一種可塑性人工骨及其製備方法與流程
2023-05-19 09:22:31 2
本發明涉及複合生物材料，具體為一種可塑性人工骨及其製備方法。
背景技術：
硬組織(骨、牙)替代材料是生物材料的一大類，在生物材料產業中，涉及硬組織修復和替代材料的約佔20％。對於中國這一人口大國來講，潛在的巨大需求是顯而易見的。此外，我國正步入老年人社會，60歲以上的老年人口已達1.4億，年老引起的機體組織，特別是硬組織病變，如骨質疏鬆，需要大量的骨替代材料以用於臨床治療。因此，該領域的研究具有深遠的社會影響和巨大的經濟效益。
目前骨組織工程支架材料主要有兩類；一類是生物衍生材料，由生物組織通過一系列理化方法處理而製得，包括天然骨、膠原、珊瑚骨、殼聚糖等；另一類為人工合成材料，包括羥基磷灰石、鈣磷陶瓷、生物活性玻璃、聚酯類等。生物衍生材料具有來源豐富、造價低及有天然的網狀空隙結構等優點，越來越受到人們的重視。目前國內市場骨修復產品主要包括磷酸三鈣、羥基磷灰石、i型膠原蛋白/羥基磷灰石複合物等，尚無β-tcp/膠原複合骨修復材料問世。國外市場骨修復產品種類較為豐富，其中integra公司的ososteoconductivescaffold和stryker公司(世界上最大的骨科產品生產商)的vitossbonegraftsubstitute產品，為β-tcp/膠原複合骨修復材料。
人體骨中含有水、有機相和無機相等成分。其中無機相主要為磷灰石等磷酸鈣類礦物相，約佔60～70％；有機相包括90～95％的膠原蛋白、1％的粘多糖及5％的其它蛋白質。骨的基本結構單元就是礦化的膠原纖維，天然骨可以簡單的看成是膠原和羥基磷灰石(hap)在一定微觀程度上的有序排列。hap作為人體骨組織中的主要無機成分，是骨組織修復領域中的研究熱點。hap具有良好的組織相容性、骨傳導性、高度的生物活性等特性。但其本身也存在脆性大、硬度低、韌性差、不易降解等不足。β-磷酸三鈣(β-tcp)物理、化學性能和生物相容性與羥基磷灰石相似，具有良好的骨結合性、降解性和骨傳導性，因此在骨組織修復領域同樣備受重視，是另一種廣泛應用的硬組織替代材料。與hap相比，其最重要的特點在於β-tcp被吸收後可為人體自身組織所替代。
hap和β-tcp在體內可以與骨組織交互作用，參與骨骼的生長，但是hap和β-tcp通常是以粉末狀進行填充，體液或血液的流動會將這些粉末衝離骨缺損部位，植入效果就會大大折扣。現有技術中，一些研究者將hap和β-tcp製成多孔材料，燒結成各種形狀及大小的材料，解決了容易被衝離骨缺損部位的缺陷，但是機械強度隨著孔隙率和孔尺寸的增加而顯著下降，尤其對於孔徑大於100μm的陶瓷來說，承重是個大問題，而且多孔陶瓷的尺寸大小和形狀不可能與骨缺損區域的尺寸完全吻合，因此在手術時為了二者儘量密合，需要挖大傷口或修剪植入材料，不僅對病患傷口造成二次傷害，而且延長了手術時間，患處與植入材料間所存留的一些間隙，也會妨礙骨癒合的進程。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是克服現有的hap和β-tcp生物陶瓷材料臨床應用中尺寸不能與預期的尺寸完全吻合從而造成手術時間的延長及對病患傷口的二次傷害，而且患處與植入材料間所存留的一些間隙，更會使骨癒合因此受到阻礙的缺陷，提供一種可塑性人工骨及其製備方法。
為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：
一種可塑性人工骨，包括50wt％～90wt％的多孔磷酸鈣陶瓷和50wt％～10wt％的可溶性膠原蛋白，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。該可塑性人工骨以多孔磷酸鈣陶瓷為基體，以膠原蛋白為增韌補強項。進一步的多孔磷酸鈣陶瓷的總體孔隙率為60％～95％。多孔磷酸鈣陶瓷的大孔孔徑為100～500微米，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內壁布滿毛細微孔。
進一步的，多孔磷酸鈣陶瓷的成分為羥基磷灰石、β-磷酸三鈣或雙相磷酸鈣陶瓷，膠原蛋白為i型膠原蛋白；膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。
一種可塑性人工骨的製備方法，包括以下步驟：
(1)、陶瓷預處理：將多孔磷酸鈣陶瓷浸入75％乙醇溶液中超聲漂洗0.5～2h，更換漂洗液，重複漂洗一次，隨後用去離子水超聲漂洗，浸泡過夜後用去離子水重複漂洗，將充分漂洗的多孔磷酸鈣陶充分烘乾後置於200～250℃下滅菌120～240min；
(2)膠原預處理a：取可溶性膠原蛋白，按15g～25g溶解至1kg的比例用注射用水溶解均勻，於100～105℃加熱1～4h，直至膠原蛋白完全液化成流體狀，得預處理膠原a；
(3)膠原預處理b：取可溶性膠原蛋白，稀釋成3-5mg/ml濃度的膠原液，取3～5l15℃以下連續攪拌30min以上。邊攪拌邊加入1l0.1mpbs溶液，膠原液和pbs溶液的體積比為3:1-5:1，然後用0.1mnaoh調節ph至4.5～8.5，將膠原轉入烘箱，保持箱體內部溫度在35±3℃，保溫15～36h，將膠原攪拌打散，離心8～15min，去上清液，收集沉澱，再將收集的沉澱加注射用水復溶，再離心8～15min，去上清液，收集沉澱，重複數次，將所得沉澱加注射水至總重0.15kg，攪拌使得沉澱溶解均勻，裝入透析袋中，用注射水透析，每隔3～5h換水一次，換水次數為4～5次，保持透析液的溫度在15℃以下，透析完後，收集膠原液，保持膠原濃度約為15mg/ml～25mg/ml，得預處理膠原b；
(4)陶瓷塗層：將30g多孔磷酸鈣陶瓷置於20～50ml預處理膠原a中浸潤，常溫下抽真空至-0.1mpa塗層0.5-3h，保壓1-3h，再經超聲波震蕩攪拌10～25min，重複抽真空負壓塗層一次，將塗層好的陶瓷冷凍乾燥；
(5)將預處理膠原b稀釋至10～18mg/ml，將塗層好的多孔磷酸鈣陶分散成均勻顆粒，均勻分散於10～18mg/ml的預處理膠原b中，然後冷凍乾燥；
(6)真空熱交聯或edc/nhs交聯，即得可塑性人工骨。真空熱交聯的方法為將冷凍乾燥後的樣品於110℃～125℃乾燥48～72h。edc/nhs交聯的方法為先配置0.5～10mm的edc/nhs交聯液，將冷凍乾燥後的樣品放入交聯液中交聯12～36h，取出材料，冷凍乾燥。
本發明採用50wt％～90wt％的多孔磷酸鈣陶瓷模擬骨組織的無機成分和50wt％～10wt％的可溶性膠原蛋白骨組織的有機成分，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成一種適合人類細胞生長的三維膠原蛋白纖維網狀結構；多孔磷酸鈣溶解度大，比表面積大，易於降解，有利於新生細胞的吸附和血管的長入，從而具有良好的生物相容性，尤其是同骨髓基質幹細胞有良好的相容性。多孔磷酸鈣作為骨形成的支架，同時對骨細胞亦具有引導作用。膠原蛋白表面富含沉積礦物的位點，可有效引發和控制礦化過程、促進骨形成，使得肉芽組織長入植入物中，並向成纖維細胞和成骨細胞提供營養，同時可作為生物陶瓷粉體的賦形劑，構成植入材料的連續相，材料降解性能雙向可調，具有良好的微觀結構與宏觀可塑性。將本發明的可塑性人骨應用於骨缺損部位，能有效引導並加速骨組織的修復。
本發明通過膠原預處理a減弱基質金屬蛋白酶(mmp-2和mmp-9)和基質溶素(stromelysins和matrilysin)對於創傷的負面影響，通過膠原預處理b增強可塑性人骨的機械強度；然後通過先塗層後凍幹交聯的方式，使得可塑性人骨具備了均一的三維結構，能更好的引導並加速骨組織的修復。
具體實施方式
以下對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用於說明和解釋本發明，並不用於限定本發明。
實施例1
一種可塑性人工骨，包括50wt％的多孔磷酸鈣陶瓷和50wt％的可溶性膠原蛋白，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。多孔磷酸鈣陶瓷的總體孔隙率為95％。多孔磷酸鈣陶瓷的大孔孔徑為100微米左右，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內壁布滿毛細微孔。
多孔磷酸鈣陶瓷的成分為羥基磷灰石，膠原蛋白為i型膠原蛋白；膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。
一種可塑性人工骨的製備方法，包括以下步驟：
(1)、陶瓷預處理：將多孔磷酸鈣陶瓷浸入75％乙醇溶液中超聲漂洗0.5h，更換漂洗液，重複漂洗一次，隨後用去離子水超聲漂洗，浸泡過夜後用去離子水重複漂洗，將充分漂洗的多孔磷酸鈣陶充分烘乾後置於200℃下滅菌240min；
(2)膠原預處理a：取可溶性膠原蛋白，按15g溶解至1kg的比例用注射用水溶解均勻，於100℃加熱1h，直至膠原蛋白完全液化成流體狀，得預處理膠原a；
(3)膠原預處理b：取可溶性膠原蛋白，溶解為3mg/ml濃度的膠原液，取3l15℃以下連續攪拌30min以上。邊攪拌邊加入1l0.1mpbs溶液，膠原液和pbs溶液的體積比為3:1，然後用0.1mnaoh調節ph至4.5，將膠原轉入烘箱，保持箱體內部溫度在32℃，保溫36h，將膠原攪拌打散，以5500r/min轉速離心8min，去上清液，收集沉澱，再將收集的沉澱加注射用水復溶，再以5500r/min轉速離心15min，去上清液，收集沉澱，重複數次，將所得沉澱加注射水至總重0.15kg，攪拌使得沉澱溶解均勻，裝入透析袋中，用注射水透析，每隔3h換水一次，換水次數為4次，保持透析液的溫度在15℃以下，透析完後，收集膠原液，保持膠原濃度約為15mg/ml，得預處理膠原b；
(4)陶瓷塗層：將30g多孔磷酸鈣陶瓷置於20ml預處理膠原a中浸潤，常溫下抽真空至-0.1mpa塗層0.5h，保壓1h，再經超聲波震蕩攪拌10min，重複抽真空負壓塗層一次，將塗層好的陶瓷冷凍乾燥；
(5)將預處理膠原b稀釋至10mg/ml，將塗層好的多孔磷酸鈣陶分散成均勻顆粒，均勻分散於10mg/ml的預處理膠原b中，然後冷凍乾燥；
(6)配置0.5mm的edc/nhs交聯液，將冷凍乾燥後的樣品放入交聯液中交聯24h，取出材料，冷凍乾燥。
實施例2
一種可塑性人工骨，包括90％wt％的多孔磷酸鈣陶瓷和10wt％的可溶性膠原蛋白，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。多孔磷酸鈣陶瓷的總體孔隙率為60％。多孔磷酸鈣陶瓷的大孔孔徑為500微米，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內壁布滿毛細微孔。
多孔磷酸鈣陶瓷的成分為β-磷酸三鈣，膠原蛋白為i型膠原蛋白；膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。
一種可塑性人工骨的製備方法，包括以下步驟：
(1)、陶瓷預處理：將多孔磷酸鈣陶瓷浸入75％乙醇溶液中超聲漂洗2h，更換漂洗液，重複漂洗一次，隨後用去離子水超聲漂洗，浸泡過夜後用去離子水重複漂洗，將充分漂洗的多孔磷酸鈣陶充分烘乾後置於250℃下滅菌120min；
(2)膠原預處理a：取可溶性膠原蛋白，按25g溶解至1kg的比例用注射用水溶解均勻，於105℃加熱4h，直至膠原蛋白完全液化成流體狀，得預處理膠原a；
(3)膠原預處理b：取可溶性膠原蛋白，溶解為5mg/ml濃度的膠原液，取5l15℃以下連續攪拌30min以上。邊攪拌邊加入1l0.1mpbs溶液，膠原液和pbs溶液的體積比為5:1，然後用0.1mnaoh調節ph至8.5，將膠原轉入烘箱，保持箱體內部溫度在38℃，保溫20h，將膠原攪拌打散，以5500r/min轉速離心15min，去上清液，收集沉澱，再將收集的沉澱加注射用水復溶，再以5500r/min轉速離心8min，去上清液，收集沉澱，重複數次，將所得沉澱加注射水至總重0.15kg，攪拌使得沉澱溶解均勻，裝入透析袋中，用注射水透析，每隔3h換水一次，換水次數為5次，保持透析液的溫度在15℃以下，透析完後，收集膠原液，保持膠原濃度約為25mg/ml，得預處理膠原b；
(4)陶瓷塗層：將30g多孔磷酸鈣陶瓷置於50ml預處理膠原a中浸潤，常溫下抽真空至-0.1mpa塗層3h，保壓3h，再經超聲波震蕩攪拌25min，重複抽真空負壓塗層一次，將塗層好的陶瓷冷凍乾燥；
(5)將預處理膠原b稀釋至18mg/ml，將塗層好的多孔磷酸鈣陶分散成均勻顆粒，均勻分散於18mg/ml的預處理膠原b中，然後冷凍乾燥；
(6)配置0.5mm的edc/nhs交聯液，將冷凍乾燥後的樣品放入交聯液中交聯24h，取出材料，冷凍乾燥。
實施例3
一種可塑性人工骨，包括70wt％的多孔磷酸鈣陶瓷和30wt％的可溶性膠原蛋白，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。該可塑性人工骨以多孔磷酸鈣陶瓷為基體，以膠原蛋白為增韌補強項。多孔磷酸鈣陶瓷的總體孔隙率為75％。多孔磷酸鈣陶瓷的大孔孔徑為300微米，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內壁布滿毛細微孔。
進一步的，多孔磷酸鈣陶瓷的成分為羥基磷灰石、β-磷酸三鈣或雙相磷酸鈣陶瓷，膠原蛋白為i型膠原蛋白；膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網狀結構。
一種可塑性人工骨的製備方法，包括以下步驟：
(1)、陶瓷預處理：將多孔磷酸鈣陶瓷浸入75％乙醇溶液中超聲漂洗1h，更換漂洗液，重複漂洗一次，隨後用去離子水超聲漂洗，浸泡過夜後用去離子水重複漂洗，將充分漂洗的多孔磷酸鈣陶充分烘乾後置於200℃下滅菌240min；
(2)膠原預處理a：取可溶性膠原蛋白，按22g溶解至1kg的比例用注射用水溶解均勻，於102℃加熱1.5h，直至膠原蛋白完全液化成流體狀，得預處理膠原a；
(3)膠原預處理b：取可溶性膠原蛋白，溶解為4mg/ml濃度的膠原液，取4l15℃以下連續攪拌30min以上。邊攪拌邊加入1l0.1mpbs溶液，膠原液和pbs溶液的體積比為4:1，然後用0.1mnaoh調節ph至7，將膠原轉入烘箱，保持箱體內部溫度在35℃，保溫22h，將膠原攪拌打散，以5500r/min轉速離心12min，去上清液，收集沉澱，再將收集的沉澱加注射用水復溶，再以5500r/min轉速離心10min，去上清液，收集沉澱，重複數次，將所得沉澱加注射水至總重0.15kg，攪拌使得沉澱溶解均勻，裝入透析袋中，用注射水透析，每隔3h換水一次，換水次數為4次，保持透析液的溫度在15℃以下，透析完後，收集膠原液，保持膠原濃度約為22mg/ml，得預處理膠原b；
(4)陶瓷塗層：將30g多孔磷酸鈣陶瓷置於35ml預處理膠原a中浸潤，常溫下抽真空至-0.1mpa塗層1h，保壓2h，再經超聲波震蕩攪拌15min，重複抽真空負壓塗層一次，將塗層好的陶瓷冷凍乾燥；
(5)將預處理膠原b稀釋至14mg/ml，將塗層好的多孔磷酸鈣陶分散成均勻顆粒，均勻分散於14mg/ml的預處理膠原b中，然後冷凍乾燥；
(6)配置5mm的edc/nhs交聯液，將冷凍乾燥後的樣品放入交聯液中交聯12h，取出材料，冷凍乾燥。
最後應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。