一種高活性的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白及其活性檢測方法

2023-05-05 15:17:01

專利名稱：一種高活性的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白及其活性檢測方法
技術領域：
一種高活性的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白及其活性檢測方法屬於蛋白質藥物領域
背景技術：
骨質疏鬆症是一種常見的骨代謝疾病，表現為骨吸收超過了骨形成，從而導致骨量減少，骨脆性增加。骨質疏鬆症在絕經婦女中佔有較大比例，而隨著世界人口老齡化的日益嚴峻，尋找新的更有效的骨質疏鬆症的預防和治療藥物顯得尤其重要。目前，骨質疏鬆症的臨床治療用藥主有兩類，分別為骨吸收抑制劑和骨形成促進劑。 人甲狀旁腺激素(PTH)目前被認為是唯一能促骨合成代謝的藥物，其優於其它骨質疏鬆藥物的特點在於可以重建骨小梁系統。研究表明小劑量PTH即有明顯成骨作用，其作用可能是通過調節骨代謝和調節腎小管對鈣和磷酸鹽的再吸收來實現的。2002年FDA批准特立帕肽(rhPTH(l_34))上市，主要用於治療絕經後婦女的骨質疏鬆症。另一個甲狀旁腺激素藥物rhPTH(l-84)也於2006年上市。國內對PTH研究起步較晚，現進入到臨床研究階段的PTH藥物有注射用重組人甲狀旁腺激素(1-34)，而研究熱點集中在PTH融合蛋白以及PTH的各種突變體上。對蛋白質或多肽進行單個或多個胺基酸的置換，可能會使得蛋白質的結構發生變化，並產生一系列物理和生化性質(溶解度、穩定性、對底物和受體的親和力等)的改變。因此對天然人甲狀旁腺激素(1-34)進行胺基酸的置換，有希望得到生理活性更強，副作用更小的骨質疏鬆治療藥物。本發明建立起的活性測定方法可以快速穩定地檢測人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白的體外活性，涉及到的技術包括螢光實時定量PCR，成骨細胞和破骨細胞共培養等。

發明內容
本發明的一個內容是通過不同物種同源序列比對和初步的計算機模擬分子對接，對天然的人甲狀旁腺激素(1-34)的三個胺基酸R25K26K27進行Q25E26L27的置換，並委託吉爾生化(上海)有限公司進行多肽的全合成，多肽純度為95%以上。本發明的另一個內容是建立了一種能快速穩定的檢測突變蛋白活性的方法。甲狀旁腺激素(PTH)是由甲狀旁腺主細胞分泌的含84個胺基酸殘基的單鏈多肽激素，是生物體內調節鈣、磷代謝最為重要的肽類激素之一。甲狀旁腺激素氨基端1-34片段具有全分子PTH與受體結合的能力及生物活性，因此被廣泛用於研究PTH的結構與功能。對PTH及其類似物的作用機理及活性研究始於上世紀80年代。目前已知PTH可以通過與基質/成骨細胞上的G蛋白偶聯受體-甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關蛋白受體I (PTHRl)結合，刺激這些細胞表達M-CSF和NF k B-Iigand(RANKL)。研究表明上述基因缺失的小鼠會喪失形成破骨細胞的能力，而體外培養時，即使沒有基質/成骨細胞存在，上述兩種蛋白也能刺激破骨細胞的形成。體內和體外實驗證明，破骨細胞的形成與RANKL基因的表達成正比，而與M-CSF沒有明顯的正比關係。RANKL可通過與造血前體破骨細胞上的RANK受體結合，刺激其分化成為成熟的破骨細胞。當RANKL發揮作用時，一種可溶性的誘鉺受體-骨保護素(OPG)會阻礙其發揮作用。許多研究表明PTH作用於原代培養的基質/成骨細胞或大鼠時，它能持續的刺激RANKL基因的表達而抑制OPG基因的表達。因此，PTH發揮作用時很有可能是通過凋節RANKL/0PG的比例來影響破骨細胞的形成。磷酸酶是一種可以水解脂肪族和芳香族磷酸酯，從而釋放出磷酸鹽的酶。磷酸酶根據其發揮作用時所需pH又可以分為酸性磷酸酶和鹼性磷酸酶。酸性磷酸酶存在於各種細胞和組織中，如前列腺、肝、腎、脾、紅細胞、血小板和破骨細胞。1959年，Burstone報導，破骨細胞能顯示出強烈的酸性磷酸酶活性，而成骨細胞則顯示出鹼性磷酸酶活性。之後的很多報告顯示破骨細胞在酒石酸存在的情況下仍能表現出酸性磷酸酶的活性。因此抗酒石酸酸性磷酸酶(TARCP)現在作為一個破骨細胞的標誌物被廣泛運用於破骨細胞的鑑定和分析。PTH可以通過與基質/成骨細胞上的G蛋白偶聯受體-甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關蛋白受體I (PTHRl)結合，刺激這些細胞表達NF K B-Iigand (RANKL)，RANKL可通過與造血前體破骨細胞上的RANK受體結合，刺激其分化成為成熟的破骨細胞。而破骨細胞能表 現出抗酒石酸酸性磷酸酶(TARCP)活性而被染色，因此通過染色結果能間接說明PTH刺激破骨細胞的分化和成熟的能力。本發明建立的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白的體外活性檢測方法，可以在3-10天內對一種或多種蛋白質或多肽類藥物進行活性檢測，並與人甲狀旁腺激素標準品進行比較，是一種快速穩定的檢測活性檢測方法。


圖I :螢光定量PCR儀檢測實時螢光情況圖2 PTH (1-34)-(RKK-QEL)對 UAMS-32P 細胞 RANKL/0PG 基因轉錄的影響X 軸代表組別 vehicle 組、PTH (1-34)陽性對照組、PTH (1-34)-(RKK-QEL)組、小肽(LQDVHNF)組人血清白蛋白(HSA)組。Y軸表示mRNA相對表達量(相對於Rps27基因)圖3 :破骨細胞形成實驗(TRACP染色)I vehicle組(每組3個復孔)、2 :PTH(1_34)陽性對照組、3 :PTH(1-34)-(RKK-QEL)組、4 :小肽(LQDVHNF)組、5 :HSA 組圖4 :破骨細胞形成實驗(鏡下紅色細胞數)X 軸代表組別vehicle 組、PTH(1_34)陽性對照組、HSA 組、PTH(1-34)-(RKK-QEL)組、小肽(LQDVHNF)組。Y軸表示每組平均每孔紅色細胞數(每組3個復孔)圖5 =PTH (1-34)-(RKK-QEL)對原代培養的小鼠股骨骨髓貼壁細胞RANKL/0PG基因轉錄的影響X 軸代表組別vehicle 組、PTH(1_34)陽性對照組、HSA 組、PTH(1-34)-(RKK-QEL)組、小肽(LQDVHNF)組。Y軸表示mRNA相對表達量(相對於Rps27基因)，每組設3個復孔
具體實施例方式實施例I :PTH(1-34)-(RKK-QEL)和小肽(胺基酸序列LQDVHNF)委託吉爾生化(上海)有限公司合成，純度>95% ;實驗用標準對照人甲狀旁腺激素(1-34)購自sigma公司；人血清白蛋白(HSA)由實驗室自行製備並純化，宿主菌為畢赤酵母GS115，純度> 90%。實施例2 =PTH (1-34)-(RKK-QEL)對 UAMS-32P 細胞 RANKL/0PG 基因轉錄的影響(I)細胞系與培養條件
細胞系UAMS_32P細胞(穩定轉染PTHR1)培養基a -MEM培養基+10%胎牛血清培養條件組織培養箱37 °C，5 % CO2細胞長至80%左右匯合時分瓶傳代，再長至80%左右匯合時進行實驗。(2)UAMS_32P細胞的鋪板培養與加藥6孔板按IO5/孔細胞鋪板，生長至80%左右匯合時換液，換液後6h加藥藥物劑量給藥組均按l(T7mol/L加藥組別vehicle組PTH(1-34)陽性對照組PTH (1-34)-(RKK-QEL)組小肽(LQDVHNF)組HSA 組(3) UAMS-32P 細胞總 mRNA 的提取細胞加藥培養24h後，棄去培養基，按試劑盒說明提取總RNA (Takara)。取部分RNA樣品用紫外分光光度計於260和280nm處測定OD值，評價RNA純度並進行定量。(4)反轉錄成cDNA第一鏈控制每組等量RNA (1-1. 5 ii g)，反轉錄為cDNA第一鏈。反轉錄採用20 ii L體系，體
系如下
5 X PT-Master Mix 4u L RNA1.5 u g
DEPC水補至20 u L
37°C 反應 30-60min以上述反轉錄的cDNA作為模板，將模板進行適當稀釋，用於實時螢光定量RT-PCR。(5)實時螢光定量PCR檢測RANKL和OPG的mRNA轉錄水平實驗設vehicle 組，PTH(1-34)陽性對照組，HSA 組，PTH(1-34) (RKK-QEL)組和小肽(LQDVNFH)組。每組分別檢測Rps27，RANKL, OPG基因的轉錄情況，每組每個基因設3個平行復孔。3 步法 PCR :50°C，2min ；95°C, IOmin ;95°C，15s，60°C，Imin ;40 個循環。螢光定量
PCR儀檢測實時螢光情況。
實施例3 PTH(1-34)-(RKK-QEL)在體外成骨細胞和破骨細胞共培養體系中的活性檢測/破骨細胞形成實驗(TRACP染色法)Dayl (I)小鼠股骨骨髓細胞的獲得和培養在無菌條件下，取出3-6周小鼠股骨，並衝洗骨髓腔，離心收集洗下的骨髓細胞。培養基重懸骨髓細胞，用直徑為IOcm的培養皿在在37°C，5% CO2條件下培養2d。(2)UAMS-32P細胞(穩定轉染PTHR1)長至80%左右匯合時，對細胞進行消化。細胞按2000/孔鋪24孔板，37°C，5% CO2條件下培養2d。
Day3 小鼠股骨骨髓懸浮細胞與UAMS-32P細胞共培養體系的建立(I)收集培養皿中的骨髓細胞培養液上清，合併上清液並離心收集細胞。用一定體積的培養基對細胞進行重懸，血球計數板進行細胞計數。(2)吸去Dayl鋪板的UAMS-32P細胞的培養液上清，將上述小鼠股骨骨髓懸浮細胞按16X IO4/孔鋪板，用培養基補至培養體積為lmL。加藥後37°C，5% CO2條件下培養。實驗設vehicle 組，PTH(1-34)陽性組，HSA 組，PTH(1-34) (RKK-QEL)組和小肽(LQDVNFH)組。每組設3個平行復孔。給藥濃度為10-7mol/L。Day5 對24孔板中的細胞進行半換液，吸去0. 5mL培養基，用新鮮培養基補足ImL並補足藥物以維持藥物濃度為10_7mol/L。Day7 重複第五天的操作，對細胞進行半換液。Day9 吸去24孔板的細胞培養液，並用PBS輕柔的洗一次。對貼壁細胞進行TRACP (耐酒石酸酸性磷酸酶)染色(TRACP/ALP染色試劑盒購自Takara),具體步驟如下24孔板每孔添加250 ii L Fixation solution固定細胞，室溫放置5min。每孔加2mL無菌水稀釋固定液後移去，再每孔添加2mL無菌水清洗一次，移去液體。配製好含10%酒石酸的ACP (酸性磷酸酶)底物溶液，24孔板每孔添加250 ii L，蓋上板蓋於37°C孵育15-45min。移去上清液，用無菌水洗3次以終止顯色。顯微鏡下計算每孔中被染成紫紅色的細胞數(見附圖4)，並拍照(見附圖3)。
實施例4 =PTH (1-34) - (RKK-QEL)對原代培養的小鼠股骨骨髓貼壁細胞RANKL/0PG基因轉錄的影響將實施例3中Day3中培養皿內的貼壁細胞消化，用培養基適當稀釋後進行計數。按實施例2中⑵、(3)、(4)、(5)步中的操作，檢測PTH(1-34)-(RKK-QEL)對原代培養的小鼠股骨骨髓貼壁細胞RANKL/0PG基因轉錄的影響。
權利要求
1.天然人甲狀旁腺激素(1-34)的胺基酸序列為SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF。
2.權利要求人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白為對天然人甲狀旁腺激素(1-34)的R25K26K27進行了突變的蛋白。
3.根據權利要求2中所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白為天然人甲狀旁腺激素(1-34)的R25突變為Q，K26突變為Q或E，K27突變為E或L的蛋白，其中較為優選的是R25突變為Q，K26突變為E，K27突變為L。
4.根據權利要求3中所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白為人工化學合成的或者重組表達的蛋白。
5.根據權利要求4所述的重組表達為以大腸桿菌為代表的原核表達系統或以酵母為代表的真核表達系統以及哺乳動物細胞表達系統。
6.根據權利要求2所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白的體外活性檢測方法採用的細胞為原代培養的成骨細胞或骨髓細胞、成骨細胞系或成骨細胞株。
7.權利要求6中原代培養的成骨細胞或骨髓細胞來源為小鼠，較為優選的是小鼠股骨骨髓細胞。
8.根據權利要求6中的成骨細胞系或成骨細胞株，其特徵是轉染了PTH I型受體的細胞，較為優選的為UAMS-32P細胞系。
9.權利要求3所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白活性檢測的指標為UAMS-32P細胞特定基因mRNA的相對表達量以及刺激小鼠股骨骨髓細胞分化形成破骨細胞的能力。
10.根據權利要求8中的特定的基因，其特徵是耦聯成骨細胞、基質細胞和破骨細胞分化、活化與生物活性的主要細胞因子。
11.權利要求9中特定的基因,較為優選的是護骨素(osteoprotegerin,OPG)、NF-K B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κ B ligand, RANKL) 2 個基因。
12.權利要求8中mRNA的相對表達量，其檢測方法為反轉錄PCR和實時螢光定量PCR。其中較為優選的是實時螢光定量PCR。
13.權利要求9中刺激小鼠股骨骨髓細胞分化形成破骨細胞的能力是通過對破骨細胞的染色來評價的，較為優選的是耐酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色。
14.權利要求2和3所述的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白在治療骨質疏鬆症藥物中運用。
全文摘要
本發明「一種高活性人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白及其活性檢測方法」屬於蛋白質藥物領域。本發明通過對天然人甲狀旁腺激素(1-34)的第25、26、27位胺基酸進行置換，發現了一種高活性的人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白。本發明還建立了一種快速的穩定的活性檢測方法，可以在3-10天內對一種或多種蛋白質或多肽類藥物進行活性檢測，並與人甲狀旁腺激素標準品進行比較。活性檢測結果顯示上述人甲狀旁腺激素(1-34)突變蛋白的活性優於標準品，因此有望成為療效更強，副作用更小的骨質疏鬆治療藥物。
文檔編號C12Q1/68GK102775492SQ201210001319
公開日2012年11月14日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者付強, 儲敏, 姜曰水, 朱瑞宇, 李英, 邱爽, 金堅, 陳蘊, 雷楗勇, 高明珠 申請人:江南大學