黏膜疫苗的製作方法

2023-05-18 23:16:46 3

專利名稱：黏膜疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種有效誘導黏膜免疫IgA和血中免疫IgG的黏膜疫苗。
背景技術：
在專利文獻I及2中，詳細記載了與現有的鈍化疫苗及類毒素等中的缺點、黏膜疫苗及免疫佐劑的開發有關的現狀等。
如這些專利文獻1、2中記載所述，廣泛且深刻地認識到用在作為病毒的自然感染途徑的黏膜中誘導IgA抗體產生的黏膜疫苗來代替向皮下、肌肉內等接種的現有疫苗的必要性。特別是作為21世紀的下一代疫苗，全世界均期待誘導IgA抗體的產生、局部免疫或黏膜免疫的所謂黏膜疫苗的開發和實用化，但尚未實現。本申請發明人等對於這樣的課題，發明了由作為肺表面活性蛋白質B及/或肺表面活性蛋白質C與脂質的複合體的抗原藥物(AD)載體(vehicle)和由該AD載體和抗原構成的黏膜疫苗，並提出了專利申請(專利文獻I)。進而，本申請發明人等發現通過調節AD載體量(V)和抗原量㈧的重量比V/A，可以轉換IgA抗體的選擇性產生和IgA · IgG兩抗體產生，並提出了以此為作用機制的黏膜疫苗的專利申請(專利文獻2)。另外，專利文獻1、2也公開了肺表面活性蛋白質B及C的片段(肽)的有效性。進而，本申請發明人等對肺表面活性蛋白質片段的各種變異體研究了抗體產生增強作用，結果發明了以合成肽KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)為成分的AD載體和包含該AD載體和抗原的黏膜疫苗並提出了專利申請(專利文獻3)，所述合成肽雖然為比專利文獻1、2所公開的部分肽小的肽，但具有抗體產生的強誘導或者增強作用，特別是具有分泌型IgA抗體的單獨產生、以及分泌型IgA和血中IgG兩種抗體產生的優異且有效的誘導作用。另外，對採用與黏膜疫苗相同的給藥經路的滴鼻劑而言，為了提高其粘度並持續發揮對於花粉症或過敏的效能，廣泛使用有羧基乙烯基聚合物(CVP) (Carboxyvinylpolymer)或羥丙基纖維素(HPC)，另外，使用有以海藻酸鈉為代表的增稠凝膠化劑。例如也已知有含有HPC的黏膜疫苗(專利文獻4)及含有CVP的黏膜應用型疫苗製劑(專利文獻
5)及鼻腔內噴霧給藥用流感疫苗(專利文獻6)等。另外，在專利文獻7中公開有一種由抗原、佐劑[特別是Poly (1.C.)]及增稠劑(海藻酸鈉等)構成的黏膜給藥用的疫苗。專利文獻1:國際公開W02005/097182號公報專利文獻2 :國際公開W02007/018152號公報專利文獻3 :國際公開W02009/123119號公報專利文獻4 :日本特開2008-231343號公報專利文獻5 :國際公開W001/017556號公報專利文獻6 :日本特開平03-38529號公報專利文獻7 :日本特開2009-209086號公報
發明內容
發明要解決的課題專利文獻3的黏膜疫苗具有強抗體產生能力，但作為黏膜疫苗的共通的問題點，具有需要比經皮注射疫苗更多的抗原。為了進行有效的疫苗治療，相對於作為其目標的傳染病的流行範圍，需要充分量的疫苗，在鑑於現狀的抗原生產量規模的情況下，黏膜疫苗增產很困難。因此，要求對黏膜疫苗賦予更強的抗體產生能力。本申請發明的課題在於提供一種改良型黏膜疫苗，所述改良型黏膜疫苗與專利文獻3中記載的黏膜疫苗相比具有更強的抗體產生能力，作為其結果，能夠以與經皮注射疫苗相匹敵那樣的少量的抗原發揮優異的效果。用於解決課題的手段作為進一步增強專利文獻3的黏膜疫苗的抗體誘導的方法，本申請發明人等從滴 鼻劑或黏膜應用型疫苗中使用的凝膠化劑(CVP、HPC)中，試驗了作用於AD載體，增加運送至抗原呈遞細胞的抗原量並對黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的誘導效果，確認了以下內容。(I)與專利文獻3的黏膜疫苗(抗原+合成肽+脂質)或專利文獻5、6的黏膜疫苗(抗原+CVP)相比，由包含「抗原+合成肽+脂質+CVP」的黏膜疫苗具有特別優異的抗體誘導能力，其效果大大超過由專利文獻3 (抗原+合成肽+脂質)和專利文獻5、6 (抗原+CVP)的簡單的組合所預測的範圍。(2)與CVP同樣地作為滴鼻劑或黏膜疫苗的凝膠化劑被廣泛報告的HPC賦形劑在與抗原並用或者與抗原並用於AD載體的情況下，完全不具有抗體誘導能力，也無法期待誘導黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的效果。(3)即使將抗原量減少至專利文獻3的黏膜疫苗(抗原+合成肽+脂質)的需要量的約1/5以下，「抗原+合成肽+脂質+CVP」的黏膜疫苗仍然具有特別強的抗體誘導效果。本發明是基於以上的新見解而完成的。S卩，本發明為一種黏膜疫苗，其特徵在於，含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質的AD載體，所述合成肽包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的胺基酸序列；(b)羧基乙烯基聚合物；及(C)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產生引起有效的感染防禦效果的量的黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述黏膜疫苗產生引起有效的感染防禦效果的量的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG。在本發明的黏膜疫苗中，其中，抗原蛋白(C)為即使進一步利用與AD載體(a)的組合或與羧基乙烯基聚合物(b)的組合也不會產生引起有效的感染防禦效果的量的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的量。在該黏膜疫苗中的一形態中，所述合成肽為包含序列編號I或2的胺基酸序列的肽。另外，在該黏膜疫苗中的其它的方式中，脂質為卵磷脂、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸及油酸中的至少一種。進一步具體而言，脂質為二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油及棕櫚酸的三種脂質混合物。
在該黏膜疫苗中的又一方式中，抗原包括源自病原體的鈍化抗原、純化抗原、部分純化抗原、重組抗原或無毒化毒素、成為過敏原因的過敏原。進而，本發明為一種黏膜疫苗的製造方法，所述黏膜疫苗含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質的AD載體，所述合成肽包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的胺基酸序列；(b)羧基乙烯基聚合物；及(C)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產生引起有效的免疫誘導的量的黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述黏膜疫苗產生引起有效的免疫誘導和感染防禦效果的量的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG， 所述方法的特徵在於，(I)將所述(a)及(C)懸浮在水中，(2)將加溫和攪拌重複I次以上，(3)進行冷凍乾燥，(4)將冷凍乾燥體懸浮在生理鹽水中並製備成規定濃度，(5)加入所述(b)的溶液。在本發明中，所謂「引起有效的免疫誘導的量的黏膜免免疫IgA及血中免疫IgG」例如為血液的病毒感染抑制效果HI值為國際評價基準以上那樣的量的IgA及IgG。需要說明的是，在以下的說明中，有時將包含合成肽和脂質的組合物記為「AD載體」，將包含該AD載體和所述抗原的組合物記為「黏膜疫苗」。這些「AD載體」及「黏膜疫苗」與專利文獻3中所公開的載體及疫苗的實施性相同。進而，有時將在該黏膜疫苗中添加了CVP的組合物記為「CVP添加黏膜疫苗」。另外，對本申請發明而言，關於所述的「脂質」，含有專利文獻1-3的公開內容，關於「合成肽」及「AD載體」，含有專利文獻3的公開內容。發明效果本申請發明的CVP添加黏膜疫苗具有疫苗抗原特異性IgA及IgG抗體的極強的誘導效果和遠遠超過所誘導的抗體的國際基準的強病毒感染抑制效果(HI效果)。即使與專利文獻3中記載的黏膜疫苗或者「抗原+CVP疫苗」(專利文獻5、6)相比，這些效果也極其顯著，為無法由專利文獻3的黏膜疫苗效果和專利文獻5、6的CVP效果預測的優良效果。由於這樣的強抗體誘導能力，可通過含有比現有的黏膜疫苗更少量的抗原來實現需要的感染防禦效果。即，本申請發明的CVP添加黏膜疫苗即使將抗原量減少至現有的黏膜疫苗(抗原+合成肽+脂質)中使用的抗原量的1/5以下，也顯示特別強的抗體誘導效果。例如如試驗例2所示，專利文獻3的黏膜疫苗在將流感抗原用作抗原的情況下，即使抗原量為O. 2 μ g，血液的病毒感染抑制效果HI也未達到流感疫苗的國際評價基準即HI =40，但本發明的CVP添加黏膜疫苗中的抗原量即使為O.1 μ g，進而為O. 03 μ g，也顯示HI值為100以上這樣的優異的病毒感染抑制效果。進而，本申請發明的CVP添加黏膜疫苗的組合物(AD載體、CVP)本身沒有抗原識別細胞刺激效果，因此，引起由給藥的疫苗抗原之外的抗原導致的意外的副作用，例如自體免疫性疾病、疫苗接種後的過敏惡化等的可能性極低。另外，根據本發明的黏膜疫苗製造方法，可以製造一種具有更高的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG產生能力的黏膜疫苗。


圖1為試驗I的結果即將實施例1、比較例1-5的各疫苗、HA抗原分別對小鼠經鼻給藥時的鼻清洗液IgA量(左)和血清IgG量(右)；圖2為試驗I的結果即將實施例1、比較例1、5的各疫苗、HA抗原及作為比較對象的HA+AD載體分別對小鼠經鼻給藥時的抗流感病毒HA抗體所顯示的HI效價；圖3為在試驗2中，用內毒素(LPS)、poly(1.C.)和SF-1O (CVP+AD載體)分別刺激抗原遞呈樹狀細胞並對細胞膜的活化表示分子(MHC I1、⑶40、⑶80(B7-1)及⑶86(B7_2))的表達水平進行測定的結果。左圖表示各膜分子的表達量增加而判定為陽性的細胞(超過右側的點圖表中由用作對照的生理鹽水處理而確定的中央附近的陰性值上限顯示條的值的細胞)的總細胞數中的比例(％)，右圖為利用流式細胞儀的測定結果對細胞膜上的活化 表示分子的量進行可視化定量的圖；圖4為試驗4的結果，表示感染的流感病毒PFU量和生存率的關係；圖5為試驗4的結果，表示對小鼠(各組10隻)經鼻給藥實施例1、實施例5、比較例5及比較例6的各疫苗後，感染50PFU的流感病毒時的生存率的變化；圖6為試驗4的結果，表示對小鼠(各組10隻)經鼻給藥實施例1、實施例5、比較例5及比較例6的各疫苗後，感染800PFU的流感病毒時的生存率的變化；圖7為表示試驗6結果的透射型電子顯微鏡照片。㈧為比較例I的黏膜疫苗，(B)為實施例1的CVP添加黏膜疫苗和其部分擴大圖(右圖)；圖8為在試驗7中，利用流式細胞儀對由樹狀細胞檢測的螢光標記抗原量進行測定的結果。將用單獨給藥HA抗原時在樹狀細胞中檢測的抗原螢光標記量設為I時，以各自的測定條件下促進螢光標記量的倍數作為縱軸，以「Fold versus HA」 =[測定各樣品時的MFI]/[單獨添加HA的樹狀細胞的MFI]的形式進行表示。MF1:平均螢光強度** p< O. Olvs. HA(n = 3)；圖9為在試驗8中，用poly (1. C. )、SF-1O (CVP+AD載體)分別刺激抗原遞呈樹狀細胞並對細胞膜的活化表示分子(CD86)的表達水平進行測定的結果。□為無HA抗原蛋白，■為有HA抗原蛋白的結果。MF1:平均螢光強度，* p < O. 05vs.僅佐劑(Adjuvant alone)(η = 3)；圖10為在試驗9中，在抗原存在下及不存在下對小鼠經鼻給藥SF-1O (CVP+AD載體)佐劑並對由鼻腔組織製備的樹狀細胞的CD86表達水平進行測定的結果。MF1:平均螢光強度。
具體實施例方式本申請發明的CVP添加黏膜疫苗包含以下的組成。合成肽是包含KnLm(其中，η為4_8，m為11-20)的胺基酸序列的合成肽。對該KnLm而言，N端側的η個K(Lys)殘基和C端側的m個L殘基連接。這樣的合成肽為例如以下的任一種肽。需要說明的是，括弧內為肽的簡稱。另外，胺基酸殘基由一個文字符號表示。
序列編號I (K6L 16) KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL序列編號2 (K6L11) KKKKKKLLLLLLLLLLL序列編號I (K6L16)由N端側的6個K(Lys)殘基和C端側的16個L殘基構成,序列編號2(K6L11)由N端側的6個K(Lys)殘基和C端側的11個L殘基構成。這些合成肽使用依據公知的化學合成法所製備的純度95%以上的材料。MM作為磷脂質，優選使用肺表面活性物質含有的磷脂質，例如卵磷脂、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油等。另外，可以使用磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂酸及鞘磷脂等。另外，作為脂肪酸，可以使用月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸及油酸等。進而可以使用源自肺的膨脹活躍的鯨、海豚等水生動物的脂質。 羧某乙烯某聚合物(CVP)
CVP為以丙烯酸作為主要成分進行聚合而得到的親水性聚合物，可以使用HIVISffAKO 103, HIVISffAKO 104, HIVISffAKO 105、Sigma 公司制 pAA130 (Sigma, St. Louis,MO, CatNo. 181293)、pAA450 (Sigma, CatNo. 181285)、pAA1250 (Sigma, CatNo. 306215)等市售品。其中，優選化妝品及醫藥品用凝膠的製作中所通用的HIVISWAKO 104、Sigma公司制pAA130、pAA1250。可以用純水或者生理鹽水在超聲波處理下將CVP製作0. 2-2. O重量％溶解液後，用NaOH中和液進行pH 5. 0-10. 5的製作，但優選選擇不會影響疫苗抗原的穩定性的pH。例如在流感裂解疫苗抗原的情況下，pH被調節為6. 8-8. 0，優選pH為7. 0-7. 2。技釐抗原含有用於疫苗的經高度純化的純度為約90%以上的源自細菌的抗原、病毒抗原、類毒素等蛋白質、糖蛋白質、過敏原、高分子糖質及核酸等抗原分子。例如為水痘病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質炎病毒、輪狀病毒、流感病毒、腺病毒、皰疹病毒、嚴重急性呼吸症候群(SARS)病毒、西尼羅病毒、漢坦病毒、登革病毒、日本腦炎病毒、黃熱病毒、蜱傳腦炎病毒、HIV病毒、C型肝炎病毒、百日咳菌、腦膜炎菌、流感b型菌、肺炎菌、霍亂弧菌、瘧疾病原體、昏睡病病原體等的疫苗用的抗原。這些抗原製備即使其單獨、特別是與AD載體(a)或與羧基乙烯基聚合物(CVP)組合也不會產生引起有效的免疫誘導的量的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的量進行使用。另外，在流感抗原蛋白的情況下，除HA抗原分子以外，含有M蛋白、神經氨酸酶及核蛋白等。在以下的說明中，抗原蛋白量是指含有這些抗原分子的蛋白質總量。對使用的批量流感疫苗而言，HA抗原分子自身的量為抗原總蛋白量的約50 %。接著，對由這些材料製備AD載體及CVP添加黏膜疫苗的方法進行說明。AD載體的製備以任意比例混合上述脂質中的幾種，作為脂質量，例如以成為10mg/mL的濃度的方式懸浮於氯仿甲醇(2 : l(v/v))混合液，作為脂質成分。另外，合成肽以濃度為例如5. 0mg/mL的方式溶解於乙醇。接著，混合該脂質成分和合成肽。對混合比而言，合成肽為約0. 2 約12. O乾燥重量％，脂質為約88 約99. 8乾燥重量％。使用旋轉蒸發器將該混合物在約40°C下進行幹固，以任意濃度再懸浮於10%乙醇，在約45°C的水浴中振蕩混合15分鐘左右，製備均勻分散液並冷凍乾燥。將該乾燥物在約_30°C下保存，每次在使用時加入純水或生理鹽水使其懸浮後，使用超聲波、均化器、混合器、振蕩儀等製成均勻分散液。CVP添加黏膜疫苗的製備以任意比例混合上述AD載體、CVP及抗原。即，在流感疫苗的情況下，以使AD載體量(V)相對於疫苗中的抗原蛋白量(A)的乾燥重量比V/A為期望的值的方式在疫苗原液中添加混合AD載體液進行製備。對每隻小鼠給藥的抗原蛋白的乾燥重量(A)為約0.01 約10 μ g/kg體重，優選為約O. 03 約5. O μ g/Kg體重。該抗原量為專利文獻3的黏膜疫苗(抗原+AD載體)中的抗原量(約O.1 50 μ g/kg體重，優選為約O. 3 30 μ g/Kg體重)的1/5以下。在這樣的抗原量中，用於優先且選擇性地誘導IgA抗體產生的V/A優選為約O.1 約1. O。另外，用於誘導IgA及IgG兩種抗體產生的V/A為約1. O 約100，優選採用約5 約20的範圍。在如上所述的V/A中，抗原的約60%以上與AD載體結合，由此得到的黏膜免疫疫苗可有效地誘導IgA抗體產生及/或IgG抗體產生。另外，加入了 CVP的最終經鼻給藥疫苗液中的CVP濃度為約O. 1% 1. 0%，優選以O. 3 % O. 8 %的比例添加。另外，為了均勻地混合AD載體、抗原及CVP，可以使用均化器、混合器、振蕩儀及攪拌器等。具體而言，如下述實施例1所示，可以如下製備CVP添加黏膜疫苗在混合抗原蛋白和AD載體後，進行3分鐘超聲波處理，進一步在室溫下旋轉混合2小時後，最後加入等量的I % CVP生理鹽水溶液。除了添加CVP之外，該方法與專利文獻3中記載的方法相同。但是，該方法存在如下不良情況有時由於超聲波處理產生的發熱使病毒抗原失活；有時由於使用機器和材料的種類、振蕩器的大小、振蕩器的狀態等，超聲波處理行程難以保持一定的條件。因此，優選由實施例7所示那樣的以下工序構成的製造方法。(I)將AD載體和抗原蛋白懸浮在水(純水)中(2)將加溫和攪拌重複I次以上(3)冷凍乾燥(4)將冷凍乾燥體懸浮在生理鹽水中並製備成規定濃度(5)添加溶解在生理鹽水中的CVP溶液該方法不僅解決了由超聲波處理引起的上述問題點，而且如後述試驗5中所示那樣可以更高地產生抗原特異性的IgA及IgG，是優異的方法。製備的CVP添加黏膜疫苗也可以以一次給藥使用，但優選以二次給藥(初次免疫和二次免疫)或三次給藥(初次免疫、二次免疫、三次免疫)的形式使用。通過這樣的多次免疫處置，可以顯著地增加IgA及IgG的抗體效價。另外，二次或三次疫苗給藥以I周 3周，優選以約2周的間隔進行。進而，本申請發明的CVP添加黏膜疫苗的給藥路徑除鼻腔之夕卜，也可以對口腔內或陰道給藥(例如Lubrizol Pharmaceutical Bulletin,Polymers forPharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc.2008)。以下，示出實施例對本申請發明進行更詳細且具體的說明，但本申請發明並不限定於以下的例子。實施例1[包含超聲波處理的製造工序]
首先，如下製備AD載體。以75 : 25 : 10 (w/w/w)的比例混合二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、磷脂醯甘油(PG)及棕櫚酸(PA)，以磷脂質量計為10mg/ml的濃度的方式懸濁於氯仿甲醇(2 : l(v/v))混合液，作為脂質成分。另外，將純度95%以上的合成肽K6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL) (GenScript 公司制)以成為 5. Omg/mL 的方式溶解在甲醇中。以重量比計磷脂質成分K6L16= 100 2的方式混合脂質成分(DPPC PG PA =75 : 25 : 10，w/w/w)溶液和K6L16肽溶液，使用旋轉蒸發器在40°C下進行幹固。將其以磷脂質量計為4mg/mL的方式再懸浮於10%乙醇，在45°C的水浴中振蕩混合15分鐘，製備均勻分散液。對其進行冷凍乾燥並作為AD載體在_30°C下進行保存。接著，使用上述AD載體如下製備CVP添加黏膜疫苗。冷凍乾燥後的AD載體必須懸浮在生理鹽水中使用。流感疫苗(HA)抗原使用由 阪大微生物病研究會提供的A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)、1. 94mg蛋白質/mL(磷酸鈉緩衝液、氯化鈉、乙基汞硫代水楊酸鈉溶液=ImL中溶解磷酸氫鈉水合物3. 53mg、磷酸二氫鈉O. 54mg、氯化鈉8. 50mg及乙基汞硫代水楊酸鈉O. 008mg)。對疫苗和AD載體的混合量而言，以AD載體溶液的磷脂質量(V)相對於抗原溶液的蛋白量㈧的量比V/A = 10的方式進行混合，以30秒的間隔對超聲波處理重複三次開啟關閉，進行由合計90秒的開啟和90秒的關閉構成的合計3分鐘的超聲波處理(model S_250D、Branson Ultrasonics Danbury),進一步在室溫下旋轉混合2小時後，溶解在生理鹽水中，以最終濃度為O. 5%的方式加入調節成中性的I % CVP (HIVISWAKO 104)。即，對每隻小鼠單鼻孔給藥2 μ L進行兩鼻孔給藥合計4 μ L，該4 μ L中所含組成為流感疫苗(HA)抗原蛋白量/AD載體溶液的磷脂質量/CVP重量=0. 2 μ g/2. O μ g/20 μ go另夕卜，該CVP添加黏膜疫苗的pH設為維持HA抗原蛋白的抗原性的範圍(7. 0-7. 2)。以下，將該CVP添加黏膜疫苗記為「HA+SF-10」。另外，如上所述，SF-10量為AD載體(2. Oyg)+CVPQOyg) = 22 μ g，但在下述說明中，用作為佐劑的載體作用的基本骨架的AD載體的磷脂質量進行表記，記為SF-10(2. 0μ g)。其它的實施例中的SF-10量也用除CVP量以外的值進行記載。實施例2根據實施例1的方法製備HA抗原蛋白量為0.1 μ g的CVP添加黏膜疫苗。HA抗原蛋白、AD載體及CVP的混合比與實施例1相同(即，含有抗原蛋白量10倍的AD載體和最終濃度0.5%的CVP)。實施例3根據實施例1的方法製備HA抗原蛋白量為0. 03 μ g的CVP添加黏膜疫苗。HA抗原蛋白、AD載體及CVP的混合比與實施例1相同(即含有抗原蛋白量10倍的AD載體和最終濃度0.5%的CVP)。比較例I製備專利文獻3的黏膜疫苗(HA+AD載體)。HA抗原蛋白及AD載體使用與實施例1相同的物質，根據實施例1製備疫苗。HA抗原蛋白量為0.2 μ g，AD載體量為2.0. μ g。比較例2
製備專利文獻5、6中所公開的黏膜疫苗(HA+CVP)。HA抗原蛋白及CVP使用與實施例I相同的物質，根據實施例1製備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，CVP為最終濃度O. 5 %。比較例3製備專利文獻4中所公開的黏膜疫苗(HA+HPC)。HA抗原蛋白使用與實施例1相同的物質，HPC使用市售的HPC 6. 0-10. O (和光純藥)。根據實施例1製備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，HPC量為20 μ g。比較例4·製備在專利文獻3的HA+AD載體中進一步添加了 HPC的黏膜疫苗(HA+AD載體+HPC)。HA+AD載體使用與比較例I相同的物質，HPC使用與比較例3相同的物質，根據實施例I製備疫苗。HA抗原蛋白量為O. 2 μ g，AD載體量為2. O μ g，HPC量為20 μ g。比較例5根據文獻((Asah1-OzakiY et al. , Microbes Infect 2006;8:2706-2714，Ichinohe T，et al.，J Virol 2005 ；79(5) :2910-2919)中記載的方法製備含有樹狀細胞的Toll樣受體(TLR)的配合基、即強烈刺激抗原呈遞細胞而促進抗體產生的poly(1.C.)(Alexis Corp)的黏膜疫苗(HA+poly (1. C.))。HA 抗原蛋白量為 0. 2 μ g，poly (1. C.)量為2 μ g0比較例6用生理鹽水稀釋HA抗原並將其用作疫苗。每隻的HA抗原蛋白給藥量為0. 2 μ g。[試驗I]使用小鼠，對經鼻黏膜疫苗的抗體產生增強作用進行試驗。1.黏膜疫苗· HA+SF-10 (實施例1)· HA+AD載體(比較例I)· HA+CVP (比較例 2)· HA+HPC (比較例 3)· HA+AD 載體 +HPC (比較例 4)· HA+poly (1. C.)(比較例 5)· HA單獨(比較例6)2.動物從日本SLC株式會社(日本靜岡)購入6-8周齡的雌BALB/c雌小鼠後使用。全部的動物實驗由德島大學醫學部實驗動物中心的感染動物舍(P2水平)進行，按照德島大學醫學部動物實驗委員會的操作規則來進行。3.免疫法在疫苗的經鼻給藥中，將上述I的5種黏膜疫苗以單鼻孔2μ L進行兩側給藥，將合計4μ L的疫苗向用氯胺酮(62. 6mg/Kg)及甲苯噻嗪(12. 4mg/Kg)麻醉的小鼠的兩側鼻腔點鼻給藥。對照使用與疫苗液等量的生理鹽水給藥組及比較例6 (HA抗原蛋白單獨給藥組)。各組由9_10隻小鼠構成。免疫對於初次免疫後第二周的由同樣的組成構成的樣品，對各組作為2次免疫進行等量經鼻給藥。在二次免疫後在第二周通過同樣的方法進行三次免疫，然後，在第二周採集樣品。另外，疫苗給藥合計進行三次，但即使以二次免疫結束也可得到基本相同的結果。4.小鼠鼻腔·肺泡清洗液及血清的製備製備三次免疫後第二周的小鼠的鼻腔·肺泡清洗液及血清並對病毒HA抗原特異性的 IgA、IgG進行測定。根據文獻(Mizuno D, Ide-Kurihara M, Ichinomiya T,Kubo I,KidoH. Modified pulmonary surfactant is a potentadjuvant that stimulates the mucosalIgA production in response to the influenza virus antigen. J Tmmunol.2006 ； 176 1122-30)記載的方法如下進行。在戊巴比妥麻醉下對疫苗給藥小鼠進行剖腹剖胸，切開氣管，向肺插入Atom靜脈導管帶節3Fr(Atom Medical株式會社日本 東京)，注入生理鹽水ImL,回收該液體。對其反覆採液三次，將得到的液體計3mL用作肺泡清洗液。在採取肺清洗液後，從切開後的氣管向鼻腔方向插入Atom靜脈導管，注入ImL的生理鹽水，對從鼻子流出的液體進行採液。將該液體用作鼻清洗液。進而對心臟採血，通過5，OOOrpmUO分鐘的離心分離製備血清。 5.抗流感抗體的定量依據上述文獻(MizunoD, et al. J Immunol. 2006 ; 176 :1122-30)的記載並通過ELISA分析對鼻腔、肺泡清洗液及血清中的抗流感IgA、IgG含量進行定量。ELISA分析按照BETHYL LABORATORIES公司(美國德克薩斯)的小鼠ELISA定量試劑盒的方法來進行。在 96 孔 Nunc-1mmuno plate (免疫板)(Nalgen Nunc International美國紐約)各孔中加入疫苗I μ g、牛血清白蛋白(BSA，SIGMA美國密蘇裡)lyg/mL PBS溶液100 μ L，在4°C下進行一晚固層化反應。然後，用清洗液(50mM Tris, O. 14M NaCl, O. 05%Tween 20，ρΗ8· O)清洗三次，除去疫苗液。在各孔中加入含有O. 15Μ NaClU % BSA的50mMTris-HCl緩衝液(pH 8. O) 200 μ L，在室溫下進行I小時的封閉反應。用清洗液對各孔衝洗三次後，添加以樣品結合緩衝液(50mM Tris,O. 15M NaCl, I % BSA, O. 05% Tween 20，pH8. O)適量稀釋了的鼻清洗液 肺清洗液或血清ΙΟΟμ L，在室溫下反應2小時。將羊抗小鼠IgA或IgG-辣根過氧化物酶(HRP) (BETHYL LABORATORIES INC.)用作二次抗體，使用TMBMicrowell Peroxidase Substrate System(Kirkegaard&Perry Laboratories, Inc.美國馬裡蘭州)進行顯色反應。在各孔中添加100 μ L 2Μ H2SO4 (和光純藥株式會社)，由此停止反應，用SPECTRAmax PLUS 384測定450nm的吸光度。作為用於定量的標準，使用對從上述肺清洗液純化的抗流感IgA及IgGlOng進行同樣操作而得到的吸光度。6.結果將抗流感HA抗體的誘導結果示於鼻清洗液中的IgA (左圖1)及血液中的IgG (右圖1)。另外，將各自的測定值示於表I。另外，圖2及表2表示各試驗組的HI效價。(I) HA抗原單獨給藥組(比較例6)的IgA量為24. 77ng/mL, IgG量為O. 54 μ g/mL,與此相對，在HA+SF-10 (實施例1)給藥組中，IgA量為3307. 60ng/mL, IgG量為568. 75 μ g/mL，鼻清洗液中的IgA增強至132倍，血清中的IgG增強至1137倍。確認到本申請發明的CVP添加黏膜疫苗(HA+SF-10)具有極強的抗體誘導效果(圖1、表I)。(2)對HA+SF-10 (實施例1)給藥組中的抗體產生量而言，與HA+AD載體(比較例I)相比IgA為15. 6倍，IgG為150倍，與HA+CVP (比較例2)相比IgA為10. 7倍，IgG為115. 4倍(圖1、表I)。HA+SF-10中的這樣的顯著優異的抗體誘導效果遠遠超過由專利文獻3中公知的黏膜疫苗(HA+AD載體)和專利文獻5、6中公知的CVP的單純組合所預測的範圍。(3) HA+HPC (比較例3)給藥組的抗體產生量與HA單獨給藥組(比較例6)相同或在其以下。另外，HA+AD載體+HPC (比較例4)給藥組的抗體產生量比HA+AD載體(比較例I)低(圖1、表I)。由以上結果確認到與CVP同樣地在滴鼻劑或黏膜疫苗中作為凝膠化劑眾所周知的HPC在與抗原並用或與AD載體並用時不具有免疫誘導增強效果。因此可推斷AD載體的佐劑效果的增強為不是以僅具有增稠效果的載體而是以AD載體特性為基礎的其增強效果。(4)HA+SF_10(實施例1)給藥組中的抗體產生量與HA+poly (1. C.)(比較例5)相t匕，鼻清洗液中的IgA為11. 4倍，血清中的IgG為2. 3倍(圖1、表I)。由該結果確認到本申請發明的CVP添加黏膜疫苗(HA+SF-10)與通過強烈刺激抗原呈現細胞從而促進抗體產生的poly(1.C.)相比，具有更強免疫誘導效果。[表I] 抗體效價
熱消洗液 IgA(ngZmL)Illi 丨gA(pg/mL)
mean S.D.1 S.E.1 I mean I S.D.1 S.E.1 生理鹽水 7.45 4.79 1.51 0.06 0.14 0.04 HA24.77 25.83 8.17 0.54 0.48 0.15
HA+AD 載體 211.94 167.90 53.10 3.84 0.91 0.29r HA+HPC 8.82 4.96 1.65 1.51 1.12 0.37-------
HA+AD 載體 56.92 89.05 29.68 2.46 1,67 0.56
I HPP
HA+CVP 309.34 231.08 77.03 4.93 1.61 0.54 HA+SF-10 3307.6 882.55 294.18 568.75 95.18 31.73
0
HA+poiy([ 289.78 136.40 43.13 246.04 90.93 28.76(5)根據流感疫苗的國際評價基準，將血液的病毒感染抑制效果HI超過40的疫苗判定為有效，但在HA+AD載體(比較例I)中，超過HI = 40的樣品為50%，以平均值計表示HI = 39。與此相對，在HA+SF-10(實施例1)中，全部例子的超過HI = 40，以平均值計表示HI = 213. 3的高值，另外，與HA+poly (1.C.)(比較例5)的HI = 137. O相比，顯示1. 56倍的強病毒感染抑制效果(圖2、表2)。[表2]HI 效價
權利要求
1.一種黏膜疫苗，其特徵在於，含有以下的組成 (a)包含合成肽和脂質的AD載體，所述合成肽包含KnLm的胺基酸序列，其中，η為4_8，m 為 11-20 ； (b)羧基乙烯基聚合物；及 (c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產生引起有效的免疫誘導和感染防禦效果的量的黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的量， 所述黏膜疫苗產生引起有效的免疫誘導和感染防禦效果的量的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG。
2.根據權利要求1的黏膜疫苗，其中，抗原蛋白(c)為即使利用與AD載體(a)的組合或與羧基乙烯基聚合物(b)的組合也不會產生引起有效的免疫誘導和感染防禦效果的量的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的量。
3.根據權利要求1的黏膜疫苗，其中，合成肽包含序列編號I或2的胺基酸序列。
4.根據權利要求1的黏膜疫苗，其中，脂質為卵磷脂、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸及油酸中的至少一種。
5.根據權利要求3的黏膜疫苗，其中，脂質為二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油及棕櫚酸的三種脂質混合物。
6.根據權利要求1的黏膜疫苗，其中，抗原蛋白為源自病原體的鈍化抗原、純化抗原、部分純化抗原、重組抗原或無毒化毒素、成為過敏原因的過敏原。
7.一種黏膜疫苗的製造方法，所述黏膜疫苗含有以下的組成 (a)包含合成肽和脂質的AD載體，所述合成肽包含KnLm的胺基酸序列，其中，η為4_8，m 為 11-20 ； (b)羧基乙烯基聚合物；及 (c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產生引起有效的免疫誘導的量的黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的量， 所述黏膜疫苗產生引起有效的免疫誘導的量的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG, 所述方法的特徵在於， (1)將所述(a)及(C)懸浮在水中， (2)將加溫和攪拌重複I次以上， (3)進行冷凍乾燥， (4)將冷凍乾燥體懸浮在生理鹽水中製備成規定濃度， (5)加入所述(b)的溶液。
全文摘要
本發明提供一種黏膜疫苗，其特徵在於，含有以下的組成(a)包含合成肽和脂質的AD載體，所述合成肽包含KnLm的胺基酸序列，其中，n為4-8，m為11-20；(b)羧基乙烯基聚合物；及(c)抗原蛋白，所述抗原蛋白為單獨不會產生引起有效的免疫誘導和感染防禦效果的量的黏膜免疫IgA及血中免疫IgG的量，所述黏膜疫苗產生引起有效的免疫誘導和感染防禦效果的量的抗原特異性黏膜免疫IgA及血中免疫IgG。本發明的黏膜疫苗與現有的黏膜疫苗相比，具有更強的抗體產生能力，作為其結果，能夠以極少量的抗原發揮優異的效果。
文檔編號A61K39/00GK103002908SQ20118001181
公開日2013年3月27日 申請日期2011年3月1日 優先權日2010年3月2日
發明者木戶博, 水野大 申請人:國立大學法人德島大學