一種非核糖體抗菌肽的鑑定及其用途的製作方法

2023-05-19 13:39:01 1

專利名稱:一種非核糖體抗菌肽的鑑定及其用途的製作方法
技術領域：
本發明為一種橋石短芽孢桿菌X23外泌新型非核糖體抗菌肽TyiOCidine T及其發酵製備，屬於微生物發酵和生物分離領域，本發明涉及新型非核糖體抗菌肽TyrocidineT的微生物發酵、分離鑑定及其在農業生產中的應用。
二、技術背景
橋石短芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個種，菌體呈短杆狀，細胞壁厚，廣泛分布於自然界。公開號為CN 的中國專利公開了一種橋石短芽孢桿菌X23及其應用，該菌對茄科作物青枯病菌的抑制能力強。除此之外，還對多種 病原真菌和病原細菌具有拮抗作用。本發明通過大量的實驗證明橋石短芽孢桿菌X23菌株能夠有效地抑制茄科作物青枯病菌的生長；此外，對菸草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌、菸草赤星病菌和馬鈴薯晚疫病菌也具有明顯的拮抗作用。該菌在生長過程中可以向外界分泌種類豐富、數量可觀的蛋白質和NRPs等次生代謝產物。
NRPs 由非核糖體妝合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)催化合成。NRPSs是由多個酶按模塊化(module)組成的大的複合體，每個酶含一個或多個模塊，每個模塊激活一個特定的胺基酸並將其整合到新生的肽鏈中。典型的模塊由腺苷醯化結構域(A結構域)、巰基化結構域(T結構域)和縮合結構域(C結構域)等三個核心結構域組成，模塊的數量、排列順序和方向與其產物的胺基酸數量、排列順序和方向之間存在嚴格的共線性關係，如短桿菌酪肽(tyrocidine)等。此後還發現了另外2種合成NRPs的方式iterative NRPSs 和 nonlinear NRPSs0 Iterative NRPSs 是指同一個模塊或結構域在妝鏈合成過程中不止一次地往新生肽鏈上重複激活和添加某個胺基酸，導致肽鏈由多個小的重複序列組成；Nonlinear NRPSs方式合成的肽鏈順序與其合成酶的模塊之間並不存在嚴格的共線性關係。在NRPSs的最後一個模塊的C-末端通常有起終止延伸和釋放產物功能的硫酯(thioesterase, TE)結構域。除了上述核心結構域，在同一個模塊內可能還存在一些附加的結構域，如差向異構結構域(E結構域)和甲基化結構域(M結構域)等，它們在肽鏈合成過程中對胺基酸底物進行修飾；乙醯化、糖基化和脂質化等結構域則對肽鏈骨架進行修飾。如果不具有這些結構域，修飾作用則由獨立於NRPSs的酶催化完成。
NRPs在醫藥、農業和生物學等領域具有極大的研究價值和應用潛力，除了可以殺死或抑制病原菌，NRPs還被廣泛用於抗腫瘤和抑制免疫反應等。目前臨床應用最多的10種抗生素類產品中有8種為NRPs，在抗感染和抗腫瘤等領域的市場份額分別達到了 68. 3%和79.8%。NRPs也可以抑制或殺死作物病原微生物，在農業領域也具有良好的應用潛力。因此，新的NRPs的分離與鑑定是當前天然產物研究的熱點領域之一。

發明內容
本發明涉及非核糖體抗菌肽tyrocidine T的分離純化和鑑定的方法及其用途。
本發明採用的微生物菌種，橋石短芽孢桿菌X23 (Brevibacillus choshinensisX23)來源於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為=CGMCC NO 45340
橋石短芽孢桿菌X23是一種能分泌對多種病原微生物具有抑制殺傷作用的非核糖體抗菌肽的根際微生物。這些非核糖體抗菌肽具有熱穩定性高、耐受蛋白酶水解的能力強和不易誘導靶標微生物產生選擇性抗性等特點。由於此類抗菌肽通常以多種結構類似物的形式共同存在於其發酵液中，並且有環狀結構和非編碼胺基酸，可以耐受高溫、蛋白酶和有機溶劑處理等嚴苛條件而不影響其結構穩定性及生物學活性。
根據上述特點，優選本發明的分離、純化及鑑定方法為
(I)橋石短芽孢桿菌X23菌株的發酵培養
將_80°C保存的橋石短芽孢桿菌X23菌種接種於裝有NB液體培養基的三角瓶中，28 200 rpm過夜培養至對數生長期，即為發酵培養的種子液，將該種子液以體積比10%
接種於新鮮的NB液體培養基，280C >200 rpm培養32h，得到X23的發酵液。
(2)無菌發酵液的製備
X23發酵液經7，600 rpm離心，取上清液經孔徑為O. 22 μ m的過濾器(Millipore公司，Cat. No. GPWP04700)過濾，得到無菌發酵液。
(3) X23外泌非核糖體抗菌肽粗製備液的製備
取步驟(2)製備的無菌發酵液，冷凍真空乾燥濃縮50倍後用氯仿抽提，11000 rpm離心10 min後收集上層水相，經80°C水浴IOmin後IlOOOrpm離心IOmin,水相即為X23外泌非核糖體抗菌肽粗製備液。氯仿和高溫處理的目的是為了簡化樣品組成。
(4)固相萃取分離
為了進一步簡化樣品組成，並富集非核糖體抗菌肽，將經第(3)步處理的粗製備液經固相萃取處理。具體步驟為固相萃取法(SPE)富集非核糖體抗菌肽tyrocidine T選用華譜新創科技有限公司EMERALD產品，柱活化(見說明書)後將非核糖體抗菌肽粗製備液過柱，依次採用5%甲醇-水洗、甲醇洗和1%甲酸-甲醇洗脫，去除非活性組分，富集非核糖體抗菌肽。至此，樣品被大大簡化。
(5)色譜分離
利用親水色譜法(HILIC,Bio-Amide, 150X4. 6 mm, i. d. 5 μ m)對非核糖抗菌肽粗提液製備分離，流動相為AO. 1%TFA乙腈，BO. 1%TFA溶液，梯度洗脫(0_60 min, 5-50%A)，檢測波長為254 nm。共獲得16個分離組分(圖I)，分別收集每個組分，冷凍真空乾燥後與青枯病菌進行平板對峙試驗，結果表明，第7、第8和第9三個樣品組分在與青枯病菌的平皿對峙實驗時表現出明顯的抑菌圈(圖2)，其中8號組分的抑菌圈大且明顯，說明該組分抑制青枯病菌的效果最好；而第7號和第9號組分的抑菌圈小，且隨著時間的延長，抑菌圈逐漸變小，直至模糊消失，說明第7號和第9號組分對青枯病菌的抑制效果弱於第8號樣品O
收集第7、第8兩個分離組分，進一步優化分離條件，利用親水色譜(HILIC，Bio-Amide, 150X10 mm, i. d. 5 μ m)進行非核糖體抗菌肽的製備分離(Bio-Amide,150X10 mm)，流動相為 A O. 1%TFA 乙腈，B O. 1%TFA 溶液，梯度洗脫(0-60 min, 5-50% A)，檢測波長為254 nm。結果表明，7號和9號樣品組成成份複雜，而8號峰為單一物質。
(6)非核糖體抗菌肽tyrocidine T的鑑定收集8號樣品,冷凍真空乾燥後進行MALDI-T0F-T0F 和 MS/MS 串聯質譜鑑定。MALDI-T0F-T0F 結果表明，tyrocidine T 的分子量為1270. 73(圖3) ；MS/MS鑑定結果表明，非核糖體抗菌肽的一級結構為DPhe-PiO-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu (D型苯丙氨酸一脯氨酸一酪氨酸一D型苯丙氨酸一天冬醯胺一穀氨醯胺一酪氨酸一纈氨酸一鳥氨酸一亮氨酸，見圖3)，生物信息學預測的分子結構如圖4所示。
在一個具體實施方案中，X23非核糖體抗菌肽在作物生產中用於抑制青枯病菌等多種病菌的用途。
在一個具體實施方案中，其中步驟(4)中不同溶液進行洗脫是指先用3柱體積5%甲醇水溶液衝洗、2柱體積再用100%甲醇溶液衝洗、最後用4柱體積1%甲酸-99%甲醇溶液進行洗脫，其中1%甲酸-99%甲醇溶液中比例是指體積體積比。
四、


圖1-2為X23非核糖體抗菌肽的分離及活性檢測
圖I :X23外泌抗菌肽粗製備液的親水色譜分析，其中7-12為親水色譜法製備分離的第7至第12號樣品組分。
圖2:親水色譜法製備的樣品組分與青枯病菌GMI1000的平板對峙培養，其中PCK為X23的無菌發酵液。
圖3 X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的質譜鑑定
圖4 X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的分子結構
五具體實施方式
(一 )本發明新型非核糖體抗菌肽的微生物發酵和分離鑑定方法如下
I.橋石短芽孢桿菌X23的發酵培養將_80°C保存的橋石短芽孢桿菌X23菌種接種於裝有NB液體培養基的三角瓶中，280C >200 rpm過夜培養至對數生長期，即為發酵培養的種子液。將該種子液以體積比10%接種於新鮮的NB液體培養基，28°C、200rpm培養32h，得到X23的發酵液。X23發酵液經7，600 rpm離心，取上清液經孔徑為O. 22 μ m的過濾器(Millipore公司，Cat. No. GPWP04700)過濾，即為無菌發酵液。
2.橋石短芽孢桿菌X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的分離取上述無菌發酵液，冷凍真空乾燥濃縮50倍後用等體積氯仿抽提，11，000 rpm離心10 min後收集上層水相，經80°C水浴IOmin後再11，OOOrpm離心lOmin，上層水相即為X23外泌非核糖體抗菌肽粗製備液。
選用固相萃取法(SPE)富集非核糖體抗菌肽，柱活化(華譜新創科技有限公司EMERALD產品，操作參照廠家使用說明)後將非核糖體抗菌肽粗製備液過柱，依次採用5%甲醇-水洗、甲醇洗和1%甲酸-甲醇洗脫，去除非活性組分，富集非核糖體抗菌肽。收集固相萃取富集的1%甲酸-甲醇洗脫液，經冷凍真空乾燥後用ddH20溶解，反相色譜分析發現活性組分具有較強的極性，在反相色譜柱(Bio-C18，150X4.6 mm)上保留較弱；基於此，隨後採用親水色譜法(HILIC)對該組分分別進行分析(Bio-Amide，150X4.6 mm)和製備(Bio-Amide, 150X10 mm),平板對峙實驗發現第7、第8和第9號樣品均表現出明顯的抑菌活性(圖2)，其中第8號組分的抑菌圈大且明顯，說明該組分抑制青枯病菌的效果最好；而第7號和第9號樣品組分的抑菌圈小，且隨著時間的延長，抑菌圈逐漸變小，直至模糊消失，說明第7號和第9號組分對青枯病菌的抑制效果弱於第8號樣品。
3.橋石短芽孢桿菌X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的分子量及結構鑑定收集8號樣品，冷凍真空乾燥後進行MALDI-T0F-T0F和MS/MS串聯質譜鑑定。MALDI-T0F-T0F結果表明，tyrocidine T的分子量為1270.73 ;MS/MS鑑定結果表明，非核糖體抗菌肽的一級結構為DPhe-Pro-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn_Leu。資料庫比對結果說明，該抗菌肽是已知tyrocidine類非核糖體抗菌肽的同系物,但第三個胺基酸殘基為tyr,與其它tyrocidine均不相同，因此將其命名為tyrocidine T。
(二)橋石短芽孢桿菌X23非核 糖體抗菌肽tyrocidine T的抑菌試驗
I.抑菌試驗指示菌
1.1細菌指示菌抑菌實驗採用的指示細菌為農業生產中重要的病原菌和人類及動物的機會主義致病菌。菸草青枯病菌(Ralstonia Solanacearum GMI1000)、大腸桿菌(Escherichia coli DH5 α )、大白菜軟腐病菌(Erwinia carotovora)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ASl. 2465)。
1.2真菌指示菌抑菌實驗所採用的指示菌為農業生產中3種重要的病原菌，馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、菸草黑胚病菌(P. parasitica var.nicotianae)和水稻稻痕病菌(Magnaporthe grisea)。
2.抗菌肽的抑菌試驗
2.1細菌抑菌試驗方法將培養到對數生長期的各細菌用無菌LB培養基稀釋至IO6 cfu/ml，取60 μ I加入20 ml冷卻到50°C的固體LB培養基，充分振蕩混勻後倒入培養皿。培養基完全冷卻凝固後用打孔器打孔，每孔加入50 μ I濃度為10 μ g/ml的抗菌肽tyrocidine T，37°C培養20 h後記錄抑菌圈大小。抑菌實驗重複三次，抑菌圈直逕取平均值(表I)。
2. 2真菌抑菌試驗方法將各真菌從斜面接種至新鮮的平皿，待菌絲進入旺盛生長期時切取O. 7 cmX0.7 cm的菌絲塊，置於另一新鮮製備的平皿中央。於菌絲塊兩側等距的地方用打孔器打孔，每孔加入50 μ I濃度為30 μ g/ml抗菌肽tyrocidine T。48 h後記錄抑菌圈直徑大小，實驗重複三次，抑菌圈直逕取平均值(表I)。馬鈴薯晚疫病菌和菸草黑脛病菌用黑麥培養基培養，培養溫度分別為18°C和28°C ;水稻稻瘟病菌用PDA培養基培養，培養溫度為28 °C。
研究結果表明，抗菌肽對上述5種細菌和3種真菌均具有顯著的抑菌作用。由於橋石短芽孢桿菌抗菌肽tyrocidine T對多種植物甚至動物的病原菌都具有明顯的抑制作用，表現出高效廣譜特性，因此可以開發成為一種新型的殺菌製劑，用於植物和動物病原菌的控制，對於減少因病原菌危害造成的經濟和生態損失具有重要的意義。
表I橋石短芽孢桿菌X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T對病原細菌和真菌的抑菌效果[0042]
權利要求
1.一種由橋石短芽孢桿菌X23菌株iBrevibacillus brevis X23)合成並分泌的非核糖體抗菌肽tyrocidine T,是已知非核糖體抗菌肽tyrocidine的同系物,其特徵在於具有如下的胺基酸序列DPhe-Pro-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Ty:r-Val-0;rn-Leu。
2.根據權利要求
I的方法，非核糖體抗菌肽tyrocidineT在作物生產中用於抑制青枯病菌等多種病菌的用途。
專利摘要
針對橋石短芽孢桿菌X23防治青枯病菌危害作物時，發現了一種非核糖體抗菌肽，並對其進行鑑定，是一種十肽物質，經抑菌試驗發現對多種病原菌有抑制作用。
文檔編號A01P1/00GKCN102850432SQ201210292396
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月16日
發明者唐忠海 申請人:唐忠海導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan