用不溶性載體粒子的免疫測定方法及其試劑的製作方法

2023-05-19 10:25:46 7

專利名稱：用不溶性載體粒子的免疫測定方法及其試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用不溶性載體粒子的免疫測定方法，含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑以及使含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑穩定化的方法。
本發明的目的是提供測定值準確性和可靠性高的能長期保存的含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑、使用該試劑的免疫測定方法以及使該試劑穩定化的方法。
上述的生物化學用緩衝劑可以列舉出咪唑緩衝劑、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩衝劑、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝劑、鹽酸-巴比妥鈉-醋酸鈉緩衝劑、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩衝劑、磷酸二氫鉀-硼砂緩衝劑、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝劑、鹽酸-三甲吡啶緩衝劑、鹽酸-巴比妥鈉緩衝劑、鹽酸-三(羥甲基)氨基甲烷緩衝劑、鹽酸-硼砂緩衝劑、硼酸-碳酸鈉緩衝劑、硼酸-硼砂緩衝劑、鹽酸-氨甲基丙二醇緩衝劑、氯化銨-氨緩衝劑、甘氨酸-氫氧化鈉緩衝劑、硼酸-氫氧化鈉緩衝劑、鹽酸-二甲基甘氨酸鈉緩衝劑、硼砂-氫氧化鈉緩衝劑、硼砂-碳酸鈉緩衝劑、甘氨酸-氯化鈉-鹽酸緩衝劑、檸檬酸氫二鈉-鹽酸緩衝劑、檸檬酸氫二鈉-氫氧化鈉緩衝劑、硼砂-氯化鈉緩衝劑、巴比妥鈉-醋酸鈉-鹽酸緩衝劑、硼酸-氯化鉀-氫氧化鈉緩衝劑、三-馬來酸緩衝劑、馬來酸鹽緩衝劑、巴比妥-醋酸鹽緩衝劑、巴比妥緩衝劑、Michaelis緩衝劑、Clark-Lubs』緩衝劑、Atkins-Pantin緩衝劑、Paritish緩衝劑、Kolthoff’s緩衝劑、MacIlvaine緩衝劑、Hasting-Sendroi緩衝劑、Britton-Robinson緩衝劑、Sorensen緩衝劑等。
上述的有機氨類緩衝劑可以列舉出二乙醇氨緩衝劑、2-乙氨基乙醇緩衝劑、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩衝劑、N-甲基-D-葡萄糖胺緩衝劑等。
上述的good’s緩衝劑可以列舉出MES(2-嗎啉基乙烷磺酸)緩衝劑、二-三[二(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷]緩衝劑、ADA[N-(2-乙醯胺)亞氨基二醋酸]緩衝劑、PIPES[哌嗪-N，N』-二(2-乙磺酸)]緩衝劑、ACES{2-[N-(2-乙醯胺)氨基]乙磺酸}緩衝劑、MOPSO(3-嗎啉基-2-羥丙烷磺酸)緩衝劑、BES{2-[N，N-二(2-羥乙基)氨基]乙磺酸}緩衝劑、MOPS(3-嗎啉基丙磺酸)緩衝劑、TES＜2-{N-[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸＞緩衝劑、HEPES[N-(2-羥乙基)-N』-(2-磺乙基)哌嗪]緩衝劑、DIPSO{3-[N，N-二(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸}緩衝劑、TAPSO＜2-羥基-3-{[N-三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸＞緩衝劑、POPSO[哌嗪-N，N』-二(2-羥丙烷-3-磺酸)]緩衝劑、HEPPSO[N-(2-羥乙基)-N』-(2-羥基-3-磺丙基)哌嗪]緩衝劑、EPPS[N-(2-羥乙基)-N』-(3-磺丙基)哌嗪]緩衝劑、麥黃酮[N-三(羥甲基)甲基甘氨酸]緩衝劑、N-二(羥乙基)甘氨酸[N，N-二(2-羥乙基)甘氨酸]緩衝劑、TAPS{3-[N-三(羥甲基)甲基]氨基丙磺酸}緩衝劑、CHES[2-(N-環己氨基)乙磺酸]緩衝劑、CAPSO[3-(N-環己氨基)-2-羥基丙磺酸]緩衝劑、CAPS[3-(N-環己氨基)丙磺酸]緩衝劑等。
另外，本發明中的在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑為碳酸類緩衝劑以外的緩衝劑。此處，碳酸類緩衝劑為以碳酸鹽為基礎的緩衝劑，所說的碳酸類緩衝劑可以列舉出如碳酸鈉-碳酸氫鈉類緩衝劑、碳酸鉀-碳酸氫鉀類緩衝劑等。
對在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑的濃度沒有特別的限制，優選濃度在0.1mmol/L～500mmol/L，更優選濃度在1mmol/L～100mmol/L，特別優選濃度在5～50mmol/L。
本發明中，解離碳酸氫根離子的碳酸化合物若是釋放碳酸氫根離子的化合物，則沒有特別限制，可以列舉出鹼金屬化合物或鹼土類金屬化合物等。具體可以列舉如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鎂、碳酸氫鈣等，特別優選碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等鹼金屬化合物。
另外，解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的濃度沒有特別限制，優選濃度在0.05～500mmol/L，更優選濃度在0.1mmol/L～100mmol/L，特別優選濃度在1～50mmol/L。
本發明中的水性介質可以列舉出水、更具體可以列舉精製水，根據需要也可含有酶、輔酶、氯化鈉等可溶性鹽類、Triton X-100、吐溫20等表面活性劑、穩定劑和迭氮化鈉等防腐劑等。
本發明中對不溶性載體粒子沒有特別的限制，可以列舉出有機高分子物質的微粒或無機氧化物的微粒，或用有機物質等對有機高分子物質或無機氧化物的表面進行處理的微粒。對不溶性載體的材質沒有特別限制，優選在反應液中能夠均勻混懸。
另外，對不溶性載體粒子的粒徑沒有特別限制，優選粒徑在0.4～0.8μm，更優選的不溶性載體粒子可以列舉如聚苯乙烯膠乳等膠乳。膠乳的材質可以列舉出聚苯乙烯膠乳等苯乙烯類膠乳、丙烯酸類膠乳等。另外，為使其負載電荷，也可優選使用丙烯酸類單體或有磺酸的單體等聚合形成的聚苯乙烯膠乳。
不溶性載體粒子在反應液中的濃度或在試劑中的濃度沒有特別限制，優選佔溶液的0.005～2重量％。
本發明的免疫測定方法中對測定對象物質沒有特別限制，可以列舉出鐵蛋白、血紅蛋白Alc(以下記做HbAlc)等抗原或與其對應的抗體。
本發明中，用不溶性載體粒子的抗原抗體反應為不溶性載體粒子作為固定相的抗原抗體反應，作為固定相使用的不溶性載體粒子可以是預先結合(擔載)了測定對象物質或與測定對象物質反應的抗體的物質，也可是實質上沒有結合測定對象物質或與測定對象物質反應的抗體的物質。在本發明的水性介質中，若是用不溶性載體粒子進行抗原抗體反應的免疫測定方法則沒有特別限制，可以列舉如比濁免疫測定方法。
本發明的免疫測定方法包括下述工序，1)在含有在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)和解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的水性介質中，添加上述的不溶性載體粒子，使之混懸的工序，2)含不溶性載體粒子的混懸液和含測定對象物質的樣品進行反應的工序，3)用該反應測定生成的不溶性載體粒子的凝集的工序。
作為不溶性載體粒子，用實質上沒有與測定對象物質或與測定對象物質對應的抗體結合(擔載)的狀態的物質時，含該不溶性載體粒子的混懸液和含測定對象物質的樣品反應的工序後，進行添加含與測定對象物質反應的抗體的試劑的工序。
本發明的免疫測定試劑，若是含有在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)、解離碳酸氫根離子的碳酸化合物和不溶性載體粒子的物質，則沒有特別限制，其中在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)、解離碳酸氫根離子的碳酸化合物和不溶性載體粒子也可以包含在水性介質中。在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)、解離碳酸氫根離子的碳酸化合物、不溶性載體粒子以及水性介質可以分別使用與前述相同的物質。本發明的試劑根據需要可以含有抗體，抗原，酶，輔酶，氯化鈉等可溶性鹽類，Triton X-100、吐溫20等表面活性劑，穩定劑和迭氮化鈉等防腐劑等。
本發明的免疫測定試劑可以用試劑盒保存使用。試劑盒的形態可以列舉出2試劑類試劑盒或3試劑類試劑盒。2試劑類試劑盒可以列舉出如由在水性介質中含有在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)和解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的第1試劑，在水性介質中含有結合了與測定對象物質反應的抗體的不溶性載體粒子、在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)和解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的第2試劑組成的試劑盒；由在水性介質中含有實質上沒有結合測定對象物質或對於測定對象物質的抗體的不溶性載體粒子、在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)和解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的第1試劑，在水性介質中含有與該測定對象物質反應的抗體的第2試劑組成的試劑盒。
本發明的含不溶性載體粒子的免疫測定試劑的穩定化方法，不溶性載體粒子若是存在於含在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)以及解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的水性介質中的方法，則沒有特別的限制，在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)，解離碳酸氫根離子的碳酸化合物，不溶性載體粒子和水性介質可以分別使用與前述相同的物質。水性介質中根據需要可以含有抗體，抗原，酶，輔酶，氯化鈉等可溶性鹽類，Triton X-100、吐溫20等表面活性劑，穩定劑和迭氮化鈉等防腐劑等。
另外，本發明的免疫測定試劑的保存條件沒有特別限制，可以列舉出如0～30℃，優選0～5℃。基於本發明的含不溶性載體粒子的免疫測定試劑的穩定化方法，考慮到是在易使以往試劑不穩定化的非密閉條件，則試劑的穩定化效果更好。
下面列舉具體實施例對本發明進行說明，本發明不僅限於該實施例。
Triton X-100(Sigma社制) 0.15g/L碳酸氫鈉(關東化學社制) 0.2g/L擔載抗體膠乳(參考例1製備) 0.1重量％
Triton X-100(Sigma社制) 0.15g/L碳酸氫鈉(關東化學社制)0.6g/L擔載抗體膠乳(參考例1製備) 0.1重量％比較例1配製下述的R1試劑和R2試劑。R1試劑N-二(羥乙基)甘氨酸緩衝劑(同仁化學社制，pH8.4)3.26g/LTriton X-100(Sigma社制) 0.1g/L氯化鈉(和光純藥社制) 17.5g/L迭氮化鈉(關東化學社制)0.01g/LR2試劑(抗體敏感膠乳混懸液)咪唑緩衝劑(半井化學藥品社制，pH8.4) 0.68g/LTriton X-100(Sigma社制) 0.15g/L擔載抗體膠乳(參考例1製備) 0.1重量％
膠乳(粒徑0.0775μm、積水化學社制) 0.033重量％R2試劑N-二(羥乙基)甘氨酸緩衝劑(同仁化學社制，pH7.0)3.26g/L氯化鈉(和光純藥社制) 15.0g/L吐溫20(和光純藥社制) 2.0g/L迭氮化鈉(關東化學社制) 0.1g/L抗人HbAlc小鼠單克隆抗體 0.025g(IgG換算)/L抗小鼠IgG山羊多克隆抗體(和光純藥社制)0.04g(IgG換算)/L比較例3配製下述的R1試劑和R2試劑。R1試劑(膠乳混懸液)N-二(羥乙基)甘氨酸緩衝劑(同仁化學社制，pH8.4) 3.26g/L迭氮化鈉(關東化學社制) 0.1g/L膠乳(粒徑0.0775μm、積水化學社制) 0.033重量％R2試劑N-二(羥乙基)甘氨酸緩衝劑(同仁化學社制，pH7.0)3.26g/L氯化鈉(和光純藥社制) 15.0g/L吐溫20(和光純藥社制) 2.0g/L迭氮化鈉(關東化學社制) 0.1g/L抗人HbAlc小鼠單克隆抗體0.025g(IgG換算)/L抗小鼠IgG山羊多克隆抗體(和光純藥社制)0.04g(IgG換算)/L參考例(擔載抗體膠乳的配製)向平均粒子0.31μm的10％聚苯乙烯膠乳液(JSR社制)1體積中添加1/60mol/L的PBS溶液(用1mol/L的鹽酸或氫氧化鈉水溶液配製至pH7.4)9體積，稀釋膠乳，配成1％的膠乳液。抗人鐵蛋白抗體(多克隆抗體、協和梅迪克斯社制)用1/60mol/L的PBS溶液稀釋至蛋白濃度為50μg/ml，作為有敏感作用的抗體液。1％膠乳液600μl在25℃的恆溫箱中磁力攪拌機攪拌的同時，迅速添加抗體液1200μl，25℃攪拌2小時。然後，添加3ml下述的封端液1，25℃連續攪拌2小時。然後，4℃，15,000rpm，離心1小時。向得到的沉澱中添加4ml封端液1，同樣地離心分離，清洗沉澱。清洗操作重複3次後，沉澱作為擔載抗體的膠乳使用。
封端液1咪唑緩衝液0.68g中添加BSA(牛血清白蛋白)6g，Triton X-100(Sigma社制)0.15g，20℃測定pH的同時，添加1mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液，調至pH為7.4，加精製水至全量為1,000ml，配製成封端液1。
試驗例1用實施例1～3和比較例1配製的各R1試劑和各R2試劑，採用下述的方法測定血清檢體中的鐵蛋白濃度。測定鐵蛋白濃度時，將剛配製的各R1試劑和各R2試劑注入自動分析機用容器中，分別使用4℃密封保存3天後剛開封的試劑(剛開封)，開封後在4℃保存14天的試劑(開封保存14天)和開封後在4℃保存28天的試劑(開封保存28天)。
血清檢體的配製用採血管(VENJECT真空採血管、TERUMO社制)採取人血液後，放置2小時得到的上清液作為血清檢體，使用前冷凍保存(-20℃)，定量即刻前熔解使用。
用R1試劑和R2試劑測定鐵蛋白的濃度用剛開封的R1試劑和R2試劑、配製成濃度為10.9、21.9、43.8、87.5、175ng/ml的鐵蛋白(Scripps社制)標準液繪製標準曲線。
血清中鐵蛋白的測定，向R1試劑140μl中添加血清檢體10μl，在37℃反應6分鐘後，添加R2試劑150μl，37℃反應13分鐘後，在主波長750nm、副波長800nm處用兩點法(測光點21-39)測定吸光度變化量。使用日立自動分析裝置7170型作為測定儀。
用實施例1～3和比較例1配製的試劑，測定鐵蛋白濃度(ng/ml)的結果如表1所示。
表1

如表1所示，使用沒有添加碳酸氫鈉的R1試劑和R2試劑的比較例1的情況下，隨試劑開封後天數的增加，鐵蛋白的測定值發生很大變化，使用添加了碳酸氫鈉的R1試劑和R2試劑的實施例1～3的情況下，可以看出，試劑開封後即使經過數天，鐵蛋白的測定值也沒有發生很大變化。
試驗例2用實施例4、5和比較例2以及實施例6、7和比較例3配製的各R1試劑和各R2試劑，採用下述的方法測定檢體中HbAlc的血紅蛋白的比例(以下稱HbAlc的濃度)。測定HbAlc的濃度時，對於R1試劑，剛配製的各R1試劑注入自動分析機用容器，使用4℃密封保存3天後剛開封的試劑(剛開封)，在開封狀態4℃保存14天的試劑(開封保存14天)和在開封狀態4℃保存28天的試劑(開封保存28天)。另外，對於R2試劑，剛配製的各R2試劑注入自動分析機用容器，使用4℃密封保存3天後剛開封的試劑。
檢體的配製用EDTA採血管(VENJECT真空採血管、TERUMO社制)採取人血液後，放置2小時，取沉澱的血細胞層10μl，用精製水1ml稀釋。使用前-20℃冷凍保存，使用前熔解作為檢體使用。
用R1試劑和R2試劑測定HbAlc的濃度用剛開封的試劑，通過自動糖血紅蛋白分析儀HLC-723GHbV(東曹社制)測定HbAlc值(＝HbAlc濃度)，使用分別為0.0％、4.2％、7.7％、11.3％、14.8％的標準檢體繪製標準曲線。
檢體中HbAlc濃度的測定，R1試劑240μl中添加上述配製的檢體3.2μl，37℃反應5分鐘後，添加R2試劑80μl，37℃反應5分鐘後，在主波長450nm、副波長800nm處用兩點法(測光點16-34)測定吸光度變化量。使用日立自動分析裝置7170型作為測定儀。
用實施例4、5和比較例2配製的試劑測定HbAlc濃度(％)的結果如表2所示，用實施例6、7和比較例3配製的試劑測定HbAlc濃度(％)的結果分別如表3所示。
表2

表3

如表2和表3所示，使用沒有添加碳酸氫鈉的R1試劑的比較例2、3的情況下，隨R1試劑開封後天數的增加，HbAlc的測定值發生很大變化，使用添加了碳酸氫鈉的R1試劑的實施例4～7的情況下可以看出，即使R1試劑開封後經過數天，HbAlc的測定值也沒有發生很大變化。
通過本發明，由於抑制不溶性載體粒子的非特異性凝集，可以進行特異的定量，提供了測定值的準確性和可靠性高的免疫測定方法。另外，通過本發明，提供了即使長時間保存，也能抑制非特異性凝集的免疫測定試劑。而且，通過本發明提供了含不溶性載體粒子的免疫測定試劑的長期穩定保存的方法。
權利要求
1.一種免疫測定方法，其特徵在於在含有在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)和解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的水性介質中，用不溶性載體粒子進行抗原抗體反應。
2.權利要求1記載的免疫測定方法，其特徵在於解離碳酸氫根離子的碳酸化合物為鹼金屬化合物。
3.權利要求1或2記載的免疫測定方法，其特徵在於碳酸氫根離子濃度為0.05～500mmol/L。
4.權利要求1～3的任一項記載的免疫測定方法，其特徵在於在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑濃度在0.1～500mmol/L。
5.權利要求1～4的任一項記載的免疫測定方法，其特徵在於不溶性載體粒子為在粒子上結合了與測定對象物質反應的抗體的物質。
6.權利要求1～4的任一項記載的免疫測定方法，其特徵在於不溶性載體粒子為粒子上結合了測定對象物質的物質。
7.權利要求1～6的任一項記載的免疫測定方法，其特徵在於不溶性載體粒子為膠乳。
8.權利要求1～7的任一項記載的免疫測定方法，其特徵在於免疫測定方法為比濁免疫測定方法。
9.一種免疫測定用試劑，其特徵在於含有在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)、解離碳酸氫根離子的碳酸化合物和不溶性載體粒子。
10.權力要求9記載的免疫測定用試劑，其特徵在於在水性介質中含有在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)、解離碳酸氫根離子的碳酸化合物和不溶性載體粒子。
11.權力要求9或10記載的免疫測定用試劑，其特徵在於解離碳酸氫根離子的碳酸化合物為鹼金屬化合物。
12.權力要求10或11記載的免疫測定用試劑，其特徵在於碳酸氫根離子的濃度為0.05～500mmol/L。
13.權力要求10～12的任一項記載的免疫測定用試劑，其特徵在於在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑的濃度在0.1～500mmol/L。
14.權力要求9～13的任一項記載的免疫測定用試劑，其特徵在於不溶性載體粒子為在粒子上結合了與測定對象物質反應的抗體的物質。
15.權力要求9～14的任一項記載的免疫測定用試劑，其特徵在於不溶性載體粒子為膠乳。
16.含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑的穩定化方法，其特徵在於在含有在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)和解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的水性介質中含有不溶性載體粒子。
17.權力要求16記載的含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑的穩定化方法，其特徵在於解離碳酸氫根離子的碳酸化合物為鹼金屬化合物。
18.權力要求16或17記載的含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑的穩定化方法，其特徵在於碳酸氫根離子的濃度為0.05～500mmol/L。
19.權力要求16～18的任一項記載的含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑的穩定化方法，其特徵在於在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑的濃度在0.1～500mmol/L。
20.權力要求16～19的任一項記載的含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑的穩定化方法，其特徵在於不溶性載體粒子為在粒子上結合了與測定對象物質反應的抗體的物質。
21.權力要求16～20的任一項記載的含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑的穩定化方法，其特徵在於不溶性載體粒子為膠乳。
全文摘要
提供測定值準確性和可靠性高的能長期保存的含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑，使用該試劑的免疫測定方法以及使該試劑穩定的方法。在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)和解離碳酸氫根離子的碳酸化合物存在於水性介質中時，用不溶性載體粒子進行抗原抗體反應的免疫測定方法，在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)、解離碳酸氫根離子的碳酸化合物以及不溶性載體粒子的免疫測定用試劑，在含有在中性或鹼性範圍內有緩衝作用的緩衝劑(但碳酸類緩衝劑除外)和解離碳酸氫根離子的碳酸化合物的水性介質中含有不溶性載體粒子，提供含不溶性載體粒子的免疫測定用試劑的穩定化方法。
文檔編號G01N33/543GK1449494SQ01814582
公開日2003年10月15日 申請日期2001年7月27日 優先權日2000年7月27日
發明者重信香代子 申請人:協和梅迪克斯株式會社, 愛賜愛兒股份有限公司