人工重組選擇複製型腺病毒及應用的製作方法

2023-05-18 23:51:01

專利名稱：人工重組選擇複製型腺病毒及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術，涉及人工重組腫瘤特異性殺傷腺病毒(rsAd-MK-TNFa)，可在製備治療特異性殺傷腺病毒藥物中的應用。
背景技術：
近年來人口老齡化，環境汙染加重，吸菸等不健康生活方式的日益增多，惡性腫瘤的發病率也逐年增加，而對惡性腫瘤的治療效果卻鮮有提高，惡性腫瘤已經成為威脅人類健康和導致死亡的首要疾病，因此如何有效提高惡性腫瘤的治癒率是目前腫瘤研究中亟待解決的重要問題。常規的治療方法是手術、化療、放療，外科手術雖然可以清除可切除部位的腫瘤細胞，但對遠處轉移的治療無能為力。而放療、化療手段對機體損傷較大，殺傷腫瘤細胞的特異性不強。在一定程度上破壞了機體的體內平衡，抑制了機體自身的免疫系統。缺乏對腫瘤細胞有效的特異性抑制是導致治療失敗的主要原因，為此必須積極尋找新的治療手段。
腫瘤的生物治療是通過生物工程技術，發現、發明新的療法和藥物，激發機體的防禦功能，抑制或殺傷腫瘤細胞，並使機體的內環境保持穩定、平衡的治療方法。生物治療具有獨特的優勢，可以通過各種途徑區分正常細胞和腫瘤細胞，並對腫瘤細胞產生特異性的殺傷作用，即治療的靶向性，治療方案可個體化，對機體損害小，在臨床實驗中效果顯著，部分治療方法在臨床應用中已成為重要的腫瘤輔助治療手段，但總體而言療效仍不理想。目前生物治療種類主要有基因治療，免疫治療，小分子靶向治療和病毒靶向治療。
病毒靶向腫瘤治療是近年來逐漸興起的腫瘤治療方法，人們發現攜帶特定基因的病毒可作為特異性治療腫瘤的「武器」來加以應用，這種經人工改造後能特異性地在腫瘤細胞中複製並表達治療基因產物、破壞和殺死腫瘤細胞的病毒由於具有靶向性特點，而被認為是較有希望的生物治療手段。利用腫瘤細胞的固有特性，通過病毒來識別並殺滅腫瘤細胞的方法與以往的腫瘤治療不同，具有以下特點1.應用範圍廣，凡是具有相同或類似特徵的腫瘤細胞都可以接受這種治療；2.現階段對腫瘤細胞的研究結果可及時應用於臨床治療，並可藉助分子生物學方法使病毒帶有腫瘤細胞的選擇性；3.可通過病毒在腫瘤細胞中的複製繁殖，破壞腫瘤細胞。但是作為其攜帶基因常需具有主動攻擊被感染腫瘤細胞作用的特點，以發揮其治療作用。

發明內容
本發明提供腫瘤特異性殺傷腺病毒(rsAd-MK-TNFa)，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，通過插入腫瘤特異性啟動子啟動的具有細胞毒作用的外源基因TNFα，並缺失了部分病毒早期轉錄因子，其中中期因子啟動子位於1363-1954；腫瘤壞死因子α(TNFα)序列位於2002-2688bp，可以表達具有SEQ D NO.2的TNFα胺基酸序列。
本發明的人工重組選擇複製型腺病毒(腫瘤特異性殺傷腺病毒)，通過以下步驟實現從人類基因庫擴增獲得TNFα、MidKine基因，採用同源重組的方法插入到腺病毒基因組中，在Ad293細胞中擴增獲得。具體方法是通過腺病毒載體攜帶腫瘤特異性啟動子調控外源基因特定細胞內表達，即攜帶有Midkine啟動子調控TNFα基因的人工重組腺病毒在表達Mikine的惡性腫瘤細胞中特異性地進行病毒複製和外源插入基因表達，從而在表達Mikine的惡性腫瘤細胞中，因受Midkine啟動子控制而特異性地進行病毒複製和TNFα基因表達，從而殺死惡性腫瘤細胞的技術。
具體是(1)病毒早期轉錄區部分基因缺失，可選擇性在腫瘤細胞中複製；(2)攜帶人腫瘤壞死因子α(TNFα)基因；(3)人腫瘤壞死因子α(TNFα)基因是以中期因子啟動子啟動。
通過人工基因重組技術獲得的具有特異性殺傷腫瘤細胞的缺陷型腺病毒，由於在其早期轉錄系統中插入通過Mikine啟動子啟動表達TNFα基因，同時缺失了E1b區和E3區，使該重組病毒獲得了腫瘤特異性複製、表達插入基因序列，從而殺傷腫瘤細胞的特性。由於病毒只能在P53功能異常的腫瘤細胞中複製，其次通過病毒介導的腫瘤細胞內特異性(病毒選擇複製和腫瘤特異性啟動子啟動TNFα表達)TNFα表達，誘導受攻擊腫瘤細胞凋亡，同時通過病毒的在腫瘤細胞中的複製提高在腫瘤區域內的TNFα的濃度，並結合病毒直接複製裂解腫瘤細胞，另外缺失了E3區的病毒可使受感染腫瘤細胞增強MHC-I類分子的表達，更容易受到機體免疫細胞的攻擊，通過三者結合可進一步增強對腫瘤的綜合治療作用。避免TNFα全身應用的副作用，具有良好的應用前景。所構建的重組選擇複製型腺病毒(rsAd-MK-TNFa)，其基因組序列見文件rsAd-MK-TNFa sequence.doc。
本發明的另一個目的是提供人工重組腫瘤特異性殺傷腺病毒在製備治療特異性殺傷腺病毒藥物中的應用。
本發明的有益之處是通過攜帶由腫瘤特異性啟動字Midkine啟動表達腫瘤壞死因子α基因的重組腺病毒在惡性腫瘤組織中特異性複製和表達TNFα，在腫瘤局部產生殺傷腫瘤細胞和抑制腫瘤生長的作用，避免了腫瘤壞死因子全身應用的嚴重毒副作用。為惡性腫瘤生物治療提供新的藥物。


圖1-1 rsAd-MK-TNFa對RKO細胞抑制作用的生長曲線圖。
圖1-2不同濃度的rsAd-MK-TNFa對RKO細胞抑制作用差別(第5天)。
圖2-1 rsAd-MK-TNFa對smmc7721細胞抑制作用的生長曲線圖。
圖2-2不同濃度的rsAd-MK-TNFa對smmc7721細胞抑制作用差別(第5天)。
圖3-1 rsAd-MK-TNFa作用3天對實體瘤和白血病細胞系的生長抑制作用。
圖3-2 rsAd-MK-TNFa作用5天對實體瘤和白血病細胞系的生長抑制作用。
圖3-3 rsAd-MK-TNFa對Bcap37的生長抑制作用。
具體實施例方式
實例一rsAd-MK-TNFa(ZUCI008)對RKO細胞(結腸癌細胞株)的殺傷作用選取5個病毒濃度分別是MOI＝0.02、0.2、2、20、200和空白對照，加入到細胞指數生長期的RKO細胞中，採用MTT的方法觀察其對RKO細胞生長的作用，我們觀察到病毒對腫瘤細胞的抑制作用存在時間效應，隨著作用時間的延長其對腫瘤細胞的抑制作用增強(參見圖1-1)。用藥5天腫瘤細胞生長即出現明顯受抑制，腫瘤細胞的抑制作用呈濃度依賴性，且隨濃度增高對細胞的抑制作用增強(參見圖1-2)。
實例二rsAd-MK-TNFa對smmc7721細胞(肝癌細胞株)的殺傷作用選取5個病毒濃度分別是MOI＝0.02、0.2、2、20、200和空白對照，加入到細胞指數生長期的smmc7721細胞中，採用MTT的方法觀察其對RKO細胞生長的作用，我們觀察到病毒對腫瘤細胞的抑制作用存在時間效應，隨著作用時間的延長其對腫瘤細胞的抑制作用增強(參見圖2-1)。用藥5天腫瘤細胞生長即出現明顯受抑制，腫瘤細胞的抑制作用呈濃度依賴性，且隨濃度增高對細胞的抑制作用增強(參見圖2-2)。
實例三rsAd-MK-TNFa對不同腫瘤細胞的抑制率觀察從實施例一和實施例二的實驗我們看到，在MOI＝0.02、0.2、2時rsAd-MK-TNFa對腫瘤細胞的抑制作用較弱，因此我們在本實驗中選擇MOI＝10、100、1000三個濃度梯度，採用MTT的方法觀察rsAd-MK-TNFa對腫瘤細胞的抑制作用，由於在前面的生長曲線實驗中我們發現rsAd-MK-TNFa對腫瘤細胞的作用在第3天以後開始出現，因此我們分別觀察rsAd-MK-TNFa作用第3天和第5天結果，參見圖3-1和圖3-2。我們觀察到rsAd-MK-TNFa對腫瘤細胞的存在一定的抑制作用，而且對不同腫瘤細胞的抑制作用存在很大的區別，在試驗的實體瘤細胞系中對sw480的抑制作用最大，其次是Bcap37，而對白血病細胞系中對HL60的抑制作用最大，對KV812和Jurkit細胞系也存在很大的抑制作用，但是對K562細胞系即使在MOI＝1000時也幾乎沒有作用。另外抑制作用的強度rsAd-MK-TNFa作用濃度和時間存在一定的關係，在MOI＝100以上時，才出現較明顯的抑制，而且對實體瘤細胞系在第5天才出現較強抑制，而對白血病細胞系在第3天時即可出現一定的抑制作用。rsAd-MK-TNFa在MOI＝10、100、1000時對Bcap37細胞的作用顯微鏡下觀察參見圖3-3。
本發明設計的序列110浙江大學120人工重組選擇複製型腺病毒及應用1602210121134649212DNA213人工序列220
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權利要求
1.人工重組選擇複製型腺病毒，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，其特徵是通過插入腫瘤特異性啟動子啟動的具有細胞毒作用的外源基因TNFα，並缺失了部分病毒早期轉錄因子，其中中期因子啟動子位於1363-1954；腫瘤壞死因子α序列位於2002-2688bp，表達具有SEQ ID NO.2的TNFα胺基酸序列，通過以下步驟實現從人類基因庫擴增獲得TNFα、MidKine基因，採用同源重組的方法插入到腺病毒基因組中，在Ad293細胞中擴增獲得，具體方法是通過腺病毒載體攜帶腫瘤特異性啟動子調控外源基因特定細胞內表達，即攜帶有Midkine啟動子調控TNFα基因的人工重組腺病毒在表達Mikine的惡性腫瘤細胞中特異性地進行病毒複製和外源插入基因表達，從而在表達Mikine的惡性腫瘤細胞中，因受Midkine啟動子控制而特異性地進行病毒複製和TNFα基因表達。
2.根據權利要求1所述的人工重組選擇複製型腺病毒，其特徵是具體步驟為(1)病毒早期轉錄區缺失了E1b區和E3區部分基因，可選擇性在腫瘤細胞中複製；(2)攜帶人腫瘤壞死因子α基因；(3)人腫瘤壞死因子α基因是以中期因子啟動子啟動。
3.根據權利要求1所述的人工重組選擇複製型腺病毒在製備治療特異性殺傷腺病毒藥物中的應用。
全文摘要
人工重組選擇複製型腺病毒，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，通過病毒選擇性感染腫瘤細胞並在其中複製，同時攜帶Midkine啟動的TNFα基因，可在Midkine高表達的腫瘤細胞產生TNFα，引起腫瘤細胞凋亡。病毒的複製、所表達的TNFα和因病毒感染激發機體抗病毒細胞免疫均可對特定腫瘤細胞產生殺傷作用，這種殺傷作用是腫瘤特異性，對人體正常細胞毒性小，無骨髓抑制和免疫抑制作用。發明對Midkine不表達、但對腺病毒敏感的惡性腫瘤也可通過腺病毒的複製產生治療效果，可在製備治療特異性殺傷腺病毒藥物中的應用，為生物治療腫瘤提供新方法。
文檔編號C12N15/28GK101016537SQ20061015535
公開日2007年8月15日 申請日期2006年12月20日 優先權日2006年12月20日
發明者陸巍, 鄭樹 申請人:浙江大學