導用遲緩愛德華氏菌TXl菌株的福馬林滅活疫苗免疫牙鮃的RPS只有33.3% ;HoSSain等(2011)進行多種滅活方法製備遲緩愛德華氏菌V-1菌株的免疫原性的比較，其中採用福馬林滅活疫苗通過腹腔注射日本鰻後，其RPS為56 %。近年來，遲緩愛德華氏菌的減毒疫苗研究也在國內外廣泛開展，不同研究者採用各自分離的遲緩愛德華氏菌菌株進行基因敲除，其中一些成果已形成專利。如莫照蘭等(2007,2009)的兩項發明(200710015285.6和200910164591.5)，以野生遲緩愛德華氏菌強毒株LSE40為基礎，進行了 EsrB、AroA基因缺失突變株的構建，分別獲得了兩株單基因缺失和一株雙基因缺失的弱毒疫苗株；張元興等(2009)的發明(200910052707.6)和王啟要等(2010)的發明(201010541646.2)公開了以遲緩愛德華氏菌強毒菌株EIB202為基礎，進行AroC、EseB等三型分泌系統效應元件基因及內源性質粒缺失的突變株構建，獲得了兩株遲緩愛德華氏菌弱毒疫苗株。文獻報導中，有學者進行了遲緩愛德華氏菌基因缺失突變株的弱毒活疫苗的初步應用實驗，如Xiao等(2011)等用構建的14株上述遲緩愛德華氏菌EIB202菌株的基因缺失突變株，肌肉注射免疫斑馬魚，其中的Λ AroC Δ EsrC等2株雙基因缺失突變株和Λ AroC Λ EseBCD Λ EsaC多基因缺失突變株具有較好的免疫保護效果，其RPS值為71.3-81.0%。以上結果也說明針對野生型強致病性遲緩愛德華氏菌為基礎的減毒活疫苗株的開發應用目前已得到了相當的重視。遲緩愛德華氏菌基因缺失突變株的報導也表明，即使對該病原的同一基因進行敲除，所獲得不同菌株的基因缺失突變株半致死劑量(LD50)也有著不同的數值，如Tan等(2005)和上述的Mo等(2007)分別對PPD130/91和LSE40菌株進行了 EsrB基因的敲除，所獲的這兩株單基因缺失突變株表現出約2倍的LD50的差異。抗原的免疫原性對疫苗的免疫效果起著決定性的作用，不同菌株的種株特性是導致菌株差異的重要原因，這也直接對菌株保護性抗原的免疫原性產生影響。目前，對遲緩愛德華氏菌的菌株 之間的差異性研究較少，但已有資料表明該病原在遺傳性、致病性及結構上存在較大差異。遺傳性方面，生物信息學的分析結果表明，遲緩愛德華氏菌1101菌株的16S-23S區間的鹼基序列，與NCBI上已公布的FL6-60等6株遲緩愛德華氏菌有著較大的差異，其同源性在93.2-97.2%之間。已有的報導也證實該病原的鞭毛蛋白存在著一定的遺傳差異性。如Okuda等(2007)研究中通過比較了不同來源的運動性和非運動性遲緩愛德華氏菌的兩種FliC鞭毛蛋白，發現兩者存在22個胺基酸的差異Jiao等(2009)用遲緩愛德華氏菌TXl菌株的FliC鞭毛蛋白基因(GenBank:FJ971660.1)進行了 DNA疫苗的研究，經分析該FIiC基因序列與已報導的EIB202等9株遲緩愛德華氏菌株的相應序列的同源性在95-99%範圍內。致病性方面，不同菌株間的差異較大，如Tan等(2002)在一項不同來源的遲緩愛德華氏菌胞外蛋白的蛋白組學比較分析研究中，以絲足魚為模式動物，進行了包括AL92448菌株等8株弱毒株和AL9379菌株等6株強毒株在內的不同宿主中分離的遲緩愛德華氏菌的致病性比較，結果表明以上14株強弱毒株的LD5tl之間的最大差異竟可達到10000倍；經測試，遲緩愛德華氏菌菌株1101的致病力對海淡水魚類的致病力在1.0父102-9.9父1(^^/^(菌落形成單位/魚體體重)範圍。一些天然野生菌株因其致病性弱，已有學者嘗試將其作為弱毒活疫苗加以應用，孫黎等(2009)的發明(200910230546.5)公開了一種以非致病性的遲緩愛德華氏菌ATCC 15947菌株作為遲緩愛德華氏菌疫苗株的應用，該菌株的LD5tl是典型致病性遲緩愛德華氏菌的50-500倍；Takano等(2010)對日本鰻中分離的5株遲緩愛德華氏菌弱毒株作為活疫苗的免疫效果進行了比較，腹腔注射牙鮃後，其中E22菌株具有相對較好的免疫效果，其RPS可以達到45%。結構差異上，遲緩愛德華氏菌通常都具有周生鞭毛，但Lan等(2007)報導了一株分離自患病大菱鮃中的無鞭毛且具有致病性的遲緩愛德華氏菌菌株LTB-4。上述遲緩愛德華氏菌疫苗報導中針對不同菌株採用相同滅活方法以及相同基因缺失突變後，疫苗的免疫保護效果的差異也應受到這種菌株間的存在的已知及未知差異的影響。總體來說，與其他一些水生動物病原菌相比，研究人員在遲緩愛德華氏菌疫苗的研究中所遇到的困難似乎要大得多，許多研究人員不論採用滅活技術、基因工程技術(DNA疫苗等)、蛋白表達及純化技術(亞單位疫苗)，還是基因敲除的減毒技術，在遲緩愛德華氏菌的疫苗研究中都遇到過大大小小的疫苗保護力偏低的問題。意識到病原材料的具體種株是疫苗研製的關鍵要素，我們從分離到的多株遲緩愛德華氏菌中選擇了遲緩愛德華氏菌1101菌株作為疫苗開發候選株,該菌株分離自海水養殖魚類大菱鮃成魚體中，是一種具有較強毒力的野生菌株，其保藏編號為=CGMCC N0.7197，實驗中用該菌株製備的不論製備的滅活疫苗還是減毒疫苗都能獲得60%以上的免疫保護力，這一結果說明遲緩愛德華氏菌1101菌株具有遲緩愛德華氏菌的免疫保護性抗原，具備適宜用於製備疫苗的能力及疫苗開發的應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種遲緩愛德華氏菌疫苗株及其應用方法，該菌株可用於該病原不同類型疫苗抗原的製備及其免疫技術中的應用。本發明所涉及的菌株信息如下:遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)菌株1101，該菌株最初分離自山東海陽市一海水養殖場海水養殖魚類大菱鮃(Scophthalmusmaximus)成魚體中，是一種具有較強毒力的野生菌株，採用注射攻毒測試方法，對海淡水養殖魚類的半數致死量(LD5tl)在1.0X 102-9.9X 103CFU/g(菌落形成單位/魚體體重)的範圍，菌株的分類命名為:遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda);於2013年I月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏；保藏編號為=CGMCC N0.7197 ;保藏單位地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。遲緩愛德華氏菌菌株1101可培養於Luria-Bertani (LB)、胰大豆蛋白腖培養基(TSB)或2216E海水培養基，培養方法如下:從_80°C保存的菌種中挑取少量劃線於上述培養基的固體平板，培養溫度範圍為28-37 0C。該菌在2216E瓊脂平板中，28 °C培養48h後可形成直徑小於0.5mm的白色細小菌落；在TSB和LB瓊脂平板中，37°C培養36h後可形成直徑約0.5mm的微黃色圓形菌落。取上述單菌落接種於上述培養基的培養液中，28-37°C，180r/min搖瓶培養至OD6tltl為0.5-0.6，即可獲得該菌株的新鮮菌液。遲緩愛德華氏菌菌株1101的抗原包含針對愛德華氏菌的保護性抗原，經實驗證實，該保護性抗原具有良好的免疫原性和高度保守性，對愛德華氏菌的感染具有良好的免疫保護作用，其抗原經不同方法製備後適用於生產愛德華氏菌疫苗，抗原的製備方法可以採用滅活菌體、菌蛻成分、減毒菌株、保護性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因表達載體的表達產物的任何一種或一種以上。其中涉及活疫苗的抗原在免疫應用中，應事先進行充分的安生性評估，以確定其免疫應用中的安全性；生產的疫苗可以是使用該菌株製備的抗原的單一成分，也可以使用該菌株製備的抗原與其他細菌的抗原混合生產聯合疫苗，也可以將製備的單一或聯合疫苗的抗原添加佐劑生產疫苗；生產的疫苗可以採用注射免疫、創傷免疫、浸浴免疫和口服免疫等免疫接種方式。抗原的劑量與免疫效果密切相關，劑量過低，不能誘導足夠強的免疫應答，劑量過高，也可能會導致機體的免疫耐受，另外，抗原在應用中也應考慮諸如動物生長階段、抗原種類、疫苗劑型及接種次數等因素對其劑量需求的影響。因此，在實際免疫應用中，抗原的有效劑量的範圍，應根據實驗數據來進行確定。本發明的遲緩愛德華氏菌菌株1101製備的滅活疫苗注射免疫接種時，可採用腹腔或肌肉注射兩種方式，使用的劑量為IO4-1O8CFU/g(菌落形成單位/魚體體重)；創傷免疫(即將受免疫魚體表進行無菌人工輕微創傷處理，增強魚體對抗原的吸收)或浸浴免疫接種時，浸泡水體中滅活疫苗的濃度為IO5-1O9CFU/mL (菌落形成單位/浸泡水體體積)，浸泡時間2-60min ； 口服免疫接種時，滅活疫苗可添加於配合飼料中，配合飼料中的105-101(lCFU/g(菌落形成單位/飼料重量)，連續投餵14-30天。以上滅活疫苗在使用中，也可根據實際情況對受免疫魚實施加強免疫2-3次，兩次免疫的時間間隔為14-30天。

本發明的遲緩愛德華氏菌菌株1101，其所製備疫苗抗原可應用於魚類、兩棲類和爬行類的免疫接種，包括海水養殖魚類(如牙鮃、大菱鮃、半滑舌鰨、石斑魚、鱸魚、真鯛、軍曹魚、大西洋鮭、河純等)、半鹹水養殖魚類(如羅非魚、虹鱒、鯔魚等)、洄遊魚類(如鰻鱺、小黃魚等)、淡水養殖魚類(如青魚、鰱魚、鱅魚、鯉魚、鯽魚、鯰魚、鱖魚、鱘魚、澳洲寶石鱸等)、觀賞魚(如金魚、錦鯉等)、兩棲類(如牛蛙、大鯢等)和爬行類(如鱉、龜、蛇等)的疫苗接種。不同的水生動物的抗原的免疫劑量有所不同，對於特定水生動物及特定抗原的在使用中的具體劑量，應該進行單獨測試。本發明的積極效果在於:本發明找到了具有較高毒力的遲緩愛德華氏菌菌株1101，該菌株的抗原包含針對愛德華氏菌的保護性抗原，適合用於製備愛德華氏菌的各類疫苗抗原，用1101菌株製備的疫苗可通過注射、浸泡或口服途徑對愛德華氏菌感染具有良好的免疫保護作用，適於用作疫苗的生產和應用。遲緩愛德華氏菌對多種抗生素的抗藥性較強，本發明所涉及的遲緩愛德華氏菌1101菌株的特徵使其具有針對愛德華氏菌疫苗的開發應用價值，其疫苗產品可對養殖魚類的愛德華氏病進行有效安全預防，降低水產養殖業中因病害所導致的損失，減少或消除由於愛德華氏菌病發生所致的消毒劑、抗生素等化學藥物的濫用，顯著提高水產養殖動物及其產品的安全，以及病原菌抗藥性增加所帶來的生物安全風險。


圖1.是遲緩愛德華氏菌菌株1101的16SrRNA序列系統發育樹。圖2.是遲緩愛德華氏菌菌株1101的16S-23S rRNA區間序列系統發育樹。
具體實施方式
實施例1:從大菱鮃中分離遲緩愛德華氏菌菌株1101的分離挑選出患出血病症狀典型的瀕死大菱鮃，用70%酒精棉球對病魚體表進行消毒，用無菌剪刀剪開腹腔並取出病魚肝、腎、脾等組織小塊(約0.2X0.2X0.2cm3)於ImL無菌離心管中，在超淨工作檯上用無菌PBS(pH7.2)反覆衝洗，用接種環蘸取上述病灶組織，劃線接種於添加2%瓊脂的海水2216E培養基(酵母提取物lg，胰化蛋白腖5g，FePO40.lg，海水定容至1L，pH7.6-7.8)，28°C培養24_48h，從平板上挑取優勢菌落中的單菌落，再次進行平板劃線，進行純化培養。純化後的菌落可進行細菌形態特徵，生理生化特性檢測及分子生物學的鑑定。實施例2:遲緩愛德華氏菌菌株1101的培養遲緩愛德華氏菌菌株1101可培養於LB培養基(胰化蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去離子水定容至lL，pH7.0)、TSB培養基(北京陸橋技術有限責任公司)或2216E培養基(根據培養基成分中海水的有無，該培養基分為兩種，其一:同實施例1 ;其二:酵母提取物lg，胰化蛋白腖5g，FePO40.lg, NaCl 34g，去離子水定容至1L，pH7.6-7.8)，上述培養基的固體平板的配製中則需要另外添加2%瓊脂。菌株培養方法如下:從_80°C保存的菌種中挑取少量劃線於上述培養基的固體平板，在28-37°C培養24-48h，即可在平板上獲得單克隆菌落，取一單菌落接種於上述培養基的培養液中，28-37°C，180r/min搖瓶培養至0D_為0.5-0.6，即可獲得該菌株的新鮮菌液。實施例3:遲緩愛德華氏菌菌株1101的生理生化特徵遲緩愛德華氏菌菌株1101的生理生化試驗，參照API20E (法國梅裡埃公司)自動鑑定卡使用說明進行鑑定，結果用Apilab plus3.3.3軟體進行分析。另附加氧化酶試驗，並按東秀珠等(2001)所述測定生理生化方法進行補充鑑定。試驗結果表明氧化酶陰性，API20E自動鑑定卡鑑定結果如表I所示，顯示菌株1101為遲緩愛德華氏菌，可信度為99%。表I遲緩愛德華氏菌1101菌株API20E生化鑑定結果
權利要求
1.一株遲緩愛德華氏菌菌株1101，其特徵是所述菌株為分離自海水養殖魚類的野生菌株遲緩愛德華氏菌菌株1101，其保藏編號為=CGMCC No. 7197。
2.如權利要求I所述的遲緩愛德華氏菌菌株1101，其特徵在於所述菌株的16srRNA、EsrB、HlyB基因上遊鹼基序列和16s_23s r RNA區間鹼基序列如SEQ ID NO USEQ ID NO:2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示，這些基因具有該菌株的特徵性。
3.如權利要求I所述的遲緩愛德華氏菌菌株1101，其特徵在於所述菌株對海淡水魚類具有較強的致病性，注射攻毒的半數致死量在I. OX 102-9. 9X 103CFU/g的範圍。
4.如權利要求I所述的遲緩愛德華氏菌菌株1101，其特徵是該菌株可培養於LB、TSB或2216E培養基，培養方法如下從保存的菌種中挑取少量劃線於上述培養基的固體平板，培養溫度範圍為28-37°C，在2216E瓊脂平板中，28°C培養48h後可形成直徑小於O. 5mm的白色細小菌落；在TSB和LB瓊脂平板中，37 °C培養36h後可形成直徑約O. 5mm的微黃色圓形菌落，將單菌落接種於上述培養基的培養液中，28-37°C，180r/min搖瓶培養至OD6tltl為O. 5-0. 6獲得該菌株的新鮮菌液。
5.權利要求I所述的遲緩愛德華氏菌菌株1101的應用，其特徵是該菌株的抗原包含針對愛德華氏菌保護性抗原，該保護性抗原具有良好的免疫原性和高度保守性，用該菌株製備的抗原經免疫接種後對愛德華氏菌感染具有良好的免疫保護作用，該菌株適用於生產愛德華氏菌的疫苗。
6.權利要求5所述的遲緩愛德華氏菌菌株1101的應用，其特徵在於所述的抗原的製備方法包括滅活菌體、菌蛻成分、減毒菌株、保護性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因表達載體的表達產物的任何一種或一種以上。
7.權利要求5所述的遲緩愛德華氏菌菌株1101的應用，其特徵在於生產的疫苗可以是使用該菌株製備的抗原的單一成分，也可以使用該菌株製備的抗原與其他細菌的抗原混合生產聯合疫苗，也可以將製備的單一或聯合疫苗的抗原添加佐劑生產疫苗。
8.權利要求5所述的遲緩愛德華氏菌菌株1101的應用，其特徵在於所生產的疫苗採用注射免疫、創傷免疫、浸浴免疫和口服免疫等免疫接種方式。
9.如權利要求7所述的遲緩愛德華氏菌菌株1101的應用，其特徵在於所生產的滅活疫苗注射免疫接種時，可採用腹腔或肌肉注射兩種方式，使用的劑量為104-108CFU/g ;創傷免疫或浸浴免疫接種時，浸泡水體中滅活疫苗的濃度為IO5-109CFUAiL，浸泡時間2-60min ；口服免疫接種時，滅活疫苗可添加於配合飼料中，配合飼料中的IO5 — 101(lCFU/g，連續投餵14-30 天。
10.權利要求I所述的遲緩愛德華氏菌株1101在製備預防愛德華氏菌感染的藥物中的應用，所述藥物免疫接種的對象包括海水養殖魚類、半鹹水養殖魚類、洄遊魚類、淡水養殖魚類、觀賞魚類、淡水養殖的兩棲類和爬行類。
全文摘要
本發明涉及一株遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)菌株及其應用方法，該菌株分離自大菱鮃成魚體中，是一種具有較強毒力的野生菌株，其保藏編號為CGMCC No.7197。該菌株抗原的製備方式包括滅活菌體、菌蛻成分、減毒菌株、保護性抗原、抗原亞單位、抗原決定簇或抗原基因表達載體的表達產物的任何一種或一種以上；生產的疫苗可以是使用該菌株製備的抗原的單一成分，也可以使用該菌株製備的抗原與其他細菌的抗原混合生產聯合疫苗，也可以將製備的單一或聯合疫苗的抗原添加佐劑生產疫苗；免疫應用中疫苗的接種方式可以採用注射免疫、創傷免疫、浸浴免疫或口服免疫。
文檔編號A61P31/04GK103255089SQ201310159240
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月3日 優先權日2013年5月3日
發明者黃倢, 謝國駟, 王秀華, 隋虎辰, 楊春志, 邊慧慧, 史成銀, 張慶利, 許華, 劉莉 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所