一種精確螢光定量檢測方法與流程
2023-05-05 13:33:07
本發明涉及一種精確螢光定量檢測方法，特別涉及一種利用螢光融合蛋白的精確定量檢測方法。
背景技術：
至上世紀70年代，發明酶標檢測技術平臺以來，免疫診斷行業已發生了翻天覆地的變化，使免疫檢測領域得到了快速成長。但由於酶標檢測體系檢測時間長，中間過程操作煩瑣，試劑檢測範圍窄，靈敏度低等缺點，因此該系統也慢慢的退出了臨床檢測的歷史舞臺。隨之而來的相繼又發明了膠體金標技術平臺，化學發光，時間分辨螢光檢測技術平臺以及免疫晶片技術平臺等。
免疫層析快速檢測技術是近年發達國家發展起來的一種快速免疫分析技術。其原理是樣本液在毛細遷移作用下在硝酸纖維素膜上遷移，其中的待測物與膜上一定區域的抗體(抗原)結合，通過有色標記物，十幾分鐘甚至幾分鐘內即可得到肉眼可見的直觀結果。免疫層析快速檢測技術不需將游離的抗體(抗原)和形成複合物的抗體(抗原)進行分離，省去了繁瑣洗滌步驟，因而操作便捷，出報告時間短，在基層醫療機構、急診、現場、家庭自檢等場所得到了廣泛的應用。常用的標記物為膠體金顆粒、酶、螢光蛋白以及微球等。
其中，螢光標記技術具有靈敏度高、操作簡單等特點，已被廣泛用於生物檢測領域。如dna測序、蛋白表達分析、細胞成像、活體成像、臨床診斷等。螢光微球技術是將聚苯乙烯羧基微球、螢光染料標記系統、雷射技術、應用流體學及微球專用流式細胞儀等有機整合在一起的一項新技術，通過螢光微球信號來進行實驗數據採集和分析，具有快速分析多重生物反應的特點及高靈敏度和特異性，可用於抗原抗體、核酸探針檢測等領域的研究。
螢光檢測生物體液中疾病標誌蛋白的有乾式免疫方法採用螢光微球偶聯抗體，結合疾病標誌蛋白，然後用激發光激發螢光物質，光電轉換器轉換光信號為電信號，通過計算機計算電信號強弱來測定疾病標誌蛋白含量。例如，實用新型cn205679621u涉及一種心衰疾病檢測系統，具體涉及一種用於心腦血管疾病檢測的免疫螢光檢測儀，包括橫向免疫螢光層析試劑卡和微型數位化檢測儀，微型數位化檢測儀包括冷光源螢光檢測組件、光電強度數字轉換計算組件和顯示器，橫向免疫螢光層析試劑卡活動插接在冷光源螢光檢測組件內，冷光源螢光檢測組件獲取橫向免疫螢光層析試劑卡的螢光信號並將其傳輸至光電強度數字轉換計算組件，所述光電強度數字轉換計算組件將螢光信號轉化為電信號並輸送至顯示器。所述的檢測儀，使檢測者在家就能進行心腦血管疾病檢查，並直接獲取數據結果，可實現快速定量的獲取橫向免疫螢光層析試劑卡的檢測數據。
然而，通常的螢光微球多為表面偶聯抗體，即將抗體分子通過特定的官能團偶聯到微球表面製得，由於螢光微球大小不一致，表面修飾的反應基團量非恆定，螢光均一性較差等不足，採用螢光微球檢測抗體時通常存在以下缺陷，例如：1)不能定量偶聯抗體，螢光值與抗體結合比不固定；2)固定過程中ph，鹽濃度變化等對抗體活性造成影響，一般批量生產後需要對檢測試劑，工藝複雜；3)螢光微球偶聯抗體會導致空間位阻，影響與抗原結合，定量不準確；4)螢光微球為10-100um直徑，在橫向免疫中擴散速度較慢一般需要15分鐘左右時間。因此，如今迫切需要一種新的檢測方法，即可以快速檢測、又可以精確定量，並且還便於攜帶，隨時隨地都可以使用。
抗體結合蛋白a(proteina)來源於金黃色葡萄球菌的一個株系，它含有5個可以和抗體igg分子的fc段特異性結合的結構域。蛋白a作為親和配基被偶聯到瓊脂糖基質上，可以特異性的和樣品中的抗體分子結合，而使其他雜蛋白流穿，具有極高的選擇性，一步親和層析就可達到超過95％的純度。1個蛋白a分子至少可以結合2個igg。蛋白a也可以結合另一些免疫球蛋白，如用於某些種屬的iga、igm的純化。
抗體結合蛋白g是一種源自鏈球菌g族的細胞表面蛋白，為三型fc受體。其通過類似於蛋白a的非免疫機制與抗體的fc段結合。像蛋白a樣，蛋白g可以與igg的fc區域特異性結合，不同的是，proteing瓊脂糖凝膠可以廣泛、更強地結合更多類型的igg，多克隆igg及人igg，同時血清蛋白結合水平更低，純度更高，配基脫落也相對更低。此外，蛋白g還可以和某些抗體的fab和f(ab』)2段結合。
因此可以看出，抗體結合蛋白如(proteina/g)是不同來源抗體純化首選介質，約70-80％的抗體純化使用proteina、proteing親和層析。因此，在本領域的廣泛認知中，蛋白g和蛋白a在抗體領域一般都是用於抗體純化，本領域中還未見利用在螢光檢測中使用抗體結合蛋白如(proteina/g)進行定量標記抗體的報導。
當前，心血管疾病如急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，ami)在世界範圍內已成為成年人最大的潛在殺手，近年來統計，我國心血管病的死亡率在人口死亡中佔40％，已高於歐美國家，屬心血管病高發國。因此，只有做到早預防、早發現及早救治，才能最大限度的防止致殘、致死後果，最大限度的改善心血管患者的預後和生活質量。20世紀90年代以來，臨床化學家們逐漸將診斷ami的研究重點轉移到心肌蛋白標誌物上。其中心肌肌鈣蛋白(cardiactroponin，ctn)是唯一存在於心肌中的收縮蛋白，對心肌壞死具有高度的敏感性和特異性。
心肌肌鈣蛋白是由ctni、ctnc以及ctnt組成的複合物，在肌肉收縮和舒張過程中起重要調節作用。其中，ctnc沒有心肌特異性，較少用於心肌損傷的檢查。在正常狀態下，ctni和ctnt均不能透過細胞膜進入血液循環，故健康人血內不含或含極低量的ctni、ctnt；當心肌細胞受損後，ctni及ctnt彌散進人細胞間質，較早的出現在外周血中。通常，心肌肌鈣蛋白在發病後3h～5h即可升高，15h～24h達高峰，持續時間久，5d～10d後降至正常。但ctnt在心臟中具有四個亞型，特異性低於ctni，且在腎衰竭、橫紋肌溶解病、肺炎和敗血症等疾病中，血液中ctnt通常也可增高，故在檢測中會出現假陽性現象。與此相反，ctni在心肌中無其它亞型，特異性高於ctnt，此外其分子量亦小於ctnt，在ami發病時，更早被釋放於血液中，因此，ctni可謂目前診斷ami最好的心肌損傷標誌物之一。
現有技術中多用放射免疫法、酶聯免疫吸附法、化學發光法及膠體金免疫層析法等測定ctni。但放射免疫法和酶聯免疫吸附法操作複雜，檢測耗時長；化學發光法對技術要求高，不易在臨床實驗室中進行常規開展。膠體金免疫層析法雖然具有標本用量少，簡便快速，便宜的優勢，然而當遇到某些樣品中抗原或抗體含量極低時，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結果，容易出現誤判，靈敏度較低。而普通的螢光免疫層析方法又存在無法定量偶聯抗體、對抗體活性有影響等缺陷。因此基於上述，本發明的發明人還將本發明所述螢光融合蛋白應用到ctni診斷中，從而實現ctni精確定量檢測。
技術實現要素：
在閱讀了優選實施方案和所附權利要求的詳細描述後，本發明的這些和其他目的、優點和用途將對本領域技術人員顯示出來。本發明旨在提供一種精確螢光定量檢測方法，特別涉及一種利用螢光融合蛋白的精確定量檢測方法，還涉及一種螢光融合蛋白，以及一種精確螢光定量檢測試劑條、試劑盒及其製備方法。
申請人出人意料的發現，利用抗體結合蛋白如(proteina/g)在抗體fc段結合2個抗體分子，能定量、定向固定抗體；同時抗體結合蛋白如(proteina/g)上預先通過基因工程技術融合紅色螢光蛋白。該方法能定量標記抗體，且在一般緩衝液中反應；紅色螢光在血液自發光中背景低；由於蛋白分子小，在橫向免疫擴散中穿透速度快，反應時間一般5-8分鐘就可以結束，減少長反應時間中抗原在結合墊中沉積效應。
因此，本發明提供了一種精確螢光定量檢測方法，所述方法包括以下步驟：
a)取血液，混入磷酸鹽緩衝液後加到試紙條的加樣墊上，所述試紙條包含有ctni單克隆抗體螢光蛋白複合物，所述螢光融合蛋白為螢光蛋白-proteing融合蛋白或螢光蛋白-proteina融合蛋白，所述的複合物為螢光融合蛋白和抗體按1:2摩爾比製備而成；
b)將試紙條放入免疫螢光定量分析儀中，定量得出被測物質的濃度；
c)依據參考值判定陰陽性。
在本發明的一個實施方式中，所述的精確螢光定量檢測方法包括以下步驟：
a)用採血管10ul血液，混入90ul磷酸鹽緩衝液後加到試紙條的加樣墊上，所述試紙條包含有ctni單克隆抗體螢光蛋白複合物，所述螢光融合蛋白為螢光蛋白-proteing融合蛋白或螢光蛋白-proteina融合蛋白，所述的複合物為螢光融合蛋白和抗體按1:2摩爾比製備而成；
b)將試紙條放入免疫螢光定量分析儀中，免疫螢光定量分析儀對光學信號進行測量和分析處理，5-8分鐘後讀取數據，定量得出被測物質的濃度；
c)據已知螢光蛋白數量的光學信號值計算血液中抗體結合的抗原量。
優選的，所述螢光融合蛋白為螢光蛋白-proteing融合蛋白或螢光蛋白-proteina融合蛋白。進一步地，所述螢光融合蛋白為胺基酸序列如seqidno：1所示的蛋白。優選的，所述螢光蛋白為紅色螢光蛋白或過渡金屬(如eu2+標記)的時間分辨螢光蛋白。
本發明還涉及一種螢光融合蛋白，所述蛋白的胺基酸序列如seqidno：1所示。進一步地涉及編碼所述螢光融合蛋白的dna、載體以及重組菌。
進一步地，本發明還涉及一種精確螢光定量檢測試劑條，以及包含所述試劑條的或試劑盒。所述試劑條包含硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板、吸水墊、樣品墊、螢光結合墊，所述結合墊中包含抗體-螢光融合蛋白複合物。所述螢光融合蛋白為螢光蛋白-proteing融合蛋白或螢光蛋白-proteina融合蛋白。進一步地，所述螢光融合蛋白的胺基酸序列如seqidno：1所示。優選的，所述螢光蛋白為紅色螢光蛋白或過渡金屬(如eu2+標記)的時間分辨螢光蛋白。
優選地，所述螢光融合蛋白和抗體按固定摩爾比，優選為按照1：2摩爾比混合後，通過分子篩純化形成抗體-螢光蛋白複合物。
優選地，所述硝酸纖維素膜為切成y型細條。
進一步地，所述螢光標記物還可以是螢光微球，螢光分子，過渡元素等。
此外，本申請還涉及一種含螢光融合蛋白的試紙條的製備方法，具體方法如下：
1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的製備：將硝酸纖維素膜切成y型細條，貼在pvc底板上，將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質控線，然後將硝酸纖維素膜-pvc底板置於乾燥箱乾燥；
2)將螢光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合後，通過分子篩純化得到抗體-螢光蛋白複合物，保存備用；
3)結合墊的製備：將結合墊切成細條，將鼠抗人ctni單克隆抗體螢光蛋白複合物按照2：1混合，均勻鋪在結合墊上，放入烘箱烤乾；
4)樣品墊的製備：將玻璃纖維膜切成細條；
5)吸收墊的製備：將吸水紙切成細條；
6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、螢光結合墊依次貼在pvc底板上，切成合適形狀的試劑條。
在本發明一個優選的實施方式中，所述的含螢光融合蛋白的試紙條的製備方法，具體方法如下：
1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的製備：將硝酸纖維素膜切成y型細條(40-60)mm×(2-4)mm，貼在pvc底板上。將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質控線。然後將硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板置於乾燥箱乾燥；
2)將螢光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合後，通過分子篩純化得到抗體-螢光蛋白複合物。保存備用；
3)結合墊的製備：將結合墊切成(40-60)mm×(6-12)mm細條，將鼠抗人ctni單克隆抗體-螢光蛋白複合物按照2：1混合，均勻鋪在結合墊上，放入烘箱烤乾；
4)樣品墊的製備：將玻璃纖維膜切成(6-12)mm×(6-12)mm細條；
5)吸收墊的製備：將吸水紙切成(3-6)mm×(6-12)mm細條；
6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、螢光結合墊依次貼在pvc底板上，將貼好的中間物，用雷射切割機切成合適形狀的試劑條。
基於上述，本發明利用螢光蛋白融合抗體結合蛋白，能定量標記抗體，且不影響抗體結合的空間位阻，增加了檢測靈敏度，減少反應時間，減少成本。此外，本發明的試劑條採用y型結構，加快流速，減少反應時間，採集螢光利用cmos疊加和mppc單光子技術，增加靈敏度。
附圖說明
圖1表示本發明螢光定量檢測試劑條俯視圖，其中1為樣品墊，2為吸收墊，3為結合墊。
圖2表示本發明螢光定量檢測試劑條側視圖，其中1為樣品墊，2為吸收墊，3為結合墊。
圖3表示本發明的螢光檢測方法與普通螢光檢測方法曲線比較。
圖4表示本發明的螢光檢測方法與普通螢光檢測方法曲線極限值比較。
具體實施方式
需要說明的是，在不衝突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。下面將結合實施例來詳細說明本發明。
實施例1螢光融合蛋白的製備
1)通過載體序列擴增紅色螢光蛋白基因，同時擴增抗體結合蛋白基因，擴增序列通過平末端連接，然後用pcr擴增融合蛋白基因，引物序列、反應體系以及擴增體系分別見表1和表2。
表1引物序列
表2反應體系以及擴增程序
2)通過基因工程手段，把seqidno：1裝入表達載體，表達螢光蛋白-proteing融合蛋白。把基因序列裝入pet-28a表達載體後，轉化入bl21(de3)菌，用iptg誘導表達，具體步驟如下：
插入pgem-teasy載體，連接體系：pcr產物與pgem-teasy連接：pcr產物15μl，pgem-teasy0.5μl，t4連接酶2μl，連接緩衝液2μl，4℃連接24-48小時。
連接產物取出10μl，加入100μl感受態細胞，靜置30-60分鐘，放入42℃水浴中45-90秒後立刻置冰上2分鐘，然後加入800μllb培養基，37℃搖動1-2小時。取出100μl塗於含有80μg/mlx-gal和100μg/ml氨苄青黴素的lb瓊脂糖培養平板。
挑取白斑後在1ml含有100μg/ml氨苄青黴素的lb培養基中37℃搖動4-12小時，通過測序驗證插入片段序列。選取完全一致序列的克隆，然後在5ml含有100μg/ml氨苄青黴素的lb培養基中37℃搖動24小時。
通過康為抽提質粒試劑盒抽提質粒，獲得5μg質粒後進行酶切。用內切酶bamhi2μl、xhoi2μl、smartcutbuffer5μl、質粒和水40μl、37℃水浴4-12小時。通過瓊脂糖電泳後切取目的條帶，通過膠回收試劑盒提取目的dna片段。
連接pet28a質粒：預切pet28a質粒1μl，融合蛋白dna15μl，t4連接酶2μl連接緩衝液2μl，4℃連接24-48小時。
連接產物取出10μl，加入100μl感受態細胞，靜置30-60分鐘，放入42℃水浴中45-90秒後立刻置冰上2分鐘，然後加入800μllb培養基，37℃搖動1-4小時。取出100μl塗於含有卡那黴素的lb瓊脂糖培養平板。
挑取白斑後在1ml含有50μg/ml卡那黴素的lb培養基中37℃搖動4-12小時，通過測序驗證插入片段序列。選取完全一致序列的克隆，然後在5ml含有50μg/ml卡那黴素的lb培養基中37℃搖動24-48小時。
通過康為抽提質粒試劑盒抽提質粒，獲得5ng-1μg質粒後加入100μlde3感受態細胞，靜置30分鐘，放入42℃水浴中45-90秒後立刻置冰上2分鐘，然後加入800μllb培養基，37℃搖動1-4小時。取出100μl塗於含有50μg/ml卡那黴素的lb瓊脂糖培養平板。
挑取白斑後在1ml含有50μg/ml卡那黴素的lb培養基中37℃搖動4-12小時。然後加入500ml含有50μg/ml卡那黴素的lb培養基，待菌液濃度達到od600＝0.8時，加入iptg試劑誘導。37℃搖動8-12小時。離心收穫菌體。
涉及的裂解緩衝液、清洗液、洗脫液見表3
表3裂解緩衝液、清洗液、洗脫液
3)用gehealthcareni2+sepharose4b純化，隨後用sephacryls-200純化43kd融合蛋白，蛋白為深紅色，其純度可達95％以上。具體步驟如下：
5g溼菌體中加入50ml的裂解緩衝液，冰浴並用超聲破碎，4℃12,000g離心30分鐘，收集上清，然後使用gehealthcare的蛋白純化填料ni-sepharose瓊脂純化融合蛋白，4℃過柱平衡過夜，用清洗液洗ni-sepharose瓊脂，清洗20ml後加入洗脫液洗脫蛋白。
所獲純化蛋白用半透膜透析，然後用peg8000稀釋濃縮樣品(10倍濃縮)。融合蛋白和抗體按固定比例混合，4℃混勻過夜。然後樣品用分子篩分離，取最先流出組份。測量濃度後備用。
實施例2螢光定量檢測試劑條或試劑盒的製備
1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的製備：將硝酸纖維素膜切成y型細條52mm×3mm，貼在pvc底板上。將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質控線。然後將硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板置於乾燥箱乾燥。
2)將螢光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合後，通過分子篩純化得到抗體-螢光蛋白複合物，保存備用。
3)結合墊的製備：將結合墊切成52mm×10mm細條，將鼠抗人ctni單克隆抗體-螢光蛋白複合物、按照2：1比例混合後的純化液，均勻鋪在結合墊上，放入烘箱烤乾。
4)樣品墊：將玻璃纖維膜切成10mm×10mm細條。
5)吸收墊：將吸水紙切成5mm×10mm細條。
6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、螢光結合墊依次貼在pvc底板上，將貼好的中間物，用雷射切割機切成合適形狀的試劑條，如圖1和圖2所示，1為樣品墊，2為吸收墊，3為結合墊。
實施例3試紙條或試劑盒的檢測標準曲線的建立以及檢測效果評價
3.1標準品建立標準曲線
將購買的ctni螢光蛋白-proteing融合蛋白用50％的小牛血清緩衝液配製0，0.5，2.5，5，10，25，50，100ng/ml八個濃度。在測試區加入100μl樣品後，等待5分鐘，用儀器讀取螢光值。建立標準曲線為：y＝f(x)。y：樣品濃度；x：螢光信號值。每批的每個樣品重複測試5次記錄其相應的螢光信號值。螢光值由機器讀出。待測樣品濃度通過y』＝(mctni/m融合蛋白)*δ*y計算得到。m表示分子量；δ為螢光融合蛋白和抗體的稀釋比例。
3.2試劑條檢測速度評價
稀釋ctni標準品(芬蘭hytest公司)，用不含有ctni的標準血清(芬蘭hytest公司)，製成0.5ng/l的樣品。取十個試劑條加入測試樣品0.5ng/ml後在3分鐘，5分鐘，10分鐘和其他他商業化試劑條15分鐘後通過螢光值判定數值，結果見表4。
表4試紙條檢測速度驗證
結果表明在5分鐘時就可以得到陽性數據，9分鐘達到穩定，比普通商業化試劑的15分鐘要節省40％的時間。
3.3試劑條檢測靈敏度
每批的每個樣品重複測試20次記錄其相應的螢光信號值。
取標準ctni樣品(芬蘭hytest公司)試劑0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0ng/ml點樣，然後讀取螢光值，同時比較普通螢光檢測試劑條，結果見圖3，從圖中可以看出融合蛋白螢光曲線高於普通螢光微球，顯示較高的靈敏度。通過對極限值判讀，見圖4，可以在0.01ng/ml讀出陽性。靈敏度檢測發現在0.01ng/ml的ctni即可檢測到，上述靈敏度對心衰或心肌梗塞診斷有典型的臨床意義(圖3)。
實施例4試紙條或試劑盒的使用方法以及臨床評估
1、用採血管吸取10ul血液，混入90ul磷酸緩衝液後加到試紙條的加樣墊上；
2、將試紙條放入免疫螢光定量分析儀中，8分鐘後讀取數據；
3、採用免疫螢光定量分析儀對光學信號進行測量和分析處理，定量得出被測物質的濃度；
4、依據參考值判定陰陽性。
螢光採集方法：用395nm雷射通過光纖在膜表面形成均勻光斑，再成像組件cmos相機用600nm濾鏡過濾，每隔20ms採集一次，每次曝光後圖像疊加優化。共疊加20次。或用光子計數器mppc直接讀取數值。
本發明的融合螢光蛋白方法檢測心梗患者陽性率與一般螢光微球法檢測陽性率進行比較，結果見下表5。可見，本發明的融合螢光蛋白方法陽性檢出率高於一般螢光微球法檢測陽性率，能夠很好地取代一般螢光微球法檢測方法以及試劑條。
表5本發明的融合螢光蛋白方法與螢光微球方法比較
基於上述原理，製備其他疾病標誌蛋白的螢光蛋白-proteing/proteina融合蛋白試劑條或試劑盒，檢測結果如準確度、靈敏度均優於所採用的現有市售酶聯免疫或螢光檢測試劑盒，因此，利用本發明提供的螢光融合蛋白檢測試劑盒能夠提供更為準確有效的檢測相關信息。
雖然本發明已作了詳細描述，但對本領域技術人員來說，在本發明精神和範圍內的修改將是顯而易見的。此外，應當理解的是，本發明記載的各方面、不同具體實施方式的各部分、和列舉的各種特徵可被組合或全部或部分互換。在上述的各個具體實施方式中，那些參考另一個具體實施方式的實施方式可適當地與其它實施方式組合，這是將由本領域技術人員所能理解的。此外，本領域技術人員將會理解，前面的描述僅是示例的方式，並不旨在限制本發明。
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程秋萍、王雲志
一種精確螢光定量檢測方法
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