結合藻紅膽素peb的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白及其應用的製作方法

2023-05-05 09:03:31 1

專利名稱：結合藻紅膽素peb的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白及其應用，屬於 生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋 白、其與鏈黴親和素形成的融合蛋白及其突變體，以及利用此融合蛋白檢測可溶性抗原或 抗體的檢測方法。
背景技術：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光複合物的功能組分。 根據其吸收光譜和螢光光譜特徵，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、 藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻 藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC) 。 CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞 基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein) 半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜 性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可 見光，發射約580nm的螢光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的螢光；CPC吸收約 620nm的可見光，發射約640nm的螢光；APC吸收約650 660nm的可見光，發射約660 670nm的螢光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB) ;PEC的 alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB) ;PEC的beta亞基結 合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB) ;CPC和APC結合的輔基色素都為 藻藍膽素PCB。 利用裂合酶催化脫輔基蛋白與藻藍膽素PCB偶聯可製備別藻藍蛋白的各個亞基。 (Kai_hong Zhao，Ping Su. Phycobilin :cystein-84 biliprotein lyase, a near皿iversal lyase forcysteine_84_binding sites in cyanobacterial phycobiliproteins[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104 (36) : 14300 14305)。我們發現，別藻藍蛋白的各個亞基 的保守半胱氨酸殘基不僅可以偶聯藻藍膽素PCB，還可以跟藻紅膽素PEB偶聯，生成一類新 型的別藻藍蛋白亞基。我們利用大腸桿菌為宿主，利用裂合酶催化脫輔基蛋白與藻紅膽素 PEB，得到別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白質。其光譜性質如圖1、圖2、圖3、圖4、圖5所示，同 時還可以對其肽鏈胺基酸進行突變、進行有益的標記。 鏈黴親和素可以跟生物素特異結合，通過鏈黴親和素_生物素系統，可以實現信 號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈黴親和素_生物素系統已經廣泛應用於生物學檢測 和醫療檢測等領域。目前主要是通過化學交聯實現鏈黴親和素對目標的標記。本發明通過 基因工程技術，把鏈黴親和素基因和別藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接後克隆於表達載 體，可以在大腸桿菌內表達得到鏈黴親和素和別藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直 接實現鏈黴親和素和別藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白的連接；通過藻膽蛋白裂合酶能催化藻紅 膽素與別藻藍蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質共價結合，從而生成具有優良螢光性質 的鏈黴親和素標記的結合PEB的別藻藍蛋白類螢光蛋白質(其光譜如圖6、圖7、圖8、圖9、圖10所示)。此類蛋白可直接應用於免疫螢光檢測等領域。 免疫螢光技術(Immunofluorescence technique)又稱螢光抗體技術，是標記免疫 技術中發展最早的一種免疫螢光技術(Immunofluorescence technique)又稱螢光抗體技 術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建 立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗 原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。Coons等於1941年首次採用螢光素進行標 記而獲得成功。 用螢光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱螢光抗體法；用已知的螢光抗原標記物 示蹤或檢查相應抗體的方法稱螢光抗原法。這兩種方法總稱免疫螢光技術，因為螢光色素 不但能與抗體球蛋白結合，用於檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質結合，用於檢測 或定位抗體，但是在實際工作中螢光抗原技術很少應用，所以人們習慣稱為螢光抗體技術， 或稱為免疫螢光技術。以螢光抗體方法較常用。 該技術的主要特點是特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是非特異性染色 問題尚未完全解決，技術程序也還比較複雜。同時，由於一般螢光測定中的本底較高等問 題，螢光免疫技術用於定量測定有一定困難。 藻膽蛋白性質穩定，其螢光性質受到環境影響較小，適合作為螢光探針使用。本發 明中的藻膽蛋白已經直接標記有鏈黴親和素，利用間接檢測法，通過生物素_鏈黴親和素 系統，利用鏈黴親和素標記的螢光藻膽蛋白與生物素標記的抗抗體結合，從而實現對抗原 的檢測。生物素-鏈黴親和素提高了檢測的靈敏度，同時由於抗抗體的通用性，使本檢測方 法可以方便的用於各種抗原的檢測；螢光藻膽蛋白具有優良的螢光性質，較高的螢光效率、 較大波長的螢光發射峰，可以提高檢測靈敏度，減少本底螢光的影響。本方法有利於螢光藻 膽蛋白在免疫檢測中應用的推廣。 藻膽蛋白目前正逐漸在各種領域得到廣泛應用，特別是在免疫螢光檢測方面有很 大的開發利用前景。通過改造後具有較高螢光效率、帶有可利用標記的藻膽蛋白，會大大提 升其在免疫螢光檢測中的應用價值，這為藻膽蛋白在醫藥和生物工程領域的應用奠定了基 礎。

發明內容
本發明的目的在於提供一類結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基及其與鏈黴親 和素形成的融合蛋白的胺基酸序列，並標明其色素結合位點，同時提供利用鏈黴親和素標 記的螢光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測方法。這類鏈黴親和素標記的結合藻 紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基具有良好的螢光性質，提供了此類帶有鏈黴親和素標記的結 合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基用於檢測可溶性抗原的方法它是利用抗體與抗原特異 性反應、鏈黴親和素可以與生物素特異結合的原理，利用鏈黴親和素標記的螢光藻膽蛋白 檢測可溶性抗原或抗體。 為了解決上述問題，本發明所採用的技術方案是 將別藻藍蛋白亞基編碼基因克隆於表達質粒，利用別藻藍蛋白裂合酶表達質粒以 及藻紅膽素PEB合成酶質粒，可以在大腸桿菌中合成結合PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋 白，並且標明了其色素結合位點，該類蛋白質序列N端具有His-tag標記，但是His-tag標記不限於N端。 將別藻藍蛋白亞基編碼基因克隆於表達質粒，利用基因工程方法將其突變，可表 達得到別藻藍蛋白亞基突變體，對除結合色素的130(或129)位外的所有位點進行突變一 般不會對蛋白性質有較大的影響，屬於同類蛋白，對此蛋白進行部分缺失，對蛋白性質無較 大影響，也屬於同類蛋白。 將別藻藍蛋白亞基編碼基因克隆於表達質粒，利用基因工程方法將其突變，可表 達得到別藻藍蛋白亞基的突變體，利用別藻藍蛋白裂合酶表達質粒以及藻紅膽素PEB合成 酶質粒，可以在大腸桿菌中合成結合PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白，並且標明了其色 素結合位點。 所述的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白的蛋白質胺基酸序列為 ApcA為序列1、ApcA2為序列2、 ApcB為序列3、ApcD為序列4、ApcF為序列5 :
序列1 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
序列2 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
GDSTPIQEIGVIGVREMYRSLGTPIEAVAESIRAMKYVATS匪SVEDRAEVDTYFDYLIGAMQ
序列3 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
TAALEKLKAYFSTGELRVRAATTISANAAAIVKEAVAKSLLYSDITRPGGNMYTTRRYAACIRDLDYYLRYATYAML 序列4 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)

序列5 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點) 所述的結合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結合在ApcA的129位，相
當於原始別藻藍蛋白A亞基的81位，ApcA2的129位，相當於原始別藻藍蛋白A2亞基的81
位，ApcB的130位，相當於原始別藻藍蛋白B亞基的82位，ApcD的129位，相當於原始別藻
藍蛋白D亞基的81位，ApcF的130位，相當於原始別藻藍蛋白F亞基的82位。 將鏈黴親和素編碼基因和別藻藍蛋白亞基編碼基因拼接後克隆於表達質粒，利用
別藻藍蛋白裂合酶表達質粒以及藻紅膽素PEB合成酶質粒，可以在大腸桿菌中合成結合
PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白，並且標明了其色素結合位點。 將鏈黴親和素編碼基因和別藻藍蛋白亞基編碼基因拼接後克隆於表達質粒，利用
5基因工程方法將其突變，可表達得到鏈黴親和素和別藻藍蛋白亞基的融合蛋白的突變體， 利用別藻藍蛋白裂合酶表達質粒以及藻紅膽素PEB合成酶質粒，可以在大腸桿菌中合成鏈 黴親和素標記的結合PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白突變體，並且標明了其色素結合位 點。 所述的鏈黴親和素標記的別藻藍蛋白的胺基酸序列為 鏈黴親和素標記的ApcA為序列6、鏈黴親和素標記的ApcA2為序列7、鏈黴親和素 標記的ApcB為序列8、鏈黴親和素標記的ApcD為序列9、鏈黴親和素標記的ApcF為序列 10 : 序列6 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
AVGEGVRALKNAASTLLSAEDAAEAGSYFDYVVGALQ 序列7 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
AVAESIRAMKYVATS匪SVEDRAEVDTYFDYLIGAMQ 序列8 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
NAAAIVKEAVAKSLLYSDITRPGGNMYTTRRYAACIRDLDYYLRYATYAMLAGDPSILDERVLNGLKETYNSLGVPV GATVQAIQAIKEVTASLVGADAGKEMGIYLDYISSGLS 序列9 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
GMVEAINSLKKASLDLLSSEDAAAAAPYFDYIIQAMS 序列10 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
GPTVRGVQILKDLVKEQVAGAGIANTTFVEEPFDHITRELSERDV —種鏈黴親和素標記的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白，鏈黴親
6和素在別藻藍蛋白的N端，但是不限於在N端。 鏈黴親和素標記的結合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB藻紅膽素PEB通過硫醚鍵 結合在鏈黴親和素標記的ApcA的257位，相當於原始別藻藍蛋白A亞基的81位，鏈黴親 和素標記的ApcA2的257位，相當於原始別藻藍蛋白A2亞基的81位，鏈黴親和素標記的 ApcB的258位，相當於原始別藻藍蛋白B亞基的82位，鏈黴親和素標記的ApcD的257位， 相當於原始別藻藍蛋白D亞基的81位，鏈黴親和素標記的ApcF的258位，相當於原始別藻 藍蛋白F亞基的82位。 結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白的應用 利用鏈黴親和素標記的螢光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測。 所述的鏈黴親和素標記的螢光藻膽蛋白為鏈黴親和素標記的結合藻紅膽素PEB
的別藻藍蛋白亞基類蛋白。 本發明提供的利用鏈黴親和素標記的螢光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的方 法，其步驟如下 (1)將可與固相結合併能識別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結合抗 體部分，備用； (2)將待測抗原、識別抗原的第二抗體、識別第二抗體的標記生物素的抗抗體、標
記鏈黴素親和素的螢光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應； (3)利用微孔板螢光檢測儀或其它相應的儀器檢測螢光，分析結果。 本發明的有益效果結合PEB的別藻藍蛋白亞基由於具有His-tag標記，便於提
純，且由於此蛋白是單一亞基構成，比具多個亞基的天然別藻藍蛋白更具均一性，用於免疫
檢測中有更好的靈敏度；與鏈黴親和素形成融合蛋白後，實現了鏈黴親和素直接標記，可以
直接用於免疫檢測中，不需要利用化學方法等進行鏈黴親和素標記。


圖1 :81位半胱氨酸殘基結合PEB的別藻藍蛋白A亞基螢光蛋白的吸收和螢光光 譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖2 :81位半胱氨酸殘基結合PEB的別藻藍蛋白A2亞基螢光蛋白的吸收和螢光光 譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖3 :82位半胱氨酸殘基結合PEB的別藻藍蛋白B亞基螢光蛋白的吸收和螢光光 譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖4 :81位半胱氨酸殘基結合PEB的別藻藍蛋白D亞基螢光蛋白的吸收和螢光光 譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖5 :82位半胱氨酸殘基結合PEB的別藻藍蛋白F亞基螢光蛋白的吸收和螢光光 譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖6 :81位半胱氨酸殘基結合PEB的鏈黴親和素標記的別藻藍蛋白A亞基螢光蛋 白的吸收和螢光光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖7 :81位半胱氨酸殘基結合PEB的鏈黴親和素標記的別藻藍蛋白A2亞基螢光蛋 白的吸收和螢光光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖8 :82位半胱氨酸殘基結合PEB的鏈黴親和素標記的別藻藍蛋白B亞基螢光蛋白的吸收和螢光光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖9 :81位半胱氨酸殘基結合PEB的鏈黴親和素標記的別藻藍蛋白D亞基螢光蛋 白的吸收和螢光光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜； 圖10 :82位半胱氨酸殘基結合PEB的鏈黴親和素標記的別藻藍蛋白F亞基螢光蛋
白的吸收和螢光光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為螢光光譜。 蛋白質胺基酸序列附件 序列1 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
序列2 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
GDSTPIQEIGVIGVREMYRSLGTPIEAVAESIRAMKYVATS匪SVEDRAEVDTYFDYLIGAMQ序列3 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)MHHHHHHSSGLVPRGSGM
NAAAIVKEAVAKSLLYSDITRPGGNMYTTRRYAACIRDLDYYLRYATYAMLAGDPSILDERVLNGLKETYNSLGVPV GATVQAIQAIKEVTASLVGADAGKEMGIYLDYISSGLS 序列4 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
序列5 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)MHHHHHHSSGLVPRGSGM
GPTVRGVQILKDLVKEQVAGAGIANTTFVEEPFDHITRELSERDV
序列6 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
AVGEGVRALKNAASTLLSAEDAAEAGSYFDYVVGALQ 序列7 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
AVAESIRAMKYVATS匪SVEDRAEVDTYFDYLIGAMQ 序列8 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
8
NAAAIVKEAVAKSLLYSDITRPGG畫YTTRRYAACIRDLDY YLRYATYAMLAGDPSILDERVLNGLKETYNSLGVP VGATVQAIQAIKEVTASLVGADAGKEMGIYLDYISSGLS 序列9 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
GMVEAINSLKKASLDLLSSEDAAAAAPYFDYIIQAMS 序列10 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結合位點)
GPTVRGVQILKDLVKEQVAGAGIANTTFVEEPFDHITRELSERDV
具體實施例方式
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步詳述，但這些實施例僅用於說明本發
明，並不限制本發明的範圍。
實施例1 蛋白質胺基酸序列如序列l所示，將別藻藍蛋白A亞基編碼基因克隆於表達質粒， 表達得到別藻藍蛋白A亞基，其N端帶有His-tag標記，這不僅有利於對其進行提純，還有 助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第129位(相當於原始別藻藍蛋A亞基第 81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖1所示，吸收峰為551nm，螢光發射峰為568nm。
實施例2 蛋白質胺基酸序列如序列2所示，將別藻藍蛋白A2亞基編碼基因克隆於表達質 粒，表達得到別藻藍蛋白A2亞基，其N端帶有His-tag標記，這不僅有利於對其進行提純， 還有助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第129位(相當於原始別藻藍蛋白A2 亞基第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖2所示，吸收峰為552nm，螢光發射峰為568nm。
實施例3 蛋白質胺基酸序列如序列3所示，將別藻藍蛋白B亞基編碼基因克隆於表達質粒， 表達得到別藻藍蛋白B亞基，其N端帶有His-tag標記，這不僅有利於對其進行提純，還有 助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第130位(相當於原始別藻藍蛋白B亞基 第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖3所示，吸收峰為554nm，螢光發射峰為571nm。
實施例4 蛋白質胺基酸序列如序列4所示，將別藻藍蛋白D亞基編碼基因克隆於表達質粒， 表達得到別藻藍蛋白D亞基，其N端帶有His-tag標記，這不僅有利於對其進行提純，還有
9助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第129位(相當於原始別藻藍蛋白D亞基 第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖4所示，吸收峰為562nm，螢光發射峰為582nm。
實施例5 蛋白質胺基酸序列如序列5所示，將別藻藍蛋白F亞基編碼基因克隆於表達質粒， 表達得到別藻藍蛋白F亞基，其N端帶有His-tag標記，這不僅有利於對其進行提純，還有 助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第130位(相當於原始別藻藍蛋白F亞基 第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖5所示，吸收峰為562nm，螢光發射峰為576nm。
實施例6 蛋白質胺基酸序列如序列6所示，將鏈黴親和素編碼基因和別藻藍蛋白A亞基編 碼基因拼接後克隆於表達質粒，表達得到的鏈黴親和素和別藻藍蛋白A亞基的融合蛋白， 直接實現鏈黴親和素對別藻藍蛋白A亞基的標記；且N端帶有His-tag標記，這不僅有利於 對其進行提純，還有助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第257位(相當於原 始別藻藍蛋白A亞基第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖6所示，吸收峰為551nm，螢光 發射峰為568nm。
實施例7 蛋白質胺基酸序列如序列7所示，將鏈黴親和素編碼基因和別藻藍蛋白A2亞基編 碼基因拼接後克隆於表達質粒，表達得到的鏈黴親和素和別藻藍蛋白A2亞基的融合蛋白， 直接實現鏈黴親和素對別藻藍蛋白A2亞基的標記；且N端帶有His-tag標記，這不僅有利 於對其進行提純，還有助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第257位(相當於 原始別藻藍蛋白A2亞基第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖7所示，吸收峰為552nm， 螢光發射峰為568nm。
實施例8 蛋白質胺基酸序列如序列8所示，將鏈黴親和素編碼基因和別藻藍蛋白B亞基編 碼基因拼接後克隆於表達質粒，表達得到的鏈黴親和素和別藻藍蛋白B亞基的融合蛋白， 直接實現鏈黴親和素對別藻藍蛋白B亞基的標記；且N端帶有His-tag標記，這不僅有利於 對其進行提純，還有助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第258位(相當於原 始別藻藍蛋白B亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖8所示，吸收峰為554nm，螢光 發射峰為571nm。
實施例9 蛋白質胺基酸序列如序列9所示，將鏈黴親和素編碼基因和別藻藍蛋白D亞基編 碼基因拼接後克隆於表達質粒，表達得到的鏈黴親和素和別藻藍蛋白D亞基的融合蛋白， 直接實現鏈黴親和素對別藻藍蛋白D亞基的標記；且N端帶有His-tag標記，這不僅有利於 對其進行提純，還有助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第257位(相當於原 始別藻藍蛋白D亞基第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖7所示，吸收峰為562nm，螢光 發射峰為582nm。
實施例10 蛋白質胺基酸序列如序列IO所示，將鏈黴親和素編碼基因和別藻藍蛋白F亞基編 碼基因拼接後克隆於表達質粒，表達得到的鏈黴親和素和別藻藍蛋白F亞基的融合蛋白， 直接實現鏈黴親和素對別藻藍蛋白F亞基的標記；且N端帶有His-tag標記，這不僅有利於對其進行提純，還有助於提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結合在第258位(相當於原 始別藻藍蛋白F亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖8所示，吸收峰為562nm，螢光 發射峰為576nm。
實施例11 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩衝液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩衝 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩幹液體；每孔加入封閉緩衝液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩衝液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，做九個平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩衝液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩幹液體，備用； (3)每三個平行樣為一組，分以下三種步驟完成 第一種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白 的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2) 準備好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗 滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體， 備用；②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟①準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 衝液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備 用；③取標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻藍蛋白A亞基螢光蛋白，用pH7. 2的0. 05M磷酸 鉀、0. 5M NaCl緩衝液稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟②準備的平行樣及空白對照 孔中，37"C孵育0. 5小時; 第二種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩衝液(含0. 1 %牛血清蛋 白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟 (2)準備好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用 洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液 體，備用；②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻 藍蛋白A亞基螢光蛋白混合加入稀釋緩衝液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩衝液)中，兩個組分的終濃度分別都是10 ii g/mL，取上述溶液150 y L加 入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時； 第三種取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體、生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗 體和標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻藍蛋白A亞基螢光蛋白混合加入稀釋緩衝液(含 0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)中，癌胚抗原CEA的兔多克 隆抗體終濃度為2 ii g/mL，另外兩個組分的終濃度分別都是10 ii g/mL ;取上述溶液150 y L加入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩衝 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體後，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩衝液，置於微孔板螢光檢測儀中檢測螢光值。
實施例12 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩衝液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩衝 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，兩組平行樣分別4t:和37。C包被12 至20小時；倒去包被用的抗體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝 液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體；每孔加入封閉緩衝液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)300 y L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩衝液 (含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，做六個平行樣，另取兩孔直接加入稀釋緩衝液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩幹液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 衝液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備 用；②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻藍蛋白 A亞基螢光蛋白混合加入稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2 的PBS緩衝液)中，兩個組分的終濃度分別都是10 ii g/mL，取上述溶液150 y L加入到步驟 ①準備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩衝 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體後，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩衝液，置於微孔板螢光檢測儀中檢測螢光值。
實施例13 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩衝液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩衝 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩幹液體；每孔加入封閉緩衝液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩衝液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔中， 做二十七個平行樣，另取九孔直接加入稀釋緩衝液作為空白對照，37t:孵育1. 5小時，倒去 液體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，
12甩幹液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備 用； ②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻 藍蛋白A亞基螢光蛋白混合加入稀釋緩衝液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩衝液)中，兩個組分的終濃度分別為5 ii g/mL、5 ii g/mL， 5 y g/mL、 10 y g/ mL， 5 li g/mL、20 u g/mL，10 u g/mL、5 u g/mL，10 u g/mL、10 u g/mL，10 u g/mL、20 u g/mL， 20u g/mL、5u g/mL，20u g/mL、10u g/mL，20u g/mL、20u g/mL，取上述溶液150u L分另U力口 入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，每一種濃度對應一組平行樣，37t:孵育1. 5小 時； (4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩衝 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體後，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩衝液，置於微孔板螢光檢測儀中檢測螢光值。
實施例14 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩衝液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩衝 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩幹液體；每孔加入封閉緩衝液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩衝液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，做六個平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩衝液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩幹液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備 用； ②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻 藍蛋白A亞基螢光蛋白混合加入稀釋緩衝液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩衝液或pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩衝液)中，兩個組分的終濃 度分別為生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體20ii g/mL、標記鏈黴親和素的結合PEB的
13別藻藍蛋白A亞基螢光蛋白10 g/mL，取上述溶液150 L分別加入到步驟①準備的平行樣 及空白對照孔中，每一種溶液對應一組平行樣，37t:孵育1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩衝 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體後，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩衝液，置於微孔板螢光檢測儀中檢測螢光值。
實施例15 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩衝液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩衝 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩幹液體；每孔加入封閉緩衝液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩衝液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，做九個平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩衝液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩幹液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備 用； ②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻 藍蛋白A亞基螢光蛋白混合加入稀釋緩衝液(含0. 1 %牛血清蛋白的含0. 05 % Tween-20的 pH7.2的PBS緩衝液)中，兩個組分的終濃度分別為生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體 20 ii g/mL、標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻藍蛋白A亞基螢光蛋白10 y g/mL，取上述溶液 150 ii L分別加入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，三組平行樣分別37t:孵育0. 5小 時、1小時、1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩衝 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體後，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩衝液，置於微孔板螢光檢測儀中檢測螢光值。
實施例16 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩衝液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩衝 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩幹液體；每孔加入封閉緩衝液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩衝液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備用；
14
(2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩衝液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋到50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL、 1. 562ng/mL、0. 781ng/mL、0. 390ng/mL，分別取150y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，每個濃度做二個平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩衝液作為空白對照，37t:孵育1. 5小 時，倒去液體，用洗滌緩衝液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗 滌4次，甩幹液體，備用；
(3)按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩衝液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 衝液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩衝液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體，備 用； ②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻 藍蛋白A亞基螢光蛋白混合加入稀釋緩衝液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7.2的PBS緩衝液)中，兩個組分的終濃度分別為生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗 體20ii g/mL、標記鏈黴親和素的結合PEB的別藻藍蛋白A亞基螢光蛋白10y g/mL，取上述 溶液150ii L分別加入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時；
(4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩衝 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩幹液體後，每孔加入150 ii L pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl 緩衝液，置於微孔板螢光檢測儀中檢測螢光值。 上述蛋白中，His-tag標記和鏈黴親和素標記所處的位置不限定位於蛋白N端，位 於別的位置只要不影響別藻藍蛋白亞基蛋白的活性也可以同樣實施本發明。同時，除了 82 位或81位半胱氨酸外，對別藻藍蛋白亞基胺基酸序列進行的其餘突變，若對別藻藍蛋白亞 基蛋白螢光性質無較大影響，也可同樣實施本發明；對別藻藍蛋白亞基胺基酸序列的N端 或C端進行部分缺失，也不會對別藻藍蛋白亞基蛋白螢光性質產生較大影響，也可同樣實 施本發明。 上述檢測方法適用於利用各種不同抗體或抗原、不同固相載體、螢光檢測儀器來 檢測可溶性抗原或抗體。但由於可能涉及的抗體種類及其繁多，藻膽蛋白種類也較多，本 發明只選取癌胚抗原及其一種鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體、鏈黴親和素標記的結合 PEB的別藻藍蛋白A亞基為例，在以96孔板為固相載體，利用微孔板螢光檢測儀，對本發明 加以說明。本領域內的技術人員可以根據上述公開的內容，材料其他材料和儀器，實施本發 明。
權利要求
一種結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白，其特徵在於將別藻藍蛋白亞基編碼基因克隆於表達質粒，表達得到別藻藍蛋白亞基。
2. 根據權利要求1所述的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白，其特徵在 於所述的蛋白質的序列為ApcA為序列1、ApcA2為序列2、ApcB為序列3、ApcD為序列4、 ApcF為序列5。
3. 根據權利要求1或2所述的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白，其特 徵在於所述的蛋白質序列N端具有His-tag標記，但是His-tag標記不限於N端。
4. 根據權利要求1、2或3所述的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白，其 特徵在於所述的結合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結合在ApcA的129位， 相當於原始別藻藍蛋白A亞基的81位，ApcA2的129位，相當於原始別藻藍蛋白A2亞基的 81位，ApcB的130位，相當於原始別藻藍蛋白B亞基的82位，ApcD的129位，相當於原始 別藻藍蛋白D亞基的81位，ApcF的130位，相當於原始別藻藍蛋白F亞基的82位。
5. —種鏈黴親和素標記的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白，其特徵在 於將鏈黴親和素編碼基因和別藻藍蛋白亞基編碼基因拼接後克隆於表達質粒，表達得到 鏈黴親和素和別藻藍蛋白亞基的融合蛋白。
6. 根據權利要求5所述的鏈黴親和素標記的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類熒 光蛋白，其特徵在於所述的蛋白質的序列為鏈黴親和素標記的ApcA為序列6、鏈黴親和 素標記的ApcA2為序列7、鏈黴親和素標記的ApcB為序列8、鏈黴親和素標記的ApcD為序 列9、鏈黴親和素標記的ApcF為序列10。
7. 根據權利要求5或6所述的一種鏈黴親和素標記的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白 亞基類螢光蛋白，其特徵在於鏈黴親和素在別藻藍蛋白亞基的N端，但是不限於在N端。
8. 根據權利要求5、6或7所述的鏈黴親和素標記的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白 亞基類螢光蛋白，其特徵在於所述的結合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結合 在鏈黴親和素標記的ApcA的257位，相當於原始別藻藍蛋白A亞基的81位，鏈黴親和素 標記的ApcA2的257位，相當於原始別藻藍蛋白A2亞基的81位，鏈黴親和素標記的ApcB 的258位，相當於原始別藻藍蛋白B亞基的82位，鏈黴親和素標記的ApcD的257位，相當 於原始別藻藍蛋白D亞基的81位，鏈黴親和素標記的ApcF的258位，相當於原始別藻藍蛋 白F亞基的82位。
9. 結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白的應用，其特徵在於利用鏈黴親 和素標記的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免 疫檢測。
10. 根據權利要求9所述的結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白的應用，其 特徵在於所述的免疫檢測包括以下步驟(1) 將可與固相結合併能識別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結合抗體部 分，備用；(2) 將待測抗原、識別抗原的第二抗體、識別第二抗體的標記生物素的抗抗體、標記鏈 黴素親和素的螢光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應；(3) 利用微孔板螢光檢測儀或其它相應的儀器檢測螢光，分析結果。
全文摘要
本發明涉及一種結合藻紅膽素PEB的別藻藍蛋白亞基類螢光蛋白及其與鏈黴親和素形成的融合蛋白，其序列為序列1至序列10；並公開了融合鏈黴親和素的螢光蛋白直接用於螢光免疫檢測的方法；別藻藍蛋白亞基保守的半胱氨酸殘基可以通過硫醚鍵結合藻紅膽素PEB，通過基因工程利用大腸桿菌製備得到螢光別藻藍蛋白的亞基，這類蛋白的光譜性質由於帶有His-tag標記，不僅便於提純，還有助於改善其溶解性，與鏈黴親和素形成融合蛋白，可以直接用於免疫螢光檢測，有利於其在各個領域中的應用。
文檔編號G01N33/52GK101759790SQ20081021966
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月4日 優先權日2008年12月4日
發明者佟順剛, 夏坤 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發有限公司