黃芪總甙在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用的製作方法

2023-05-05 09:19:51

專利名稱：黃芪總甙在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬中藥領域，具體涉及黃芪總甙在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。
背景技術：
黃芪總甙又名黃芪總苷，是黃芪中提取出來的主要成分，含黃酮類成分毛蕊異黃酮(calycosin)、3_輕基-9,10-二甲氧基紫檀燒,還含黃苗阜式1、V、III (astragaloside1、V、III)。有抗病毒(II型人皰疹病毒、B肝病毒)、保肝、抑制肝癌細胞株的增殖和誘導其凋亡、改善心臟功能、抗炎鎮痛等作用。黃芪總甙的動物實驗研究表明，能明顯抑制中性粒細胞的增生和降低炎症關節局部的細胞因子，如白細胞介素-1和一氧化氮的水平，減輕一氧化氮引起的軟骨細胞凋亡等，而且毒性低，副作用小。黃芪總甙的基本生物學作用為免疫調節，這方面的工作除完成一般免疫指標的測定外，還進行了有關作用機制的研究，包括對T細胞、B細胞、殺傷細胞、腫瘤壞死因子、白細胞介素、過氧化物、一氧化氮等細胞及體液因子的作用，結果表明黃芪總甙為一優秀的免疫調節劑，某些方面超過人參皂甙，在此基礎上完成或正在進行與某些疾病有關的藥效學試驗例如關節炎完成14個模型的研究，結果表明黃芪總甙與同類西藥比，不僅有抗炎鎮痛作用，而且黃芪總甙治療風溼性、類風溼性關節炎具有療效好、起效快、不良反應少等優點。柏長青等研究發現黃芪、黨參提取物濃度達到40 % (V/V)能夠抑制NC1-H446誘導的血管內皮細胞(ECV-304)遷移，並且具有顯著的量效關係。各種肝臟疾病，如慢性B型肝炎、慢性C型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病，自身免疫性肝病，藥物性肝病，慢性血吸蟲病以及一些代謝性或先天性慢性肝病都可通過肝纖維化發展成肝硬化。肝星狀細胞Ofepatic Stellate Cell，HSC)在肝纖維化的發生發展中起著關鍵作用。在肝臟炎症狀態下，HSC經多種細胞因子如血小板衍生生長因子(TOGF)和轉化生長因子β UTGF-β I)的激活，活 化為肌成纖維細胞並大量增殖，表達α-平滑肌肌動蛋白、合成分泌大量細胞外基質，細胞可以收縮，亦可從Disse腔內向肝細胞壞死區域遷移聚集。肝纖維化進程中，HSC所表現出的遷移特性，可導致炎症區域活化的HSC數目增多，而加重病灶局部的纖維化程度，促使疾病進展。所以，如能抑制HSC在肝損傷時向炎症區域遷移，就可能干擾或減輕肝纖維化的進程，達到抗肝纖維化的目的。而HSC的遷移受到多種細胞因子和細胞外基質成分的調控，如，H)GF、TGF-13 I等；其中TOGF是最強的促進HSC增殖遷移的刺激因子。為此，本發明設計了以TOGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，篩選出黃芪總甙抑制HSC遷移的適宜濃度及其最佳的工作濃度。目前，對黃芪總甙在抑制肝星狀細胞遷移中的作用尚未見相關報導。

發明內容
本發明要解決的技術問題在於提供黃芪總甙的新用途。
為解決上述技術問題，本發明提供黃芪總甙在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。所述黃芪總甙抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為10_4mol/L 10_7mol/L，優選為106mol/L。本發明設計了以TOGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，篩選出黃芪總甙抑制HSC遷移的適宜濃度及其最佳的工作濃度。實驗證明10_4mOl/L、10_5mOl/L、l(T6mol/L和l(T7mol/L 4個濃度梯度的黃芪總甙均可抑制TOGF誘導的LX-2遷移。l(T4mol/L組、10_5mol/L組、10_6mol/L組抑制作用相似無統計學差異，lO^mol/L抑制作用較弱且與其它3組間有顯著差異(P均< O. 05)。在與遷移同等條件下培養細胞時發現，10_4mOl/L組部分胞體回縮成卵圓形，其餘3組較正常組細胞形態無任何改變。遵從藥物篩選原則，排除10_4mol/L黃芪總甙，選擇有統計學差異中的低濃度者，即抑制遷移效率最佳者；因此，選擇黃苗總式最佳藥物濃度為ΙθΛιοΙ/L。從而本發明驗證了 ΙθΛιοΙ/L l(T7mol/L的黃苗總甙均可抑制TOGF誘導的肝星狀細胞(HSC)的遷移，從而可幹擾或減輕肝纖維化的進程，達 到抗肝纖維化的效果，即本發明驗證了黃芪總甙可用於製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物。


圖1是本發明試驗例中細胞遷移杯(Transwell)的示意圖；細胞遷移杯為一個可放置在孔板裡的小杯子，其關鍵部分就是杯底層一張半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有密度均一的許多微孔，孔徑為8. O μ m。將Transwell放入24孔培養板中形成Transwell與培養板的雙腔系統，Transwell內稱上室,培養板內稱下室,上下層培養液以半透膜相隔。將細胞種在上室內，由於聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，上層中的細胞亦可遷移至下層，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。圖2是本發明試驗例中不同濃度黃芪總甙對LX-2遷移和形態學的影響示意圖；圖2A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200)；圖2B表示對LX-2形態的影響，X 200。
具體實施例方式以下通過試驗例對本發明黃芪總甙的藥理活性試驗及結果作進一步的闡述試驗例一、材料與方法(一)材料黃苗總式Astragaloside,分子式(C41H68O51),分子量785,純度彡95% (by高效液相色譜法HPLC)，購自於南京澤朗醫藥科技有限公司。人肝星狀細胞株LX-2，其製備方法為約15g重正常人肝臟組織先後經鏈酶蛋白酶和膠原酶消化後，由8. 2% Nycodenz離心分離得肝星狀細胞(HSC)。細胞用含10%胎牛血清的M199培養液培養。當細胞長滿培養皿後，用胰蛋白酶和EDTA消化傳代，每7_10傳代一次。當HSC培養傳到4代，將SV40T-抗原DNA轉染入HSC，獲得細胞株LX-1。該細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養7代後，與原代細胞相比形態發生明顯變化，增殖加快。LX-2是以含I %胎牛血清的DMEM培養液培養半年後篩選得到的耐低血清(2%胎牛血清)培養的細胞株(具體參見L Xu, A Y Hui,E Albanis,M J Arthur, S M 0』Byrne,WS Blaner,PMukherjee,S L Friedman,F J Eng. Human hepatic stellate cell lines,LX-1and LX-2 new tools for analysis of hepatic fibrosis Gut 2005;54:142-151·)。0. 1% I 型膠原溶液(Col I，lot 107K2331)(美國 sigma 公司)。PDGF(血小板衍生生長因子)，分子量12. 4kDa, Cat. No. 220BB，純度> 97% (SDSPAGE)購於 R&D Systems, Inc。( 二 )方法1.黃芪總甙濃度配製黃芪總甙取20mg。黃芪總甙溶於2. 5ml DMSO (二甲基亞碸)中，成10_2mol/L儲存液。將上述黃芪總甙儲存液均分別經0. 45 μ m濾膜過濾除菌，以含3 % FBS的DMEM培養基依次稀釋為 l(T4mol/L，l(T5mol/L，l(T6mol/L，l(T7mol/L 共 4 個濃度梯度。2.細胞遷移篩選實驗(採用如圖1所示的細胞遷移杯)(I)細胞培養與藥物孵育將LX-2用含10% FBS DMEM在OlOOmm的培養皿中培養至細胞密度達到80 %左右。於遷移實驗開始前24h，將細胞按表I或表2分組，每組I皿並將培養液更換為3%FBSDMEM。於遷移實驗開始12h前，按照分組情況加入培養液或相應藥物的濃度進行孵育，藥物孵育時間為12h。表1.黃芪總甙篩選實驗細胞分組和孵育用藥
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權利要求
1.黃芪總甙在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述黃芪總甙抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為 10 4mol/L 10 7mol/L0
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述黃芪總甙抑制肝星狀細胞迀移的有效濃度為 10—6mol/L。
全文摘要
本發明公開了黃芪總甙在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。本發明設計了以PDGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，發現10-4mol/L～10-7mol/L的黃芪總甙均可抑制PDGF誘導的肝星狀細胞(HSC)的遷移。
文檔編號A61K36/481GK102988467SQ20111027464
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者徐列明, 張展 申請人:上海中醫藥大學附屬曙光醫院