一株在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌及其篩選方法和應用的製作方法

2023-05-05 07:22:41

一株在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌及其篩選方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌，其特徵在於，所述聚磷菌的保藏號為CCTCC?NO:M2014140。本發明的菌株是利用低溫富集培養及稀釋混合平板法從巢湖底泥中篩選得到的一種在低溫下能高效除磷的聚磷菌，在8℃下仍能在厭氧時有效吸收廢水中的碳源轉化為聚β-羥基烷酸鹽，同時釋放胞內儲存的多聚磷酸鹽，從中獲得能量；在好氧時氧化胞內的聚β-羥基烷酸鹽產生能量，並大量地從廢水中攝磷，以多聚磷酸鹽的形式加以積累。本發明菌株具有廣泛的溫度適應性，在8-30℃內都有較好的聚磷效果，可用於冬季或低溫條件下的廢水處理。
【專利說明】一株在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌及其篩選方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株在低溫下仍具有較高除磷效果的聚磷菌及其篩選方法和應用，屬於環境微生物領域。
【背景技術】
[0002]水汙染問題是世界各國普遍面臨的重要問題，而這一問題在我國這樣一個發展中國家猶為嚴重。近幾十年來，我國人口急劇增長，城市化步伐加快，城市汙水排放量日益增多，水體汙染現狀十分嚴重，且有明顯惡化的趨勢。隨著水汙染的日益加劇，水體的富營養化問題越來越突出。近十年以來，我國富營養化水體的比例從50%增長到55%，同時貧營養化水體比例從3.2%降到0.53%。水體富營養化會引起藻類的大量繁殖，導致赤潮或水華現象的發生，降低水體的透明度，影響水質；藻類大量繁殖還會消耗水體中的溶解氧，影響其他水生生物的生存，破壞水生生態平衡；同時部分藻類會向水體中釋放有毒物質，危害其他生物及人體健康。自然水體富營養化的主要原因是含有大量的營養物質，特別是氮磷等元素的廢水被注入江河湖泊中。在眾多元素中，磷含量的超標被認為是導致水體富營養化的關鍵因素之一。因此，如何高效、經濟的除磷已經成為目前水汙染防治領域的重要研究方向。
[0003]生物除磷技術是 目前國際上廣泛應用的除磷方法，其優點是可以避免化學除磷方法中產生的大量化學汙泥，減少汙泥膨脹現象，節約能源、運行費用較低，且有利於磷的回收。生物除磷主要是由一類被稱為聚磷菌(Poly-phosphate Accumulating Organisms,PAOs)的微生物來完成的，這類微生物均屬於異養型細菌。其核心是利用聚磷菌在厭氧條件下釋放磷和在好氧條件下對磷的過量吸收的特點，並且好氧條件下吸收的磷比厭氧條件下釋放的磷多，從而使得廢水中的磷得以去除。一般細菌體內的含磷量只有細胞乾重的2%左右，而聚磷菌在好氧條件下可以超量地將廢水中的磷吸入體內，使磷含量超過10%，甚至可達到30%。近年來，人們對微生物除磷技術進行了深入的研究，並設計了多種除磷工藝。
[0004]然而在冬季或寒冷地區等低溫條件下，生物除磷的效果顯著下降。這主要是因為在生物除磷中起主要作用的中溫聚磷菌(phosphorus accumulation organism, PAOs)在低溫條件下的生長代謝處於抑制狀態，而低溫PAOs在正常溫度下比中溫PAOs少，代謝速率慢，很難在自然狀態下形成優勢菌群。因此，要實現低溫條件下有效除磷，不能僅僅從研發工藝以及運行調整等方面研究，還必須從微生物學的角度研究探討低溫生物除磷的可行性。
[0005]近年來，人們對低溫聚磷菌進行了一定研究，主要是通過溫度梯度馴化，從中溫聚磷菌中篩選在低溫仍具有聚磷效能的菌株。然而此類細菌及其除磷特性的研究都處於初級階段，沒有快捷的培養馴化方式，也沒有系統的鑑定方法。探明低溫聚磷菌的種屬及特性，明確它們的除磷條件，將有助於廢水除磷工藝的研究、開發和應用。
【發明內容】

[0006]針對以上問題，本發明的目的是提供一株在低溫下仍具有較高除磷效果的聚磷菌。該細菌具有廣泛的溫度適應性，同時能有效地利用各種碳源。本發明的另一個目的是提供該菌的篩選方法和應用。
[0007]本發明的菌株是利用低溫富集培養及稀釋混合平板法從巢湖底泥中篩選得到的一種在低溫下能高效除磷的聚磷菌，在8°C下仍能在厭氧時有效吸收廢水中的碳源轉化為聚β -羥基烷酸鹽，同時釋放胞內儲存的多聚磷酸鹽，從中獲得能量；在好氧時氧化胞內的聚β_羥基烷酸鹽產生能量，並大量地從廢水中攝磷，以多聚磷酸鹽的形式加以積累。
[0008]本發明採用如下技術方案:
[0009]本發明目的之一在於提供一株在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌，所述聚磷菌的保藏號為 CCTCC Ν0:Μ2014140ο
[0010]本發明另一目的在於提供一種篩選在低溫下具有較高除磷效果聚磷菌的方法，其特點在於，所述方法包括如下步驟:
[0011](I)分別配製培養基Α、Β和C:
[0012]培養基A為菌株分離、純化、保藏培養基，其組成為:每升培養基A包含蛋白腖IOg,牛肉膏5g，氯化鈉5g，瓊脂19g，其餘為水，調節pH至7.0-7.2，
[0013]培養基B為預培 養基，其組成為:每升培養基B包含乙酸鈉2g，Na2HP0446mg,NH4Cl 152.8mg, CaCl28.3mg, MgS0482mg, K2SO417.83mg, HEPES7g，微量元素 2mL，其餘為水，調節 pH 至 7.0-7.2 ；
[0014]培養基C為富磷培養基，其組成為:每升培養基C包含乙酸鈉lg，MgS0482mg,FeS043.7mg，CaCl260mg，(NH4)2SO40.2g，牛肉膏 0.22g，K2HP0474mg，微量元素 2mL，其餘為水，調節 pH 至 7.0-7.2 ；
[0015]所述微量元素的組成為:每升微量元素包含FeCl30.9g, H3BO3150mg, CuS0430mg,KI180mg, MnCl260mg, ZnS04120mg, CoCl2140mg, Na2Mo0460mg,乙二胺四乙酸 IOg,其餘為水；
[0016](2)富集培養
[0017]取活性汙泥0.5g加到IOOmL無菌水中於6°C— 10°C振蕩培養24h，取IOmL振蕩培養後的混合液轉接到IOOmL磷濃度為5mg/L的培養基A中，5-9°C富集培養，每培養2d轉接一次，每轉接一次培養基A中的磷濃度提高5mg/L，共轉接4次，富集培養8d，得到富集培養液；
[0018](3)分離純化
[0019]將所述富集培養液至稀釋度達到10_6，吸取0.5ml稀釋液於分離純化平板中，在40 0C- 42°C下與培養基A混合，凝固後倒置，於8°C恆溫培養出菌落；挑取所述平板上的單菌落在平板上進行多次劃線純化，至顯微觀察顯示無雜菌，即得到純化菌株；
[0020](3)篩選
[0021]將所述純化菌株接種於裝有IOOmL培養基B的錐形瓶中，在130r/min，8°C下振蕩培養24h，得預培養液，將所述預培養液按10%轉接到裝有IOOmL培養基C的錐形瓶中，在130r/min，8°C下振蕩培養2d ;其中先厭氧培養24h再好氧培養24h ;培養完成後取培養液10000r/min離心10min取上清液，測定上清液的總磷濃度，考察菌株對總磷的去除率，從而篩選出的在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌。[0022]本發明篩選方法可以篩選出本發明保藏的菌株，但不限於僅用於篩選本發明菌株，還可用於其它在低溫下具有較高除磷效果聚磷菌的篩選。
[0023]本發明的另一目的在於聚磷菌在廢水處理中的應用。
[0024]本發明聚磷菌16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0025]本發明的菌株具有以下優點:
[0026](I)本發明菌株具有廣泛的溫度適應性，在8_30°C內都有較好的聚磷效果，可用於冬季或低溫條件下的廢水處理。
[0027](2)本發明菌株具有非常高的除磷活性，該菌株在培養48h後，除磷率達到94.5，可用於天然水體生態改造或原位修復。[0028]本發明菌株是2012年10月由發明人從巢湖底泥中篩選獲得，經鑑定，屬於假單胞菌屬，是一株螢光假單胞菌，命名為假單胞菌D6Pseud0m0nas SP.D6,已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址:中國武漢武漢大學；保藏日期為2014年4月20日；保藏編號為CCTCC N0:M2014140o
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是本發明菌株在不同溫度下培養48h後，培養基的OD值及除磷率。
[0030]圖2是本發明菌株在不同碳源培養基中培養48h後，培養基的OD值及除磷率。
[0031]圖3是本發明菌株在不同pH值培養基中培養48h後，培養基的OD值及除磷率。
[0032]圖4是本發明菌株在培養過程中培養基的OD值及除磷率實時檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0033]下面通過附圖和具體實施例對本發明作進一步說明。
[0034]實施例1本發明菌株的分離篩選及鑑定:
[0035](I)培養基
[0036]培養基A:每升培養基含蛋白腖10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，瓊脂19g ;餘量為水；ρΗ7.0-7.2。
[0037]培養基A用於菌株分離、純化、保藏.[0038]培養基B:每升培養基含乙酸鈉(碳源)2g，Na2HP0446mg, NH4Cl 152.8mg，CaCl28.3mg, MgS0482mg, K2SO417.83mg, HEPES7g，微量元素 2mL ;餘量為水，pH7.0-7.2。
[0039]培養基B用於菌株的預培養基。
[0040]培養基C:每升培養基含乙酸鈉(碳源)lg, MgS0482mg, FeS043.7mg, CaCl260mg,(NH4)2SO40.2g，牛肉膏 0.22g，K2HP0474mg，微量元素 2mL ;餘量為水；pH7.0-7.2。
[0041]培養基C用於菌株的富磷培養。
[0042]D、微量元素組成(g/L):每升培養基含 FeCl30.9g，H3BO3150mg, CuS0430mg,KI180mg, MnCl260mg, ZnS04120mg, CoCl2140mg, Na2Mo0460mg,乙二胺四乙酸 10g。
[0043]上述培養基使用前，121 °C，滅菌20分鐘。
[0044](2)螢光假單胞菌D6菌株的分離、純化及篩選:
[0045]在低溫條件下進行富集培養。取巢湖底泥0.5g加到IOOmL無菌水中，8°C下振蕩培養24h，取IOmL混合液轉接到IOOmL加入磷至磷濃度達到5mg/L牛肉膏蛋白腖培養基中低溫富集培養。每培養2d轉接一次，每轉接一次牛肉膏蛋白腖培養基中的磷濃度提高5mg/L,共轉接4次，富集培養8d，富集得到聚磷能力較強的菌株。
[0046]採用混合稀釋平板法和平板劃線法進行分離純化。用移液槍吸取0.5ml富集培養液於裝有4.5ml無菌水的試管中，混勻，依此類推。最終使富集培養液的稀釋度達到10_6。吸取稀釋後的稀釋液，以每塊平板0.5ml的量，與40°C左右分離培養基混合，放置於超淨工作檯使其凝固。之後將平板倒置，放入8°C恆溫培養箱培養。
[0047]挑取單菌落，並對挑取的單菌株在平板上進行多次劃線純化，至顯微觀察顯示無雜菌為止，此時可認為菌株純化完畢。
[0048]將所得的純化菌株接種於裝有IOOmL預培養基的錐形瓶中，在130r/min，8°C下振蕩培養24h。將預培養液按10%轉接到裝有IOOmL富磷培養基的錐形瓶中，在130r/min，8°C下振蕩培養2d。培養過程中，前24h厭氧培養，厭氧條件通過橡膠塞封口，用滅過菌的針筒抽取瓶中空氣再注入高純氮氣達到。培養的後24h好氧培養，是在超淨工作檯中將橡膠塞換為透氣膜，使氧氣進入。培養完成後取培養液10000r/min離心10min取上清液，測定總磷濃度，考察菌株對總磷的去除率，篩選出的高效的聚磷菌即本發明中的螢光假單胞菌D6，接種至斜面培養基保存。
[0049](3)螢光假單胞菌D6的菌落形態特徵:
[0050]在培養基A上培 養2天後菌落乳白色、呈規則圓形、中間凸起、邊緣不透明、有光澤。
[0051](4) 16SrDNA 的分子鑑定
[0052]實驗方法:從菌株D6的斜面上挑取菌體，加至含100 μ L雙蒸水的離心管中，旋渦混勻，熱裂解菌懸液，以基因組DNA為模板擴增16SrDNA。
[0053]正向引物為7F: 5 』 -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3 』 ；
[0054]反向引物為1540R:5』 -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3』。
[0055]擴增反應體系為:DNA模板0.5 μ L, 5 X Buffer緩衝液2.5 μ L, dNTPl μ L,正反引物各 0.5 μ L,酶 0.2 μ L，雙蒸水 19.8 μ L。
[0056]反應條件為:98°C 預變性 3min, 98 °C 25sec, 55 °C 25sec, 72 °C lmin, 30 個循環，72°C延長IOmin後4°C保存。
[0057]用1%瓊脂糖凝膠對菌株的16SrDNA擴增產物做電泳檢測，驗證後切下膠條，採用DNA凝膠回收試劑盒純化PCR產物。PCR擴增產物委託上海生工生物工程有限公司進行測序。
[0058](5) 16SrDNA序列分析與系統發育分析:
[0059]測序後得到D6菌株的16SrDNA長度為1451bp的序列，提交到NCBI Genbank資料庫進行Blast比對,發現菌株D6與Pseudomonas f Iuorescens的進化距離最為接近，確定其為假單胞菌屬，初步認定其為突光假單胞菌，命名為Pseudomonas fluorescens D6。
[0060]D6 菌株 16SrDNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。
[0061]實施例2本發明菌株的最佳除磷條件
[0062]1、用本發明保藏的菌株培養獲得的種子液按體積比1:10接種於培養基C中，分別在8 °C、I (TC、15 °C、20°C、25 °C、30°C下振蕩培養48h，其中先厭氧培養24h，再好氧培養24h，48h後檢測培養基C的OD值及除磷率，檢測結果如圖1所示。由圖1結果可知，本發明菌株具有廣泛的溫度適應性，在8-30°C內都有較好的聚磷效果，可用於冬季或低溫條件下的廢水處理。
[0063]2、用本發明保藏的菌株培養獲得的種子液按體積比1:10接種於不同碳源的富磷培養基中，在20°C振蕩培養48h，其中先厭氧培養24h，再好氧培養24h，48h後檢測培養基C的OD值及除磷率，檢測結果如圖2所示。上述不同碳源的富磷培養基是指培養基C，以等含碳量葡萄糖替代培養基C中乙酸鈉所得到的培養基Cl，以等含碳量果糖替代培養基C中乙酸鈉所得到的培養基C2，以等含碳量蔗糖替代培養基C中乙酸鈉所得到的培養基C3，以等含碳量乳糖替代培養基C中乙酸鈉所得到的培養基C4 ；以等含碳量澱粉替代培養基C中乙酸鈉所得到的培養基C5。由圖2結果可知，本發明菌株能很好的利用各種碳源，最適碳源為乙酸鈉。
[0064]3、用本發明保藏的菌株培養獲得的種子液按體積比1:10接種於不同pH值的培養基中，在20°C下振蕩培養48h，其中先厭氧培養24h，再好氧培養24h，48h後檢測培養基C的OD值及除磷率，檢測結果如圖3所示。上述不同不同pH值的培養基分別指:培養基C ;培養基C6:成分與培養基C相同，pH5.0 ;培養基C7:成分與培養基C相同，pH6.0 ;培養基C8:成分與培養基C相同，pH8.0 ;培養基C9:成分與培養基C相同，pH9.0 ;培養基ClO:成分與培養基C相同，ρΗΙΟ.Ο ;培養基Cll:成分與培養基C相同，pHll.0 ;由圖3結果可知，本發明菌株在pH7-9的範圍內，具有很強的除磷活性。[0065]4、用本發明保藏的菌株培養獲得的種子液按體積比1:10接種於培養基C中，20°C下振蕩培養48h，其中先厭氧培養36h，再好氧培養12h，整個培養過程中的實時OD值及除磷率如圖4所示，48h後除磷率達到94.5%。
[0066]
【權利要求】
1.一株在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌，其特徵在於，所述聚磷菌的保藏號為CCTCC N0:M2014140o
2.一種篩選在低溫下具有較高除磷效果聚磷菌的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟: (1)分別配製培養基A、B和C: 培養基A為菌株分離、純化、保藏培養基，其組成為:每升培養基A包含蛋白腖10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，瓊脂19g，其餘為水，調節pH至7.0-7.2， 培養基B為預培養基 ，其組成為:每升培養基B包含乙酸鈉2g，Na2HP0446mg,NH4Cl 152.8mg, CaCl28.3mg, MgS0482mg, K2SO417.83mg, HEPES7g，微量元素 2mL，其餘為水，調節 pH 至 7.0-7.2 ； 培養基C為富磷培養基，其組成為:每升培養基C包含乙酸鈉lg，MgS0482mg,FeS043.7mg，CaCl260mg，(NH4)2SO40.2g，牛肉膏 0.22g，K2HP0474mg，微量元素 2mL，其餘為水，調節 pH 至 7.0-7.2 ； 所述微量元素的組成為:每升微量元素包含FeCl30.9g, H3BO3150mg, CuS0430mg,KI180mg, MnCl260mg, ZnS04120mg, CoCl2140mg, Na2Mo0460mg,乙二胺四乙酸 IOg,其餘為水； (2)富集培養 取活性汙泥0.5g加到IOOmL無菌水中於6°C — 10°C振蕩培養24h，取IOmL振蕩培養後的混合液轉接到IOOmL磷濃度為5mg/L的培養基A中，5-9°C富集培養，每培養2d轉接一次，每轉接一次培養基A中的磷濃度提高5mg/L，共轉接4次，富集培養8d，得到富集培養液； (3)分離純化 將所述富集培養液至稀釋度達到10_6，吸取0.5ml稀釋液於分離純化平板中，在40°C —42°C下與培養基A混合，凝固後倒置，於8°C恆溫培養出菌落；挑取所述平板上的單菌落在平板上進行多次劃線純化，至顯微觀察顯示無雜菌，即得到純化菌株； (3)篩選 將所述純化菌株接種於裝有IOOmL培養基B的錐形瓶中，在130r/min，8°C下振蕩培養24h，得預培養液，將所述預培養液按10%轉接到裝有IOOmL培養基C的錐形瓶中，在130r/min，8°C下振蕩培養2d ;其中先厭氧培養24h再好氧培養24h ;培養完成後取培養液10000r/min離心10min取上清液，測定上清液的總磷濃度，考察菌株對總磷的去除率，從而篩選出的在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌。
3.權利要求1所述聚磷菌在廢水處理中的應用。
4.根據權利要求1所述的一株在低溫下具有較高除磷效果的聚磷菌，其特徵在於，所述聚磷菌16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
【文檔編號】C12N1/20GK103952365SQ201410214084
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月19日 優先權日:2014年5月19日
【發明者】王寧, 邵嘯, 吳涓, 李玉成, 畢瀟 申請人:安徽大學