使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統與方法

2023-04-30 09:43:01 2

專利名稱：使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統與方法
技術領域：
本發明涉及一種使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統及方法，可廣泛 適用於生物學、醫學，生物物理以及材料化學等領域的研究。
背景技術：
螢光探針是指在吸收特定波長的光後，可以把吸收光轉換為不同波長的光發射出 來的一類物質的統稱。使用不同的螢光探針可以標記樣品內部不同的位置，從而可以用來 探測樣品的微觀結構，還可以實時觀察螢光標記的基因及細胞在活體動物體內的活動及反 應。螢光顯微技術已經成為化學和生物樣品成像的有力工具。困擾螢光顯微技術的一個主要問題是樣品離焦部分的螢光信號帶來的背景幹擾。 如何消除背景噪聲，提高顯微圖像的信噪比和解析度是螢光顯微技術領域的研究熱點。激 光共聚焦螢光顯微術和全內反射螢光顯微術是目前最常用的兩種技術方案。雷射共聚焦螢光顯微利用高度聚焦的雷射束對樣品逐點掃描成像，螢光信號經過 探測針孔濾波後被光電倍增管探測收集，通過計算機軟體可以重新組合生成一個三維圖 像。雷射共聚焦螢光顯微具有三維成像能力而且還具有很好的空間解析度，但是由於它採 用點掃描成像方式，所以它的成像速度並不快而且也容易對樣品產生光損傷。全內反射(又稱全反射)是指當光線從光密介質進入到光疏介質，入射角大於臨 界角時，因為沒有折射而都是反射，故稱之為全內反射。從幾何光學的角度來看，當發生全 反射時，光線會在玻璃界面上完全反射而不進入液體溶液中。實際上，由于波動效應，有一 部分光的能量會穿過界面滲透到溶液中，這部分光場就是所謂的衰逝波。衰逝波平行於界 面傳播，垂直於界面強度指數衰減。衰逝場強度Ez可表示為Ez = E0e~z/dp。其中八=(nf sin2 θ - 22)_1/2定義為衰逝場的穿透深度。Etl是界面處的電場強度，λ是真空中的光波長，Ii1是光密媒質的折射率，η2是光疏 媒質的折射率。衰逝場的穿透深度非常小，通常只有200nm左右。細胞內的很多重要的生命活動過程均存在於細胞表面。全內反射螢光顯微利用全 內反射產生的衰逝波激發樣品，激發區域被限定在樣品表面的一薄層範圍內(200nm)，不受 到來自樣品內深層區域信號的幹擾，因此具有極高的信噪比和對比度，近年來已被生物物 理學家們廣泛應用於單分子的螢光成像中。另外，全內反射螢光顯微成像法不再採用掃描 成像而使用CCD相機，在一個時間點獲得一幅完整的二維圖像，大大提高了成像速度，減少 了樣品光損傷，從而成為研究細胞表面科學如生物化學動力學、單分子動力學的最有前途 的光學成像技術。全內反射螢光顯微成像根據其成像系統的不同可分為稜鏡型和物鏡型兩種。稜鏡 型系統在實現上比較簡單，也不容易受到入射光信號的幹擾，雷射經稜鏡耦合照射在樣品與載玻片的界面處(稜鏡與載玻片之間配以折射率匹配的浸沒油)，精確調整入射角使發 生全反射，螢光信號由樣品的另一面進入顯微物鏡並被CCD探測。稜鏡型系統的缺點是樣 品的位置受到稜鏡的限制，並且激發出的螢光要通過整個樣品才能被探測到，降低了成像 的對比度。物鏡型系統中樣品的放置則非常方便，顯微鏡的物鏡既作為收集樣品螢光信號的 接收器，同時又作為發生全內反射的光學器件。且可與多種其它技術相結合，例如雷射微加 工，光鑷技術等，因此展現出更加誘人的應用前景。由於細胞的典型折射率約為1.35，根據 snell定律，要想實現全內反射，顯微物鏡的數值孔徑NA必須大於1. 35，因此當我們使用為 NA = 1. 4的物鏡時，只有很小的一部分物鏡孔徑範圍(1. 4-1. 35 = 0. 05)可以被利用。在 實驗中，為了保證均勻的照明，雷射束通常被調製成為很細的光環進入顯微物鏡後瞳。如圖 1所示，通常使用一個圓形擋光板擋住平行光束的中間部分，顯然，擋光板擋住了大部分照 明光，所以整個系統的透過率很低(小於5% )，導致照明亮度不夠。針對現有物鏡型全內反射螢光顯微技術透過率低的缺點，本發明提出一種使用同 心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的技術與裝置。該裝置具有光能利用率高(接近100%) 的優點，並且可以方便的實現全內反射螢光顯微與普通寬場螢光顯微的切換。

發明內容
為了解決現有的物鏡型全內反射螢光顯微方法透過率低的問題，本發明提供一種 使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統及方法。本發明的技術解決方案為一種使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統，包括平行光發生裝置以及 依次設置在光路上的環形光束產生裝置、螢光激發裝置以及成像裝置，所述平行光發生裝置產生平行光，所述環形光束產生裝置設置在平行光的光路 上所述螢光激發裝置包括設置在環形光束產生裝置光路上的雙色鏡11、設置在雙色 鏡11反射光路上的顯微物鏡12以及設置在顯微物鏡上方的載物臺13 ；所述成像裝置包括第二反射鏡15、依次設置在第二反射鏡15反射光路上的筒鏡 16、濾光片17以及CXD相機18 ；所述第二反射鏡15設置在載物臺13的正下方；其特殊之處在於所述環形光束產生裝置包括與平行光入射方向成45度放置的 中空反射鏡6、與平行光同軸設置的凹面錐鏡7、設置在凹面錐鏡中心的凸面錐鏡8 ；所述凸 面錐鏡8的軸線正對中空反射鏡6的中心；所述雙色鏡11設置在中空反射鏡6的環形光束的反射光路上並與反射光方向成 45度角。上述環形光束產生裝置還包括望遠鏡系統，所述望遠鏡系統包括設置在中空反射 鏡6和雙色鏡11之間的第二透鏡9和第三透鏡10。上述平行光發生裝置包括雷射器1、光纖耦合器2、多模光纖3、第一透鏡4、以及設 置在第一透鏡4後的第一反射鏡5，所述中空反射鏡6設置在第一反射鏡5的反射光路上。一種使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的方法，其特殊之處在於包括以 下步驟
1產生平行光束；2產生環形光束將平行光穿過45度設置的中空反射鏡6，垂直入射到凸面錐鏡8上，再被凸面錐鏡 8反射到凸面錐鏡8外圓周側的凹面錐鏡7上，再被凹面錐鏡7反射至中空反射鏡6，再被 中空反射鏡6反射形成環形光束；3環形光束經螢光激發裝置後對樣品進行螢光激發；4將激發出的螢光信號成像。上述步驟3還包括全內反射螢光顯微與寬場螢光顯微的切換使凸面錐鏡8沿著凹面錐鏡7的軸線方向往返移動，調節環形光束在載物臺與被 測樣品界面處的匯聚角，當環形光束在載物臺與被測樣品界面處的匯聚角小於臨界角時為 寬場螢光顯微；當環形光束在載物臺與被測樣品界面處的匯聚角大於等於臨界角時，則為 全內反射螢光顯微。上述步驟2還包括環形光束髮散角的調節環形光束經過由第二透鏡9和第三透鏡10組成的望遠鏡系統後入射雙色鏡。上述步驟4還包括圖像清晰度的調節調節CXD相機18的增益係數、CXD製冷溫度以及曝光時間，得到清晰的顯微圖像。上述步驟3的具體步驟如下環形光束經過雙色鏡入射顯微物鏡，通過顯微物鏡 匯聚至載物臺，通過在載物臺和被測樣品的界面處產生的衰逝波照射被測樣品；在衰逝波 的激發下被測樣品發出螢光信號經顯微物鏡收集後，再穿過雙色鏡11入射至第二反射鏡 15。上述步驟4的具體步驟如下入射至第二反射鏡15的螢光信號經過筒鏡16和濾光片17進入C⑶相機18成像。本發明具有的優點1、本發明使用同心雙錐面鏡產生環形光束並用於全內反射螢光顯微，與普通的全 內反射螢光顯微技術相比，本發明光能幾乎為零浪費，光能利用率高(接近100%)，因而適 用於微型的低功率半導體雷射器作為照明光源，便於全內反射螢光顯微系統的集成。2、本發明通過沿軸向移動凸面錐鏡與凹面錐鏡內的相對位置，改變平行光環光場 的佔空比，也就是改變環形光束在載物臺與被測樣品界面處的匯聚角，從而可以方便地實 現全內反射螢光顯微與寬場螢光顯微的切換。全內反射螢光顯微只能觀察到界面處非常薄 的一層樣品發出的螢光，信噪比非常高；而寬場顯微雖然信噪比較低，但是它可以深入到樣 品內部觀察，比較方便。通常在進行全內反射螢光顯微實驗的同時，都需要進行同一位置寬 場顯微圖像的對比。如圖4和圖5所示。3、本發明所使用的雷射功率密度很低，對生物組織的破壞以及雷射漂白效應非常 小。首先，與點掃描的雷射共聚焦技術相比，全內反射螢光顯微是一種寬場顯微技術，寬場 顯微技術本身就具有弱的光漂白以及光損傷效應；另外，本發明使用同心雙錐面鏡產生環 形光束，透過率接近100%，因此可以使用低功率的雷射器，進一步減小了光損傷的可能性。


圖1是現有的使用擋光板產生環形光束的結構示意圖2是本發明使用同心雙錐面鏡產生環形光束示意圖；圖3是本發明使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統光路圖；圖4是直徑1 μ m螢光小球的寬場螢光顯微與全內反射螢光顯微的成像實驗結果 比較，其中a為寬場螢光顯微圖像，b為全內反射螢光顯微圖像；圖5是鈴蘭切片的寬場螢光顯微與全內反射螢光顯微的成像實驗結果比較，其中 a為寬場螢光顯微圖像，b為全內反射螢光顯微圖像；附圖標記為1-雷射器，2-光纖耦合器，3-多模光纖，4-第一透鏡，5-第一反射 鏡，6-中空反射鏡，7-凹面錐鏡，8-凸面錐鏡，9-第二透鏡，10-第三透鏡3，11-雙色鏡， 12-顯微物鏡，13-載物臺，14-樣品，15-第二反射鏡，16-筒鏡，17-濾光片，18-CCD相機。
具體實施例方式如圖2所示，本發明使用兩個頂角90度的錐面反射鏡(一個凸面鏡8，一個凹面 鏡7)同心放置，凹面錐鏡7中心有孔，凸面錐鏡8可在凹面錐鏡7中心孔內軸向移動。平 行光束穿過一個與入射光方向成45度放置的中空反射鏡7後，正入射凸面錐鏡8，光線經凸 面錐8反射90度後，再由凹面錐7反射90度，最後再經由中空反射鏡6反射90度後，可以 產生一個平行的環形光束。移動凸面錐鏡8與凹面錐鏡7的相對位置可以改變環形光束的 佔空比。與圖1的使用圓型擋光板產生空心光環的方法相比，本發明的技術方案顯然具有 非常高的光能利用率，而且可以很容易的改變光環的佔空比。使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統光路如圖3所示。雷射器1發出 的光束通過光纖耦合器2耦合進入多模光纖3。再通過多模光纖3去除空間相干性後，由第 一透鏡4準直為平行光束。調節第一反射鏡5使平行光束穿過中空反射鏡6後正入射凸面 錐8，光線經凸面錐鏡8反射90度後，再由凹面錐鏡7反射90度，最後再經由中空反射鏡6 反射90度後，可以產生一個平行的環形光束。移動凸面錐鏡8與凹面錐鏡7的相對位置可 以改變環形光束的佔空比。第二透鏡9和第三透鏡10組成的望遠鏡系統用來調整光環光 場的發散角，從而可以調整作用在樣品上衰逝場的面積。環形光束由雙色鏡11反射進入顯 微物鏡12，由顯微物鏡12匯聚在載玻片的界面處產生衰逝波。微調載物臺13使得樣品14 位於衰逝場中。衰逝波激發出的螢光信號經顯微物鏡12收集後，再穿過雙色鏡11，經第二 反射鏡15改變方向，最後經過筒鏡16和濾光片17進入CXD相機18。控制CXD相機18的 增益係數、CCD製冷溫度以及曝光時間，從而得到清晰的全內反射螢光顯微圖像。平移凸面 錐鏡8改變凸面錐鏡8與凹面錐鏡7內的相對位置，可以改變平行光環光場的佔空比，當環 形光束在載玻片與溶液界面處的匯聚角小於臨界角時，全反射條件將被破壞，一部分折射 光線將會進入溶液及樣品內部，從而可以實現全內反射螢光顯微與寬場螢光顯微的切換。實施例1 圖4是本發明裝置對直徑1 μ m螢光小球進行寬場螢光顯微與全內反射 螢光顯微的成像實驗比較。標尺10 μ m，實驗中顯微物鏡為63X，NA= 1.4顯微物鏡，雷射 器選用倍頻YAG雷射器，波長532nm。實驗時調節凸面錐鏡8在凹面錐鏡7內的相對位置， 可以實現全內反射螢光顯微與寬場螢光顯微的切換。圖4(a)是寬場螢光顯微圖像，可以看 到離焦位置的螢光小球帶來的背景噪聲。圖4(b)是全內反射螢光顯微圖像，只能看到焦平 面處的螢光小球，而且對比度很高。實施例2 圖5是本發明裝置對鈴蘭切片進行寬場螢光顯微與全內反射螢光顯微的成像實驗比較。標尺10 μ m，實驗中顯微物鏡為100X，NA= 1. 45顯微物鏡，雷射器選用 倍頻YAG雷射器，波長532nm。實驗時調節凸面錐鏡8在凹面錐鏡7內的相對位置，可以實 現全內反射螢光顯微與寬場螢光顯微的切換。圖4(a)是寬場螢光顯微圖像，可以看到離焦 位置的樣品自發螢光。圖4(b)是全內反射螢光顯微圖像，只能看到界面處的螢光信號，圖 像對比度很高。
權利要求
1.一種使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統，包括平行光發生裝置以及依 次設置在光路上的環形光束產生裝置、螢光激發裝置以及成像裝置，所述平行光發生裝置產生平行光，所述環形光束產生裝置設置在平行光的光路上； 所述螢光激發裝置包括設置在環形光束產生裝置光路上的雙色鏡(11)、設置在雙色鏡 (11)反射光路上的顯微物鏡(12)以及設置在顯微物鏡上方的載物臺(13)；所述成像裝置包括第二反射鏡(15)、依次設置在第二反射鏡(15)反射光路上的筒鏡 (16)、濾光片(17)以及CCD相機(18)；所述第二反射鏡(15)設置在載物臺(13)的正下方； 其特徵在於所述環形光束產生裝置包括與平行光入射方向成45度放置的中空反射 鏡(6)、與平行光同軸設置的凹面錐鏡(7)、設置在凹面錐鏡中心的凸面錐鏡(8)；所述凸面 錐鏡8的軸線正對中空反射鏡(6)的中心；所述雙色鏡(11)設置在中空反射鏡(6)的環形光束的反射光路上並與反射光方向成 45度角。
2.根據權利要求1所述的使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統，其特徵 在於所述環形光束產生裝置還包括望遠鏡系統，所述望遠鏡系統包括設置在中空反射鏡 (6)和雙色鏡(11)之間的第二透鏡(9)和第三透鏡(10)。
3.根據權利要求1或2所述的使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統，其 特徵在於所述平行光發生裝置包括雷射器(1)、光纖耦合器(2)、多模光纖(3)、第一透鏡(4)、以及設置在第一透鏡(4)後的第一反射鏡(5)，所述中空反射鏡(6)設置在第一反射鏡(5)的反射光路上。
4.一種使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的方法，其特徵在於包括以下步驟1產生平行光束； 2產生環形光束將平行光穿過45度設置的中空反射鏡(6)，垂直入射到凸面錐鏡(8)上，再被凸面錐 鏡(8)反射到凸面錐鏡(8)外圓周側的凹面錐鏡(7)上，再被凹面錐鏡7反射至中空反射 鏡(6)，再被中空反射鏡(6)反射形成環形光束；3環形光束經螢光激發裝置後對樣品進行螢光激發； 4將激發出的螢光信號成像。
5.根據權利要求4所述的使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的方法，其特徵在於所述步驟3還包括全內反射螢光顯微與寬場螢光顯微的切換 使凸面錐鏡(8)沿著凹面錐鏡(7)的軸線方向往返移動，調節環形光束在載物臺與被 測樣品界面處的匯聚角，當環形光束在載物臺與被測樣品界面處的匯聚角小於臨界角時為 寬場螢光顯微；當環形光束在載物臺與被測樣品界面處的匯聚角大於等於臨界角時，則為 全內反射螢光顯微。
6.根據權利要求4或5所述的使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的方法，其特 徵在於所述步驟2還包括環形光束髮散角的調節環形光束經過由第二透鏡(9)和第三透鏡(10)組成的望遠鏡系統後入射雙色鏡。
7.根據權利要求6所述的使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的方法，其特徵在於所述步驟4還包括圖像清晰度的調節調節C⑶相機(18)的增益係數、CXD製冷溫度以及曝光時間，得到清晰的顯微圖像。
8.根據權利要求7所述的使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的方法，其特徵 在於所述步驟3的具體步驟如下環形光束經過雙色鏡入射顯微物鏡，通過顯微物鏡匯 聚至載物臺，通過在載物臺和被測樣品的界面處產生的衰逝波照射被測樣品；在衰逝波的 激發下被測樣品發出螢光信號經顯微物鏡收集後，再穿過雙色鏡(11)入射至第二反射鏡 (15)。
9.根據權利要求8所述的使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的方法，其特徵在 於所述步驟4的具體步驟如下入射至第二反射鏡(15)的螢光信號經過筒鏡(16)和濾光片(17)進入CCD相機(18) 成像。
全文摘要
本發明涉及使用同心雙錐面鏡實現全內反射螢光顯微的系統與方法，包括平行光發生裝置以及依次設置在光路上的環形光束產生裝置、螢光激發裝置以及成像裝置，平行光發生裝置產生平行光，環形光束產生裝置設置在平行光的光路上；環形光束產生裝置包括與平行光入射方向成45度放置的中空反射鏡、與平行光同軸設置的凹面錐鏡、設置在凹面錐鏡中心的凸面錐鏡；本發明解決了現有的物鏡型全內反射螢光顯微方法透過率低的問題，具有光能利用率高接近100％的優點，並且可以方便地實現全內反射螢光顯微與普通寬場螢光顯微的切換。本發明完全可對單個細胞，甚至單個細胞器進行成像，滿足大多數活體生物實驗的要求。
文檔編號G01N21/64GK102004307SQ20101051328
公開日2011年4月6日 申請日期2010年10月20日 優先權日2010年10月20日
發明者嚴紹輝, 葉彤, 姚保利, 雷銘 申請人:中國科學院西安光學精密機械研究所