一種骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法
2023-05-24 02:15:26
一種骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法
【專利摘要】本發明涉及一種骨髓間充質幹細胞向成骨細胞分化的骨髓間充質幹細胞體外擴增純化培養的方法，所用細胞培養基的組成如下：PL血小板裂解液5-20％，肝素2-5U/ml，強力黴素5-10μg/ml，基礎培養基DMEM或基礎培養基AMEM；本發明採用骨髓間充質幹細胞的分離提取、細胞接種、細胞培養、更換細胞培養液、細胞傳代的方法，獲得的骨髓間充質幹細胞純度高，體外增殖能力強，並且具有較好的向成骨細胞分化的能力。
【專利說明】一種骨髓間充質幹細胞在體外擴増純化培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及骨髓間充質幹細胞的採集，分離提取，細胞在體外培養擴增純化的【技術領域】，具體地說是一種骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法。
【背景技術】
[0002]骨髓間充質幹細胞來源於發育早期的中胚層，是非終末分化細胞，它具有多項分化的能力，相關研宄已經表明這種幹細胞可分化為成骨、軟骨、脂肪、以及神經細胞等，這種細胞易於採集，分離培養，而且在體外具有很強的自我更新，分化能力和免疫抑制等優點，使其在組織器官缺損性疾病，組織器官退行性疾病以及細胞治療和組織工程領域具有重要的應用前景，近年來在國內外有眾多的研宄探索骨髓間充質幹細胞的體外分離及培養方法，主要有細胞貼壁分離，密度梯度離心和細胞分選等方法，結果顯示通過貼壁傳代分離的細胞純度低，梯度離心和細胞分選可獲得較高純度的細胞，但細胞活力相對較低，且所需骨髓量較大，影響後續的研宄和應用，同時通過這些方法獲得的骨髓間充質幹細胞在傳代培養的過程中將逐漸失去擴增的能力。
【發明內容】
[0003]本發明針對現有技術的不足，提供一種骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法。
[0004]本發明所採取的技術方案是:一種骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法，其特徵在於，所述的方法包括:
[0005](I)骨髓血的採集:從髂後上棘抽取骨髓血。
[0006](2)有核細胞的分離提取:
[0007]A、密度梯度離心:將骨髓血注入無菌離心管a內進行離心，離心後骨髓血在離心管內分為三層，上層為上清液，中間層為一層薄薄絮狀白膜層的有核細胞層，下層為紅細胞層；
[0008]B、有核細胞層的分離提取:第一次有核細胞層的分離提取:取上層的上清液和中間層的白膜層的有核細胞層放入無菌離心管b內進行離心，離心後取出上層上清液放回離心管a內進行離心；第二次有核細胞層的分離提取:取上層的上清液和中間層的白膜層的有核細胞層放入無菌離心管b內進行離心。
[0009](3)細胞計數:用PBS將兩次提取的有核細胞層混勻，取100 μ I細胞懸液對有核細胞和紅細胞進行計數。
[0010](4)細胞接種:根據計數的有核細胞和紅細胞分別按初始密度為0.8-1.0X 16/cm2和1.0-1.2X10 8/cm2接種於細胞培養瓶內。
[0011](5)原代細胞的培養:用適合於原代細胞培養的完全培養基將分離提取的有核細胞混勻，接種於細胞培養瓶內，再將盛有細胞的細胞培養瓶置於飽和溼度的細胞培養箱內進行培養，細胞培養箱內0)2為5%，02為5%，溫度為37°0，培養時間為24-7211時；進行細胞換液，棄掉培養瓶內的培養液，用PBS洗滌2次細胞培養瓶細胞貼壁面，洗滌後加入新配置的原代細胞培養所用的完全培養基；每隔三天更換一次原代細胞培養所用的完全培養基，當細胞長至80%以上時，對細胞進行收集傳代。
[0012](6)原代細胞收集傳代:a、棄掉培養瓶內的培養基，用PBS洗滌培養瓶細胞貼壁面2次，棄掉PBS ;b、在培養瓶內加入0.25%胰酶，在室溫消化小於等於3分鐘；c、當細胞從細胞培養瓶貼壁面開始部分脫落時，細胞培養瓶內加入第一代及第一代以後細胞培養所用的完全培養基，終止消化；d、取100 μ I細胞懸液用於細胞計數，通過離心提取細胞，細胞接種密度為6000-10000個/cm2進行培養。細胞接種密度的高低要視細胞擴增的速度和預計培養的天數而定。
[0013](7)第一代及第一代以後的細胞培養及傳代:a、將盛有細胞的細胞培養瓶置於飽和溼度的細胞培養箱內進行培養，細胞培養箱內0)2為5%，溫度為37°C ;b、當細胞長至80%以上時；c、棄掉培養瓶內的培養基，用PBS洗滌培養瓶細胞貼壁面2次，棄掉PBS ；d、在培養瓶內加入0.25%胰酶，在室溫消化小於等於3分鐘；e、當細胞從細胞培養瓶貼壁面開始部分脫落時，細胞培養瓶內加入第一代及第一代以後細胞培養所用的完全培養基，終止消化；f、取100 μ I細胞懸液用於細胞計數，通過離心提取細胞，細胞接種密度為6000-10000個/cm2進行培養。
[0014]細胞培養所用的完全培養基:
[0015]原代細胞培養所用的完全培養基的終濃度組成如下:PL血小板裂解液5-20%，肝素2-5U/ml，強力黴素5-10 μ g/ml，基礎培養基為DMEM。
[0016]第一代及第一代以後細胞培養所用的完全培養基的終濃度組成如下:PL血小板裂解液5-20 %，肝素2-5U/ml，強力黴素5_10 μ g/ml，基礎培養基為AMEM。
[0017]所述的0.25%胰酶含有0.02% EDTA。
[0018]本發明的有益效果是:
[0019]1.人體髂後上棘的骨髓血比較豐富，易於抽出並能獲得足量的骨髓間充質幹細胞。
[0020]2.在骨髓間充質細胞分離提取時單純的利用密度梯度離心法，沒有加入細胞分離液等試劑，減少了外界試劑對細胞的傷害，同時也減少了實驗的成本，並且能夠獲得大量的間充質幹細胞。
[0021]3.根據細胞貼壁速度不同，在早期更換細胞培養液，去除骨髓中的造血幹細胞，其他類型的細胞以及上清液中存在的細胞碎片，利於細胞的早期純化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1更換完全培養液後，原代培養第2天的細胞形態。
[0023]圖2培養細胞的第8天，細胞群落慢慢融合至80%以上時的細胞形態。
[0024]圖3培養細胞的第11天，此時為第一代細胞，長至80%以上時的細胞形態。
[0025]圖4培養細胞的第14天，此時為第二代細胞，長至80%以上時的細胞形態。
[0026]圖5培養細胞的第17天，此時為第二代細胞，長至80%以上時的細胞形態。
【具體實施方式】
:
[0027]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述:
[0028]實施例1:
[0029]一種骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法，包括以下步驟:
[0030](I)骨髓血的採集:從志願者的髂後上棘抽取60ml骨髓血。
[0031](2)有核細胞的分離提取:
[0032]A、密度梯度離心:將骨髓血注入無菌離心管a內進行離心，離心後骨髓血在離心管內分為三層，上層為上清液，中間層為一層薄薄絮狀白膜層的有核細胞層，下層為紅細胞層；在不添加任何細胞分離液的情況下進行密度梯度離心。B、有核細胞層的分離提取:第一次有核細胞層的分離提取:取上層的上清液和中間層的白膜層的有核細胞層放入無菌離心管b內進行離心，離心後取出上層上清液放回離心管a內進行離心；在將白膜層及上清液取出時，為了獲得更多的有核細胞，可以夾帶少量紅細胞，放入無菌離心管b內，將盛有白膜層，上清液及少量紅細胞的離心管進行離心，離心後取出不能帶有白膜層及紅細胞的上清液放回離心管a內。第二次有核細胞層的分離提取:取上層的上清液和中間層的白膜層的有核細胞層放入無菌離心管b內進行離心。步驟同第一次有核細胞層的分離提取。
[0033](3)細胞計數:用PBS將兩次提取的有核細胞層混勻，取100 μ I細胞懸液對有核細胞和紅細胞進行計數；
[0034](4)細胞接種:對有核細胞和紅細胞進行計數，根據其數量計算出所需細胞培養瓶的面積，然後根據細胞培養瓶的數量配製所需完全培養基的體積，將計數完畢的有核細胞和紅細胞分別按初始密度為0.8-1.0X 1fVcm2和1.0-1.2X10 8/cm2接種於細胞培養瓶內。
[0035](5)原代細胞的培養:此時用原代細胞培養的完全培養基將細胞混勻，接種於細胞培養瓶內，再將盛有細胞的細胞培養瓶置於飽和溼度的細胞培養箱內進行培養，細胞培養箱內0)2為5%，02為5%，溫度為37°C，培養時間為24-7?時；進行細胞換液，棄掉培養瓶內的培養液，用PBS洗滌2次細胞培養瓶細胞貼壁面，洗滌後加入新配置的原代細胞培養所用的完全培養基；每隔三天更換一次原代細胞培養所用的完全細胞培養基，當細胞長至80%以上時，對細胞進行收集傳代。
[0036](6)原代細胞收集傳代:棄掉培養瓶內的培養基，用PBS洗滌培養瓶細胞貼壁面2次，在洗滌的過程中左右晃動培養瓶時動作要緩慢，避免細胞被PBS從細胞貼壁面洗下來，棄掉PBS ;向培養瓶內加入0.25%胰酶，所述的0.25%胰酶含有0.02% EDTA，在室溫消化不超過3分鐘；當細胞從細胞培養瓶貼壁面開始部分脫落時，此時拍打細胞培養瓶的側壁，當細胞全部從細胞培養瓶的細胞貼壁面脫落下來後，將第一代及第一代以後細胞培養的完全培養基加入培養瓶內，終止消化細胞；取100 μ I細胞懸液用於細胞計數，通過離心提取細胞，細胞接種密度為6000-10000個/cm2進行培養。
[0037](7)第一代及第一代以後的細胞培養及傳代:a、將盛有細胞的細胞培養瓶置於飽和溼度的細胞培養箱內進行培養，細胞培養箱內0)2為5%，溫度為37°C ;b、當細胞長至80%以上時；c、棄掉培養瓶內的培養基，用PBS洗滌培養瓶細胞貼壁面2次，棄掉PBS ；d、在培養瓶內加入0.25%胰酶，在室溫消化小於等於3分鐘；e、當細胞從細胞培養瓶貼壁面開始部分脫落時，細胞培養瓶內加入第一代及第一代以後細胞培養所用的完全培養基，終止消化；f、取100 μ I細胞懸液用於細胞計數，通過離心提取細胞，細胞接種密度為6000-10000個/cm2進行培養。
[0038]上述骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養所有的完全培養基的製備:
[0039]原代細胞培養所用的完全培養基的終濃度組成如下:PL血小板裂解液5-20%，肝素2-5U/ml，強力黴素5-10 μ g/ml，基礎培養基為DMEM培養液。
[0040]第一代及第一代以後細胞培養所用完全培養基的終濃度組成如下:PL血小板裂解液5-20 %，肝素2-5U/ml，強力黴素5_10 μ g/ml，基礎培養基為AMEM培養液。
[0041]實施例2:
[0042]1.骨髓血的採集:從志願者的髂後上棘抽取60ml骨髓血
[0043]2.有核細胞(主要是骨髓間充質幹細胞)的分離提取:將60ml的骨髓血等量放入編號分別為①和②的離心管內，在200g，6min室溫的條件下進行密度梯度離心，離心後骨髓血分為三層，上層為上清液，中間層為薄薄白色絮狀的有核細胞層，下層為紅細胞層，此時進行第一次有核細胞層的分離提取:分別將編號為①和②離心管內的有核細胞層及上清液取出，為了獲得更多的有核細胞，可以少取一些紅細胞，放入編號為③的無菌離心管內，將編號為③的離心管在1000g，6min室溫的條件進行離心，離心後取出不能帶有白膜層及紅細胞的上清液分為等量兩份放回編號為①和②的離心管內，重新混勻後進行第二次有核細胞的分離提取，步驟同第一次有核細胞的分離提取。
[0044]3.細胞計數:用PBS將兩次提取的有核細胞混勻，放在編號為⑤的離心管內，取100 μ I細胞懸液對有核細胞和紅細胞進行計數，計數結果:有核細胞451.5Χ 106，紅細胞572.25Χ108。
[0045]4.細胞接種:根據有核細胞和紅細胞計數，計算出要用細胞培養瓶的面積，再根據細胞培養瓶的數量配製原代細胞培養所用完全培養基的體積，將計數完畢的有核細胞和紅細胞分別按初始密度為0.86 X 1fVcm2和1.09X 10 8/cm2接種於3個175cm 2細胞培養瓶內。
[0046]5.原代細胞的培養:將盛有細胞的細胞培養瓶置於0)2為5%，02為5%，溫度為370C，飽和溼度的細胞培養箱內進行培養，培養到48小時，細胞進行換液，棄掉培養瓶內的培養液，用PBS輕輕洗滌細胞培養瓶細胞貼壁面2次，棄掉PBS之後加入原代細胞培養所用的完全培養基，48小時的細胞圖片見(圖1)，細胞呈長梭型，群落式生長，在第5天換一次原代細胞培養所用的完全細胞培養基，同第一次換液，在第八天細胞長至80%以上時，細胞圖片見(圖2)，細胞呈長梭型，旋渦式生長，將細胞進行收集傳代。
[0047]6.原代細胞收集傳代:棄掉培養瓶內的培養基，用PBS輕輕洗滌培養瓶細胞貼壁面2次，棄掉PBS，每個細胞培養瓶加入0.25%胰酶6ml，胰酶含有0.02% EDTA，室溫消化不超過3分鐘，當細胞從細胞培養瓶貼壁面脫落時，每個細胞培養瓶內加入6ml第一代細胞培養所有的完全培養基終止消化，將所有的細胞懸液放入一個容器內混勻，取100 μ I細胞懸液用於細胞計數，通過細胞計數得知骨髓間充質幹細胞的計數總量為15.2X 106，將細胞接種於11個Τ175細胞培養瓶內，細胞接種密度為7896/cm2進行培養。
[0048]7.第一代細胞及以後代次細胞的培養擴增純化:將盛有細胞的細胞培養瓶置於0)2為5%，溫度為37°C，飽和溼度的細胞培養箱內進行培養，每天觀察細胞的形態和融合度，在細胞培養的第11天，細胞長至80%以上，細胞圖片見(圖3)，此時將細胞傳代，繼續培養擴增純化，細胞傳代的步驟與原代細胞收集傳代的步驟相同，在細胞培養的第14天，細胞長至80%以上，見(圖4)，此時繼續將細胞傳代擴增純化，在細胞培養的第17天，細胞長至80%以上，細胞圖片見(圖5)。
[0049]骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養所用的完全培養基的製備:
[0050]原代細胞培養所用完全培養基的配製:根據細胞培養瓶所需完全培養基90ml，終濃度組成如下，PL血小板裂解液按10%添加，需要9ml，肝素按5U/ml添加，需要450U，強力黴素按8 μ g/ml添加，需要720 μ g，需要基礎培養基DMEM 81ml，配製完成後放在37°C恆溫水浴鍋預熱5min，待用。
[0051]第一代細胞培養所用的完全培養基配製:根據細胞培養瓶所需完全培養基330ml，終濃度組成如下，PL血小板裂解液按10%添加，需要33ml，肝素按5U/ml添加，需要1650U，強力黴素按8 μ g/ml添加，需要2640 μ g，需要基礎培養基AMEM207ml，配製完成後放在37°C恆溫水浴鍋預熱5min，待用。
[0052]由於骨髓間充質幹細胞貼壁生長，貼壁時間較快等特性，在細胞培養的過程中不斷的得到純化，同時為了防止細胞在培養的過程中發生細胞老化，變異，分化等潛在的危險，一般細胞培養天數不超過21天，細胞培養代次在P3或P4。骨髓間充質幹細胞表面抗原的檢測:取第3代長至80%以上的貼壁細胞，用胰蛋白酶消化，計數後取2X 16個細胞，分裝 6 管，每管加入 10 μ I 螢光標記抗體 CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、⑶166-ΡΕ，另設I管為空白對照，室溫避光30分鐘；用PBS反覆洗2_3次，減少非特異性結合；加入200 μ IPBS混勻細胞，並以I %多聚甲醛固定，4 °C保存，24小時內上流式細胞儀檢測，經流式細胞儀表型分析得知，表達骨髓間充質幹細胞標記⑶73(98.6% )、CD105(97.7% )、CD166(97.4% )，不表達造血細胞標記⑶45 (0.2% )、CD34(0.4% )，此檢測表明骨髓間充質幹細胞的純度較高。
【權利要求】
1.一種骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法，其特徵在於，所述的方法包括: (1)骨髓血的採集:從髂後上棘抽取骨髓血。 (2)有核細胞的分離提取:A、密度梯度離心:將骨髓血注入無菌離心管a內進行離心，離心後骨髓血在離心管內分為三層，上層為上清液，中間層為一層薄薄絮狀白膜層的有核細胞層，下層為紅細胞層； B、有核細胞層的分離提取:第一次有核細胞層的分離提取:取上層的上清液和中間層的白膜層的有核細胞層放入無菌離心管b內進行離心，離心後取出上層上清液放回離心管a內進行離心；第二次有核細胞層的分離提取:取上層的上清液和中間層的白膜層的有核細胞層放入無菌離心管b內進行離心。 (3)細胞計數:用PBS將兩次提取的有核細胞層混勻，取100μ I細胞懸液對有核細胞和紅細胞進行計數。 (4)細胞接種:根據計數的有核細胞和紅細胞分別按初始密度為0.8-1.0X 1fVcm2和1.0-1.2 X 1Vcm2接種於細胞培養瓶內。 (5)原代細胞的培養:用原代細胞培養所用的完全培養基將提取的細胞混勻，接種於細胞培養瓶內，將盛有細胞的細胞培養瓶置於飽和溼度的細胞培養箱內進行培養，細胞培養箱內0)2為5%，02為5%，溫度為37°C，培養時間為24-7?時；進行細胞換液，棄掉培養瓶內的培養液，用PBS洗滌2次細胞培養瓶細胞貼壁面，洗滌後加入新配置的原代細胞培養所用的完全培養基；每隔三天更換一次原代細胞培養所用的完全培養基，當細胞長至80%以上時，對細胞進行收集傳代。 (6)原代細胞收集傳代:a、棄掉培養瓶內的培養基，用PBS洗滌培養瓶細胞貼壁面2次，棄掉PBS ;b、在培養瓶內加入0.25%胰酶，在室溫消化小於等於3分鐘；c、當細胞從細胞培養瓶貼壁面開始部分脫落時，加入第一代及第一代以後細胞培養所用的完全培養基加入培養瓶內，終止消化；d、取100 μ I細胞懸液用於細胞計數，通過離心提取細胞，細胞接種密度為6000-10000個/cm2進行培養。 (7)第一代及第一代以後的細胞培養及傳代:a、將盛有細胞的細胞培養瓶置於飽和溼度的細胞培養箱內進行培養，細胞培養箱內0)2為5%，溫度為37°C ;b、當細胞長至80%以上時；c、棄掉培養瓶內的培養基，用PBS洗滌培養瓶細胞貼壁面2次，棄掉PBS ;d、在培養瓶內加入0.25%胰酶，在室溫消化小於等於3分鐘；e、當細胞從細胞培養瓶貼壁面開始部分脫落時，細胞培養瓶內加入第一代及第一代以後細胞培養所用的完全培養基，終止消化；f、取100 μ I細胞懸液用於細胞計數，通過離心提取細胞，細胞接種密度為6000-10000個/cm2進行培養。
2.根據權利要求1所述的骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法，其特徵在於所述的原代細胞培養所用的完全培養基的配製:終濃度組成如下，PL血小板裂解液5-20 %，肝素2-5U/ml，強力黴素5_10 μ g/ml，基礎培養基為DMEM培養液。
3.根據權利要求1所述的骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法，其特徵在於所述的第一代及第一代以後細胞培養所用的完全培養基的配製:終濃度組成如下，PL血小板裂解液5-20 %，肝素2-5U/ml，強力黴素5_10 μ g/ml，基礎培養基為AMEM培養液。
4.根據權利要求1所述的骨髓間充質幹細胞在體外擴增純化培養的方法，其特徵在於 所述的0.25%胰酶含有0.02% EDTA。
【文檔編號】C12N5/0775GK104480068SQ201410759017
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月5日 優先權日:2014年12月5日
【發明者】黃誠, 黃相傑, 姜紅江, 王玉鶴 申請人:黃相傑