抗胃腸疾病的鼻內接種的製作方法

2023-05-05 20:14:01 3

專利名稱：：抗胃腸疾病的鼻內接種的製作方法
背景技術：
：本發明涉及用於預防和/或治療胃腸疾病的鼻內接種方法。艱難梭菌是導致可發展為嚴重，並且有時為致命的結腸炎的與抗生素相關的腹瀉的革蘭氏陽性，形成孢子的產毒細菌。在正常的腸菌叢被例如抗生素或抗腫瘤劑治療所打亂時，艱難梭菌可在結腸中定居，在其中它產生兩種高分子量毒素，毒素A和毒素B，這兩種多肽均為細胞毒素，但毒素B的效價大於毒素A1000倍。毒素A還為腸毒素，因為它在被結紮的動物腸袢中導致體液的累積。發明概述我們已表明鼻內，和混合黏膜(例如口或鼻內)及全身性(例如及下或腹膜內)，接種方法甚至在缺乏佐劑時在誘導遠端黏膜位點(例如胃腸和/或生殖尿道)的黏膜免疫應答中也有效。使用這些方法中的一種用艱難梭菌毒素A或B(或類毒素)接種倉鼠導致保護這些動物免於後來的艱難梭菌的攻擊。因此，本發明涉及一種誘導對哺乳動物中的胃腸或生殖尿道病原體產生遠端黏膜免疫應答(即上呼吸道外，例如在胃腸和/或生殖尿道的黏膜免疫應答。在該方法中，非複製的多肽抗原被經鼻內給藥於哺乳動物，該多肽抗原被溶解在藥學上可接受的稀釋劑中，並能誘導對病原體產生遠端免疫應答。本發明還涉及一種在哺乳動物中誘導對病原體產生遠端黏膜免疫應答的方法，包括(1)用一種能誘導對哺乳動物黏膜表面產生遠端免疫應答的抗原給藥，和(2)用該抗原對哺乳動物進行胃腸外給藥。任何順序的混合黏膜和胃腸外給藥均包括在本發明中。例如，黏膜(例如，鼻，口，眼，胃，直腸，陰道，胃腸，或尿道)給藥可在胃腸外(例如靜脈內，皮下，腹膜內或肌內)給藥之前。或者胃腸外給藥可位於黏膜給藥之前作為實例，可將三周劑量經黏膜給藥(例如鼻口)，在第四周時，可進行混合黏膜(例如鼻口)和胃腸外(例如腹膜內)給藥。對其產生黏膜免疫應答的病原體也包括在本發明的方法中，從它可衍生的抗原(例如，非複製的多肽抗原)包括，但不局限於胃腸病原體，例如螺桿菌(幽門螺桿菌、貓螺桿菌和螺桿菌(H.heilmanii)，彎曲桿菌(空腸彎曲桿菌)，導致腹瀉和結腸炎的病原體(例如梭菌(例如艱難梭菌，諾氏梭菌，索氏梭菌)，腸產毒性大腸桿菌，志賀氏菌，霍亂弧菌和傷寒沙門氏菌)，和腸尿道病原體(例如人免疫缺陷病毒，單純皰疹病毒，乳頭狀瘤病毒，梅毒螺旋體，衣原體和淋病奈瑟氏球菌)。可用於本發明方法中的抗原的具體實例(例如，非複製的多肽抗原)包括，但不局限於細菌毒素。例如，可使用來自梭菌(例如艱難梭菌，諾氏梭菌，索氏梭菌)，例如艱難梭菌毒素A和/或B類毒素，諾氏梭菌α-毒素(BeHe等，Toxicon29(7)877-887，1991)，索氏梭菌致死毒素(Beffe等，見上文)和其免疫原性片段和衍生物。用於本發明方法的抗原可通過本領域已知的標準方法來獲得，例如從產生中的病原體的培養物中純化，重組DNA方法和化學合成方法。本發明可採用梭菌(例如艱難梭菌)類毒素作為疫苗抗原，類毒素是一種經處理以降低毒素的有毒性質，但仍保留了抗原性的毒素(或毒素的混合物，例如，艱難梭菌毒素A和毒素B)。包括在本發明中的類毒素使用標準方法來製備，包括，但不局限於化學(例如甲醛或戊二醛)處理，蛋白酶酶切和重組方法(例如通過產量毒素的片段或突變(例如點突變)。為了預防或降低未來被病原體感染的機會(即誘導保護性免疫應答)和/或治療正在經受的感染(即誘導治療性免疫應答)，可進行本發明的方法，在為腸病原體的情形時，可使用本發明的方法來治療處於發病危險中，但未患上由病原體(例如艱難梭菌)導致的腹瀉的哺乳動物或患有由病原體導致的腹瀉的哺乳動物，根據本發明方法，可被治療的哺乳動物包括如人，如牛，馬，豬，狗，貓，綿羊和山羊。本發明方法的一個優點是對於至少一些病原體(例如艱難梭菌毒素和類毒素)，不需要黏膜佐劑來誘導免疫應答(例如保護性免疫應答)。通過下面詳細描述的優選實施方案和權利要求，本發明的其它特點和優點將會是顯而易見的。詳細描述首先描述附圖。附1示在通過所示的路徑，用艱難梭菌抗原免疫的倉鼠中的抗艱難梭菌疾病的保護水平，顯示了在用氯林肯黴素攻擊之後，對全身性(死亡)和腸(腹瀉)疾病的保護水平。(參見用於描述免疫途徑的表1)。圖2是通過ELISA測得的在通過描述的方式給藥3劑量的疫苗後，在倉鼠血清中的對艱難梭菌毒素A，毒素B和全細胞抗原的平均(+SE)抗體效價(表見用於描述免疫途徑的表1)。分析用3劑量疫苗免疫後的倉鼠血清的特定的IgG；效價定義為具有吸收＞0.3的最大稀釋。每一條棒表示5隻動物的平均值(+SE)。圖3為顯示通過描述的途徑給藥3劑量的疫苗的倉鼠血清的生物活性的圖。檢測血清中IMR-90細胞中的細胞毒素A或細胞毒素B活性的抑制，和艱難梭菌細胞的凝集；效價被定義為具有生物活性的最大稀釋。每一條棒表示5隻動物的平均值(+SE)(參見用於描述免疫途徑的表1)。圖4顯示在鼻內腹膜內和皮下免疫的倉鼠中的長期抗體應答。顯示了氯林肯黴素攻擊之前(鼻內腹膜內-I和皮下-I)與氯可肯黴素攻擊後140天(鼻內腹膜內-II和皮下-II)之間的應答的比較。通過ELISA，檢測血清中對毒素A，毒素B和全細胞抗原的效價，效價表示為具有吸收＞0.3的最大稀釋；每一條棒表示5隻動物的平均值。圖5顯示鼻內腹膜內和皮下免疫的倉鼠中的長期抗體應答，顯示了氯可肯黴素攻擊之前(鼻內腹膜內-I和皮下-I)與氯林肯黴素攻擊後140天(鼻內腹膜內-II和皮下-II)之間的應答的的比較，檢測血清的IMR-90細胞中的細胞毒素的抑制以及艱難梭菌細胞的凝集；效價為具有生物活性的最大稀釋的血清。每條棒表示5隻動物的平均值(+SE)。圖6A-6B顯示在存在或缺乏CT時，用類毒素進行鼻口免疫後的小鼠的血清，糞便，唾液和陰道分泌物中的抗毒素A(圖6A)和抗毒素B(圖6B)IgA應答。圖7A-7C顯示在用類毒素對小鼠進行鼻口免疫後，血清抗毒素B細胞毒性(圖7A)，在用類毒素進行鼻口免疫後，血清抗毒素A細胞毒性(圖7B)和用類毒素進行鼻內免疫後。唾液和陰道分泌物的抗毒素A細胞毒性。圖8顯示使用來自用類毒素進行鼻內免疫小鼠的血清，使大鼠被結紮的腸袢免於毒素A的被動保護水平。圖9顯示在用毒素A或毒素B進行致死攻擊後，被用類毒素進行鼻口免疫的小鼠的存活百分數。圖10顯示在類毒素鼻內免疫後，小鼠被結紮腸袢中的毒素A腸毒性水平。圖11A-11B顯示通過描述的途徑用GST-ARU免疫後，毒素A特異性全身性(圖11A)和黏膜(圖11B)IgA應答(參見用於描述免疫途徑的表5)。圖12A-12B顯示用GST-ARU免疫後40天取出的血清的毒素A細胞毒性抑制水平(參見用於描述免疫途徑的表5)。圖13A-13B顯示來自GST-ARU免疫小鼠的免疫血清對大鼠腸袢中的毒素A腸毒性的被動抑制水平。圖14顯示在用重組毒素A重複(ARU)免疫後，對致死毒素A攻擊的存活百分數(參見用於描述免疫途徑的表5)。圖15顯示在用GST-ARU免疫後，被結紮小鼠腸袢中對毒素A的腸毒性的保護水平。用於在遠端位點誘導免疫應答的鼻內和混合黏膜-全身性接種方法我們已表明鼻內或混合黏膜和全身性給藥方式在胃腸和生殖尿道中導致黏膜免疫應答。本發明的方法可被用來誘導對胃腸病原體的保護性和/或治療性免疫應答。其中病原體包括，但不局限於螺桿菌(幽門螺桿菌、貓螺桿菌和螺桿菌(H.heilmanii)，彎曲桿菌(例如空腸彎曲桿菌)和導致腹瀉和結腸炎的病原體，例如梭菌腸產毒性大腸桿菌，志賀氏菌，霍亂弧菌和傷寒沙門氏菌；或腸尿道病原體(例如人免疫缺陷病毒，單純皰疹病毒，乳頭狀瘤病毒，梅毒螺旋體，衣原體和淋病奈瑟氏球菌)本領域技術人員容易選擇針對導致希望通過使用本發明方法被預防和/或治療的疾病的適宜疫苗抗原(例如多肽抗原)。在下面描述了本發明的方法，它涉及來自艱難梭菌(例如毒素或類毒素)的抗原作為可用於本發明方法中的疫苗抗原的具體實例。使用艱難梭菌毒素和類毒素作為疫苗可用於本發明方法和組合物中的艱難梭菌毒素多肽可使用多種標準方法來製備。例如，可從艱難梭菌培養物的濾液中純化毒素(例如毒素A和/或毒素B)(參見例如Kim等，感染和免疫552984-2992，1987；和參見下面實施例1)。也可使用標準的重組DNA方法來製備艱難梭菌毒素多肽(參見例如Ausubel等，編，現代分子生物學方法，JohnWiley和Sons，Inc.，1994)，在這些方法中，將適宜的宿主細胞用包含所有或部分編碼毒素的核酸片段的適宜表達載體轉化(參見Dove等，感染和免疫58480-488，1990和Barroso等，核酸研究184004，1990，分別為艱難梭菌毒素A的核苷酸和推測的胺基酸序列，和毒素B的核苷酸序列)。多種表達系統中的任何一種均可用來製備重組毒素。例如，可在原核宿主(例如大腸桿菌)或真核宿主(例如酵母細胞(例如啤酒糖酵母)哺乳動物細胞(例如COSI，NIH3T3或TEG3細胞)或節肢動物細胞(例如草地貪被蛾(SF9)細胞))中製備毒素多肽。這些細胞可從本領域技術人員已知的多種不同來源獲得，例如美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD(還參見，例如Ausubel等，見上文)。如例如在上文Ausubel等所描述的，所使用的轉染/轉化方法以及表達載體的選擇取商決於所選擇的宿主系統。表達載體(例如質粒或病毒載體)可從例如克隆載體中描述的那些中選擇實驗室手冊(Pouwels等，1985，增刊1987；還參見例如Ausubel等，見上文)。還可通過化學合成來製備艱難梭菌毒素多肽，尤其是短的片段，例如通過固相肽合成中描述的方法，1984，第二版，Stewart和Young，編，Pierce化學公司，Rockford，IL和通過標準的體外翻譯方法。本發明方法也可使用艱難梭菌毒素的類毒素。類毒素是已經處理，毒素的毒性被消除或降低，但抗原性仍被保留的毒素，類毒素可使用標準方法來製備。例如，通過化學(例如戊二醛或甲醛)處理(參見，例如Libby等，感染和免疫36822-829，1982)。如上所述，類毒素也可通過在編碼毒素的基因中產生突變，並在表達系統中表達突變來製備。可被突變的毒素A和/或毒素B中的區域包括，例如保持的半胱氨酸殘基，核苷酸結合區，內部疏水區，和/或羧基末端重複區。可用於本發明的艱難梭菌毒素中的這些突變的具體實例描述在例如Barroso等，微生物病原體16，297-303，1994中。可用於本發明的產生類毒素的方法包括對毒性必需，但與抗原性無關的胺基酸進行化學修飾。例如，在本領域上已知特異性修飾含SH的胺基酸，賴氨酸，酪氨酸，色氨酸或組氨酸殘基的試劑(參見例如Cohen等，生物化學年評37683-695，1968)，此外，可使用通過紫外照射可共價連接到毒素活性位點的疊氮連接的底物類似物，例如UDP-葡萄糖來產生類毒素。除開天然的全長艱難梭菌毒素外，毒素的多肽片段，或包含突變(可能或可能不為類毒素)的毒素(或毒素的多肽片段)可用於本發明，前提是它保留了抗原性。例如艱難梭菌毒素的片段，參見例如Price等，現代微生物學1655-60，1987；Lyerly等，現代微生物學2129-32，1990，和Frey等感染和免疫602488-2492，1992。編碼艱難梭菌毒素的片段，和/或包含突變的毒素的基因通過標準方法製備(參見例如Ausubel等，見上文)。可使用本領域的標準方法，例如通過測定黏膜免疫應答的誘導(見下文)，保護性免疫的誘導(見下文)或，治療性免疫應答的誘導來篩選包括在本發明中的片段，衍生物和類毒素的抗原性。儘管不為必需，但在本發明的方法中，佐劑可與疫苗一起給藥，可使用本領域技術人員已知的多種佐劑中的任何一種。例如，霍亂毒素(CT)，大腸桿菌的熱不穩定腸毒素(CT)，或其有佐劑活性的片段或衍生物可用於黏膜給藥。佐劑，例如RIBI(免疫化學公司，Hamiton，MT)或氫氧化鋁可用於胃腸外給藥。與例如佐劑(例如CT，LT或其具有佐劑活性的片段或衍生物)融合的包含艱難梭菌毒素(或其片段或衍生物)的融合蛋白也包括在本發明中，並且可使用標準方法製備(參見，例如Ausubel等，見上文)。此外，本發明的疫苗可與佐劑共價偶聯或交聯。將佐劑與抗原共價偶聯或交聯的方法描述在例如Cryz等，疫苗1367-71，1994；Liang等，免疫學雜誌1411495-1501，1988；和Czerkinsky等，感染和免疫571072-1077，1989。如上面所提到的，根據本發明的方法，將疫苗組合物(有或沒有佐劑)經鼻內給藥。也可使用混合類型的給藥，例如向黏膜(例如鼻內或口)表面進行首次劑量的疫苗的給藥，和可經過胃腸外給藥進行增強免疫(例如腹膜內或皮下)，這一結合給藥產生了出乎意料的良好效果。例如，可在首次黏膜給藥後一周進行胃腸外增強免疫。給藥的疫苗量取決於具體的疫苗抗原，而無論佐劑是否與疫苗抗原一起給藥，給藥的方式和頻率的及所需效果(例如保護和/或治療)而這些均可由本領域技術人員來確定。通常，本發明的疫苗抗原以例如在1μg和100mg之間的量給藥。如果佐劑與疫苗一起給藥，可使用在例如1ng與1mg之間變化的量。如果需要，可重複給藥，這可由本領域技術人員來確定。例如，3個增強劑量可以周間隔緊接在引發劑量之後。可將疫苗在任何藥物上可接受載體或稀釋劑(例如，水，鹽溶液例如磷酸緩衝鹽溶液)或碳酸氫鹽溶液(例如，0.2MNaHCO3)中給藥，根據給藥的方式和途徑以及標準的藥物實驗來選擇用於本發明的載體和稀釋劑，適宜的藥物載體和稀釋劑以及用於藥物製劑中的藥物必需物描述在為本領域標準參考書的Remington′s藥物科學和USP/NF中。下面的實施例意在說明，但不限制本發明的方法。下面提出的對於本領域技術人員來說顯而易見的對條件和參數的修改包括在本發明中。實施例兩個模型系統，小鼠和倉鼠被用於評價本發明的接種方法。由於倉鼠與人類相似，對抗生素相關的腹瀉敏感，所以倉鼠模型被用來直接評價接種抵抗艱難梭菌疾病的保護性功效。倉鼠的艱難梭菌感染導致嚴重的出血性盲腸炎，它使人聯想到在人疾病狀態時觀察到的結腸炎。此外，與艱難梭菌混合，對倉鼠口服或全身性給藥單劑量的氯林可黴素導致嚴重腹瀉，該腹瀉最終導致動物的死亡。使用多種分析方法時，倉鼠模型還可被用來監測由本發明接種方法誘導的免疫應答。例如，來自免疫倉鼠的血清和黏膜樣品可被用來測定體外細胞毒素的抑制。此外，免疫倉鼠的被結紮腸袢可被用來評價由接種誘導的毒素A的腸毒性活性的抑制。而且，可通過糞便培養物來監測艱難梭菌在倉鼠中的集群，或者可通過ELISA和/或細胞毒性分析來確定倉鼠糞便中毒素A和/或毒素B的存在。小鼠模型的特點有利於評價由本發明接種方法誘導的免疫應答。具體地說，可商業購得識別小鼠IgA的單克隆抗體，並且從而易化了小鼠黏膜免疫應答的評價。相反，這些試劑不能用於評價倉鼠黏膜免疫應答。小鼠模型的另一優點是已開發了用於取樣小鼠黏膜表面的方法，它使得能作圖對各種免疫方法產生的黏膜應答。一旦通過例如ELISA分析確定了疫苗侯選物的疫苗原性，小鼠血清樣品可被用於檢測可能與有效疫苗相關的抗體的性質。例如，可分析免疫小鼠血清(1)抑制毒素A和/或毒素B的體外細胞毒性的能力，或(2)使用用毒素A功擊的小鼠或大鼠的被結紮腸袢抑制毒素A的腸毒性的能力。還可經口或在它們被綁紮的腸袢中功擊免疫小鼠以確定對於由於毒素A的腸毒性導致的死亡或體液積累的保護。最後，將免疫小鼠用已知為致死的劑量的毒素進行全身性地攻擊。實施例1用包含艱難梭菌毒素的疫苗組合物免疫倉鼠下面方法被用來分析本發明的免疫方法在倉鼠模型系統中的功效。艱難梭菌類毒素疫苗的製備如Libby等(感染和免疫36822-829，1982)所描述的製備並滅治艱難梭菌培養物濾液。簡單地說，將艱難梭菌VPI菌株10463(ATCC保藏號43255)在透析燒瓶中培養3天，離心並過濾除菌。將1ml甲醛加入至100ml培養物濾液中，並將混合物在37℃下保溫1小時。如ELISA所測定(Lyerly，等感染和免疫47349-352，1985)，培養物濾液具有約50μg/ml毒素A的濃度，且如細胞培養物細胞毒性分析所測定(Ehrich等，感染和免疫281041-1043，1980)，對於毒素B，細胞毒性效價為106。通過在500ml細胞濃縮器(Amicon，Beverly，MA)中對30KD膜超濾，將類毒素用3體積的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)，pH7.4洗滌。將類毒素濃縮10倍，過濾除菌，並貯存於4℃下直至使用。根據毒素的大小(毒素A為308KD，毒素B為269KD)假設在濃縮步驟期間沒有明顯的毒素蛋白的損失，測得在10X溶液中的每一種滅治的毒素的濃度為500μg/ml。類毒素物質沒有任何可檢測的抗IRM-90的細胞(ATCC保藏號CCL186)的細胞毒性活性。全細胞疫苗的製備37℃下厭氧條件下，將艱難梭菌VPI菌株10463(ATCC保藏號43255)在示腖酵母提取物培養基(PPY；Holbrook等，應用細菌學雜誌42259-2731977)培養36個小時以將孢子形成減至最少。離心培養物並將沉澱的細胞用PBS洗滌3次。在最後一次洗滌後，將沉澱的細胞重新懸浮於包含1％(體積∶體積)的甲醛的PBS中並在4℃下保留24小時，通過用PBS洗滌3次除去過量的甲醛，將甲醛處理的艱難梭菌細胞懸浮液貯存於4℃下，37℃，厭氧條件下，將以等於109艱難梭菌菌落形成單位(CFU)(550nm處O.D為1.0的細胞懸浮液)接種到PPY培養基中的接種物培養36小時後不產生任何生長。動物將免疫時為6-8周齡的雌性金黃倉鼠(Meso-cricefusauratus，CharlesRiver，KingstonNY)用於全部實驗中。在免疫期間，將動物以5個一組籠養。並在用艱難梭菌攻擊期間單獨籠養。免疫方式分析七種不同的免疫方法(表1)。對於鼻口(i.n)免疫，將在10μl10X類毒素中的5μg各種類毒素(滅活的毒素A和滅活的毒素B)與包含5μg霍亂毒素(Calbiochem，LaJolla，CA)的5μl溶液混合。將15μl抗原佐劑混合物用微量加液器滴至倉鼠的外鼻孔中，向各鼻孔中滴加一半的劑量。對於胃內(i·g·)免疫，將100μg每種類毒性與10μg霍亂毒素混合，用PBS調至體積為1ml並用管飼法給藥，對於腹膜內(i·p·)和皮下(S·C·)免疫，將5μg每種類毒素與0.3ml嶄RIBI佐劑(RIBI，免疫化學公司。Hamilton，MT)混合。對於直腸(r.〕免疫，將在100μl類毒素中的50μg每種類毒素與1μl包含10μg霍亂毒素的溶液混合物。對於全細胞的直腸給藥(W·C·r)將5×108細胞與100μl類毒素中的50μg每種類毒素混合，再加上包含10ug霍亂毒素的1μl溶液，對於直腸和全細胞直腸免疫組，將樣品上樣至插入直腸3cm的可自由使用的20×11/2進樣針中，在用異熒烷輕微麻醉的動物中進行鼻內，胃內，腹膜內和皮下免疫。在戊巴比妥麻醉的動物中進行直腸和全細胞直腸免疫。對照的鼻內組(c.i.n)經鼻內接受5μg霍亂毒素。對照的皮下組(c.s.c)經皮下接受0.3ml的RIBI佐劑，5隻動物為一組用於所有免疫方法，所有組在實驗的第0，7，14和28天接受總共4劑量疫苗(或佐劑對照)。表1.用甲醛水溶液滅活的艱難梭菌培養物免疫倉鼠的方法(inip＝鼻內+腹膜內；in＝鼻內；ig＝胃內；r＝直腸；wcr＝全細胞直腸；ip＝腹膜內；sc＝皮下；cin＝對照組鼻內；csc＝對照組皮下)。為了評價免疫應答，在第0，2，4，7和36天時從異熒烷麻醉的倉鼠的腦後竇獲取血樣(200-400μl)。4℃下，讓血液凝固過夜，離心獲得血清。僅評價血清抗體；由於缺乏超宜的抗倉鼠IgA試劑，不測定分泌IgA在艱難梭菌功擊後，每隔一天從存活的動物中獲取糞便樣品，並與2體積PPY培養基混合用於評價集群的程度和毒素的存在(見下面)。艱難梭菌攻擊在第38天(第四次免疫後10天)經口胃給藥0.5mg氯林肯黴素攻擊所有倉鼠，接著3小時後，進行105CFU存活的艱難梭菌10463菌株(ATCC保藏號43255)的經口胃接種，其中艱難梭菌10463菌株已用PPY培養基洗滌以消除游離的毒素，攻擊後，每天觀察倉鼠的腹瀉和疾病。腹瀉的嚴重性記錄為0，沒有腹瀉；1+，鬆散糞便，但沒有潮溼的尾部；2+，肛門周圍和尾部區域潮溼；和3+，尾部，和下腹部潮溼(具有這種現象的動物通常彎成弓狀且不活躍)。組織損傷的評價安靜處死嚴重患病的倉鼠。將氯林肯黴素攻擊後8天獲取的來自安靜處死的倉鼠，和來自經每種免疫方法後存活的倉鼠的盲腸樣品固定在10％中性緩衝甲醛水溶液中。將甲醛水溶液固定的組織包埋在石蠟中，切成5μM的切片，用蘇木精和伊紅染色並用光學顯微鏡觀察。組織學評分標準為0，淋巴細胞，漿細胞和嗜曙紅細胞的最小滲入；1+淋巴細胞，漿細胞，嗜中性細胞和嗜曙紅細胞的輕微滲入，加入黏膜的輕微充血，有或沒有腸相關的淋巴組織的增生；2+，混合炎症細胞的中等滲入，固有膜中等充血和水腫，有或沒有杯狀細胞增生，各表面細胞壞死或液泡化，以及小囊膨脹，3+嚴重發炎，黏膜充血，水腫和出血，表面細胞壞死，或糜爛或潰瘍性退變。感染的評價研究氯林肯黴素攻擊後獲得的糞便中的艱難梭菌的存在。將在PPY培養基中稀釋10倍的稀釋物接種到包含環絲氨酸(125μg/ml)和頭黴噻吩(8μg/ml)的選擇性培養基中，並在厭氧條件下保溫48小時後計數菌落數。如製造商所描述的使用毒素A盒(Techlab，BlacksburgVA)確定糞便中毒素A的存在。在與底物一起15分鐘後，讀出450nm處的O.D.，並從在各平板中製得的毒素A的標準曲線來測定毒素的濃度使用Softmax軟體(分子設備，Sunnyvale，CA)進行測定。為了定量毒素B，將糞便懸浮液離心並過濾除菌，如下所述，檢測10倍稀釋的樣品對IMP-90成纖維細胞的細胞培養物的細胞致病作用。用於毒素A和毒素B抗體的ELISA將微量滴定平板(Corning，紐約，NY)用在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液，pH9.3中的純化的毒素A或毒素B以100ng/孔覆蓋，並在40℃下保溫過夜。洗滌平板並用2.5％脫脂奶粉(NFDM)的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)，pH7.4封閉。以1∶500-1∶64000之間變化的比例加入兩倍稀釋的血清樣品。37℃下，將平板保留1小時。加入與鹼性磷酸酶結合的抗倉鼠IgA(1∶1000，SouthernBiotech，Birmingham，AL)，37℃下保溫1小時，並在加入磷酸對硝基苯酯底物之前將其洗滌。在各平板中包括陽性對照；將孔用在100-0.8ng/ml變化，兩倍稀釋的毒素A或毒素B覆蓋，並與特異性山羊抗毒素(Techlab)反應，接著與抗山羊IgG鹼性磷酸酶偶聯物反應。陰性對照為用純化的毒素覆蓋的孔，並與抗倉鼠IgG鹼性磷酸酶結合物反應。讀取405nm的O.D.，效價定義為產生O.D.≥0.3的樣品的最大稀釋的倒數。全細胞抗原抗體的ELISA。將平板用100μl甲醛水溶液殺死的被調節為在550nm處O.D.為0.2的艱難梭菌懸浮液覆蓋，並接著在為150rpm的旋轉搖蕩器中保溫過液。通過在70℃保留2小時，將細胞固定至平板上，洗滌後，將兩倍稀釋的血清樣品以1∶100-1∶12.800的範圍加入，並在37℃保留1小時。如上所述加入抗倉鼠IgG和底物陽性對照包括在以1∶500-1∶64.000使用小鼠艱難梭菌全細胞抗血清的各孔中(使用標準方法製備針對VPI菌株10463的抗血清)。將用全細胞覆蓋的孔直接與抗倉鼠IgG鹼性磷酸酶結合物反應來作為陰性對照。細胞毒性的抑制將IMR-90成纖維細胞在含有10％胎牛血清的DMEM培養基中(Gibco，GrandIsland，NY)，在96孔平板中培養至匯合。致使細胞成為100％圓形所需的毒素A或毒素B的最小劑量被定義為1個細胞毒性單位(CTU100)對於毒素A，6.3ng/ml，對於毒素B，125pg/ml被定義為1CTU100。將在1∶100-12,800之間變化的，兩倍稀釋的倉鼠血清樣品與4CTU100的每種毒素混合，37℃保溫1小時，並接著將混合物加入到細胞中。山羊抗毒素A和山羊抗毒素B被作為陽性對照。24小時後觀察細胞，確定圓形細胞的比例。樣品的效價被定義為抑制大於50％的細胞圓形化的樣品的最大稀釋的倒數。凝集反應將25μl倉鼠血清樣品以1∶25-1∶3,200的範圍稀釋。在96孔U形底微量平板中(Falcon，Oxnard，CA)製備稀釋物，將甲醛水溶液殺死的艱難梭菌懸浮液調節至在550nm處的O.D.為1.0，將25ml懸浮液加入至血清稀釋物中。小鼠抗艱難梭菌全細胞抗血清作為陽性對照，PBS作為陰性對照。4℃下，將平板保溫過夜，接著計數凝集反應。終點效價被定義為導致凝集反應的血清的最大稀釋的倒數。蛋白質印跡分析37℃，厭氧條件下，將艱難梭菌VPI菌株10463(ATCC保藏號43255)和從氯林肯黴素攻擊後的倉鼠分離的菌株培養在5mlPPY培養基中培養36小時。離心培養物並用PBS將沉澱洗滌三次。將沉澱重新懸浮於250μl3％SDS的PBS中，溶菌產物通過12％製備SDS-聚丙烯酸胺凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)電泳在200伏下電泳1小時來進行分級分離。150伏下，在BethesdaResearchLaboratoriesMini-V8-10室(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)處置1.2小時，將蛋白從凝膠轉移至硝酸纖維素上。將膜用5％脫脂幹奶粉的PBS溶液封閉1小時，洗滌並封固在多次篩選(multiscreen)設備中(BioRad，Hercules，CA)接著加入1∶200稀釋的各倉鼠血清樣品並保溫1小時，用NBT/BCIP(Gibco，Gaithersburg，MD)促進反應。小鼠抗艱難梭菌10463全細胞血清被作為陽性對照。如上所述，對於典型的從糞便中分離的艱難梭菌菌株。來自分離物的SDS溶菌物被通過電泳分級分離，轉移至硝酸纖維素上，並與全細胞小鼠抗血清反應。統計分析運用Kruskal-Wallis檢驗(Quick-STATISTICA軟體，StatsoftTulsa，OK)研究對不同艱難梭菌抗原的免疫應答與氯林肯黴素攻擊後的倉鼠的結果之間的可能的顯著相關性。結果氯林肯黴索攻擊後的結果在末次免疫10天後用氯林肯黴素和艱難梭菌攻擊倉鼠。所有假免疫，對照鼻內(cin)和對照皮下(C.S.C)免疫的動物在攻擊48小時內死亡大多數患有嚴重(3+)腹瀉，在病原體檢測中，發現急性彌散性壞死出血性盲腸炎(等級3+)。小囊上皮畸形生長，膨脹的上皮充滿嗜中性細胞。淋巴細胞，漿細胞和嗜中性細胞浸入固有膜。攻擊失敗免疫倉鼠也在第一個48小時內死亡，在組織病理學檢測中大多數患有等級3+的腹瀉和等級3+的盲腸炎。從攻擊中存活下來的動物未患腹瀉或患有嚴重性在1+至3+變化的腹瀉。腹瀉的嚴重性與病理學檢測中的盲腸炎的嚴重性相關。患有3+腹瀉的動物患有等級為2-2.5+的亞急性，彌散性黏膜化膿性盲腸炎。嗜中性細胞，淋巴細胞和漿細胞浸入固有膜，並且還注意到多病灶性小囊膿腫。患有2+腹瀉的那些動物患有等級為1.5-2+的亞急性到慢性，中等盲腸炎。患有中等腹瀉(+)的動物患有中等淋巴細胞盲腸炎，等級為1.0-1.5+。在未患有腹瀉的倉鼠中也顯示出等級為1+的中等淋巴細胞盲腸炎。在所有疫苗組的氯林肯黴素攻擊的結果示於圖1中。通過胃內(ig)或直腸(r)途徑接受了類毒素疫苗，或通過直腸途徑接受了全細胞類毒素疫苗的黏膜免疫動物對免於死亡的保護最小，並且全部患有腹瀉。直腸和全細胞直腸免疫方法保護了僅僅20％的倉鼠，而鼻內方法保護了40％的倉鼠免於死亡。胃腸外免疫(腹膜內和皮下)的動物被全部保護免於腹瀉。在鼻內免疫的動物中觀察到類似結果。當鼻內免疫的動物通過鼻內途徑接受加大劑量的類毒素(鼻內腹膜內組，則獲得免於死亡和腹瀉的100％的保護。糞便中艱難梭菌和毒素的存在分析氯林肯黴素攻擊後獲得的糞便樣品的艱難梭菌，毒素A和毒素B的存在。在所有存活的動物中觀察到類似的圖形。在攻擊後兩天在糞便中艱難梭菌達到約109CFO/ml；此後，集群稍有減少並在至少9天中保持約108CFU/ml，而與腹瀉的存在無關。相反，毒素A和毒素B的水平一直減少，儘管存在持續的集群，在第9天時，在糞便中幾乎未發現毒素，使用針對VPI10463菌株(ATCC保藏號43255)的全細胞抗血清，通過蛋白質印跡分析定型所有分離的艱難梭菌菌株。分析從不同動物和不同免疫組分離的菌株，並發現它們相互類似，這意味著僅有一種菌株集群於所有倉鼠。然而，這種菌株不同於用於攻擊的菌株VPI10463。免疫應答在來自所有實驗組的倉鼠中測定針對艱難梭菌抗原的血清抗體。在一些組中，通過ELISA研究初次免疫後對毒素A的免疫應答。在初始疫苗劑量後的第2，4和7天通過鼻內腹膜內和全細胞直腸途徑接種的動物中未檢測到特異性IgG。在胃腸外免疫的動物中(腹膜內和皮下)，在第2和4天後未顯示應答，但在第7天，觀察到抗體效價的輕微增加。相反，在末次疫苗劑量(第36天)後測定的抗體應答證實了所有動物中的血清轉化。不存在對首先疫苗劑量的早期(回憶)抗體應答表明動物為免疫原自然的，並且以前未接觸過毒素A。三種方法被用來研究對艱難梭菌抗原的全身性抗體應答；1)通過ELISA識別被固定的抗原；2)細胞培養物分析中對細胞毒性的抑制；和3)細菌的凝集作用。毒素A，毒素B和全細胞被用作抗原。如ELISA所確定，對毒素A，毒素B和全細胞抗原的抗體應答存在於所有組中(圖2)。通過鼻內腹膜內，鼻內，胃內和腹膜內方法免疫的倉鼠具有比通過直腸(r)和全細胞直腸)和皮下途徑免疫的那些更高的針對毒素A和毒素B的應答。針對全細胞抗原的抗體水平顯示出與觀察到的針對毒素的類似的圖形。使用從氯林肯黴素攻擊後的倉鼠分離出的艱難梭菌菌株的全細胞溶胞產物，通過蛋白質印跡分析進一步表徵全細胞抗原的抗體。所有免疫方法中的動物產生為70KD蛋白和大小≥2.00KD的蛋白(其與毒素相似)的抗體；通過鼻內腹膜內途徑免疫的動物具有最強的免疫應答，通過來自用鼻內腹膜內，腹膜內和皮下途徑免疫的動物的血清識別了多種其它蛋白，但這些蛋白在來自黏膜免疫(直腸和全細胞直腸組)的血清中不明顯或不顯著。在其它分析中，將倉鼠血清針對純化的毒素和全細胞溶解產物平行地進行免疫印跡。這些分析表明與倉鼠血清反應的較低分子量的蛋白不是毒素片段。具有生物功能的血清抗體顯示出與通過ELISA獲得的那些不同的圖形(圖3)，得到所有動物中的毒素A的抗體抑制細胞毒性。通過鼻內腹膜內和腹膜內途徑免疫的倉鼠產生最大的抗毒素A活性(分別為平均值+SE22,000±49,00和18,000±2,000)，而黏膜免疫動物(鼻內，胃內，直腸和全細胞直腸)具有較低活性(分別為580±280，280±146，1720+560和2760+290)。在所有組中獲得高的抗毒素B應答，除直腸免疫動物外，僅在經胃腸外(腹膜內和皮下)，或通過混合黏膜-胃腸外途徑(鼻內腹膜內)接受類毒素疫苗的動物中產生凝集抗體。免疫應答和保護的相關性鼻內腹膜內免疫動物被全部保護免於死亡和腹瀉，並且在考慮ELISA和生物活性時，具有最大的血清免疫應答(圖2和3)。免於死亡的完全保護由包括胃腸外注射疫苗或單獨鼻內免疫的所有免疫方法來提供。相反，直腸免疫動物具有最低的保護比例和血清抗體應答，尤其是針對毒素B的中和抗體(圖3)。儘管較大的保護由鼻內疫苗提供(圖1)，然而，如鼻內和胃內組(圖2和圖3)中的相似的抗體應答所示免疫相關性是不一致的。為了定義免疫相關性，一起分析來自所有組的動物，將攻擊的結果與免疫應答比較(表2)。除開全細胞ELISA。所有試驗中的平均抗體水平在存活的動物中明顯離於具死亡結果的動物。通過所有分析與未患有腹瀉的那些動物相比，患有嚴重腹瀉(3+)的倉鼠具有明顯較低的血清免疫應答(表3)。除開在患有1+腹瀉的那些中的凝集抗體應答，在患有中等緩和腹瀉(1+和2+)的倉鼠中的抗體應答沒有明顯不同於未患有腹瀉的那些(P＜0.5)。表2針對艱難梭菌抗原的免疫應答與保護免於死亡之間的相關性。aKruskal-Wallis檢驗表3針對艱難梭菌抗原的免疫應答與腹瀉嚴重性之間的相關性為與未患有腹瀉組比較時的aP值，Kruskal-Wallis檢驗。長期保護在氯林肯黴素攻擊後，將來自鼻內腹膜內組的四隻存活動物和來自皮下組的四隻動物飼養140天。在第140天，獲取血液和糞便樣品，並將動物再用氯林肯黴素攻擊。每組四隻動物中的三隻(75％)從再次攻擊中存活下來。鼻內腹膜內組四隻動物中的兩隻(50％)及皮下組四隻動物中的零隻(0％)被保護免於腹瀉。將再次攻擊前的免疫應答與首次攻擊前獲得的應答進行比較。在ELISA分析中，毒素A和毒素B抗體未減少，儘管針對全細胞抗原的水平明顯降低(圖4)。當比較生物活性時，在再次攻擊之前觀察到抗細胞毒素活性和艱難梭菌凝集作用的明顯減少(圖5)。實施例II用包含艱難梭菌毒素的疫苗組合物免疫小鼠下面的方法被用來分析本發明的免疫方法在小鼠模型系統中的功效。ELISA用於下面實驗中的ELISA方法描述如上。簡單地說，通過用毒素A或毒素B覆蓋96孔平板，用脫脂奶粉的PBS-吐溫溶液將各孔封閉，加入來自小鼠的樣品，並用商業可購得的抗小鼠鹼性磷酸(AP)偶聯的試劑檢測來測定毒素特異性免疫應答。將平板用Sigma104鹼性磷酸酶(AP)底物(Sigma化學公司，St，Louis，MO)培養，來自這些分析的數據以在405nm處的吸收來表示(見下面)。細胞毒性毒素A和毒素B介導針對各個細胞系的細胞毒性，細胞毒性通過成纖維細胞(IMR-90)的圓形化來表示。IMR-90細胞對10-100pg毒素A和0.1-1.0pg毒素B敏感。用於細胞毒性抑制實驗的毒素的劑量相當於導致50％的匯合的單層的IMR-90細胞圓形化所需的量的8倍。將血清或分泌物適當地稀釋並在37℃，與毒素A或毒素B混合1小時，接著將毒素加至96孔細胞培養平板的匯合的孔中並保溫過夜。使用相差顯微鏡讀取平板。數據以保護50％單層免於圓形化的最大稀釋來表示。疫苗製劑如上所述製備類毒素和重組毒素A(GST-ARO)。腸毒性使用用毒素A攻擊的結紮腸袢分析毒素A的腸毒性。通過用與血清預保溫的毒素A或包含抗體的分泌物攻擊腸袢來測定抗體抑制腸毒性。在使用之前將大鼠拴緊，麻醉並將腸段結紮起來。各腸袢含有完整的血管並沒有糞便。將毒素A(1-10μg)加至各袢的腔中，用免疫血清進行和不進行預處理。4小時後，除去腸袢並稱重內含物。可以類似方式直接攻擊小鼠和倉鼠的腸袢以確定針對腸毒性的免疫功效。在小鼠腸袢分析中，將PBS處理腸袢中的體積與毒素A處理的腸袢進行比較。數據以每cm結紮腸袢的內含物的mg數來表示。全身性攻擊將小鼠用10X經腹膜內給藥的各種毒素的LD50攻擊。示於圖(見下文)中的數據是從攻擊中存活下來的動物的百分數。將倉鼠用2mg氯林肯黴素和1×107營養期艱難梭菌生物攻擊。結果用類毒素鼻內免疫小鼠在有或沒有5μgCT作為黏膜佐劑，用類毒素(15μg各種毒素)通過鼻內途徑每周免疫5隻雌性瑞士Webster小鼠(TaconicFarmsGermantawaNY)為一組的各個組。免疫方法總結在表4中。免疫後獲取血清，唾液糞便和陰道分泌物。免疫後，在血清中可檢測到特異性的IgA和IgG抗體，在唾液，糞便和針對毒素A和毒素B的黏膜表面可檢測到針對毒素A和毒素B的特異性IgA抗體(圖6A和6B)。無論CT是否與類毒素一起施用，這一應答總是明顯的。來自免疫動物的血清還抑制毒素A和毒素B的細胞毒性(圖7A-7C)。免疫血清被用於被動保護大鼠腸袢免受毒素A的腸毒性作用(圖8)。用10LD50的毒素A，並在一周後接著用10LD50的毒素B攻擊動物。所有免疫動物從這一攻擊中存活下來，而對照組沒有(圖9)。最後，將來自免疫動物的被綁紮腸袢用毒素A攻擊，這直接證明了抗體的誘導，該抗體可能為黏膜IgA抗體，能抑制體液積累並推測能抑制腹瀉(圖10)。這些數據表明當施用於黏膜表面時，艱難梭菌疫苗引發強的保護性黏膜免疫應答，並且它不需要黏膜佐劑。表4，在用艱難梭菌類毒素鼻內免疫小鼠後的黏膜免疫應答，+/-霍亂毒素(CT)；在第0，7，21，35，49和59天時進行免疫。在第70天時用毒性A/B攻擊。同一天獲取樣品(血清，糞便唾液和陰道分泌物)。(CT＝霍亂毒素；PBS＝磷酸緩衝鹽溶液)。實施例III用包含GST-ARO融合蛋白的疫苗組合物免疫小鼠艱難梭菌毒素A的羧基末端區包含一系列被認為參與毒素與靶細胞上的糖殘基結合的重複胺基酸單元(參見例如Luely等，現代微生物學2129-32，1990；Frey等，感染和免疫602488-2492，1992；和本文引用的參考文獻)。如下構建由與穀胱甘肽S轉移酶(GST)融合的艱難梭菌毒素的羧基未端區組成的融合蛋白。使用標準方法，分離包含編碼毒素A的794個羧基未端胺基酸的核苷酸的Sau3A片段(參見例如Dove等，見上文，用於毒素A基因的序列)。補齊片段的粘性未端，將具平未端的片段與SmaI消化的pGEX3X連接。將包含編碼GST-ARU的質粒的克隆在大腸桿菌中培養，並在穀胱甘肽-瓊脂糖親和柱上純化GST-ARU融合蛋白，用游離穀胱甘肽從柱中洗脫，並使用標準方法透析除去穀胱甘肽。在有或沒有CT(5μg)作為黏膜佐劑時，以4周劑量，通過胃內(IG；100μg)，鼻內(IN；50μg)；或腹膜內(IP；25μg)途徑用毒素A融合蛋白(GST-ARU)免疫雌性瑞士Webster小鼠各組(n＝5)(表5)。在末次劑量後，獲取樣品用於免疫分析。所有途徑誘導良好的針對毒素A的血清免疫應答。甚至在沒有CT時，鼻內(IN)給藥導致黏膜IgA應答。通過IG途徑的免疫也是有效的，但似乎由於黏膜佐劑的存在而增強。通過IP途徑的免疫誘導良好的全身性和糞便應答，但在唾液或陰道樣品中不能(圖11A-11B)。血清抗體沒有明顯抑制毒素A的體外細胞毒性；但能被動保護大鼠腸袢免於腸毒性，這表明羧基末端結合區僅在體內毒性中需要(圖12A-12B和13A-13B)。通過IN和IP途徑免疫的動物被保護免受死亡攻擊，但IG免疫動物沒有(圖14)。全身性攻擊的存活者也證明了在綁紮腸袢中腸毒素中和抗體的存在(圖15)。甚至沒有CT的IN免疫導致產生保護動物免受毒素A的致死作用，以及毒素A對腸黏膜的腸毒性作用的循環抗體。通過所有試驗的途徑觀察到一些保護，但IN途徑的給藥看來在引發黏膜應答中更為有效。表5。用重組艱難梭菌毒素A羧基未端(GST-ARU)免疫小鼠後的黏膜免疫應答，在第0，7，14和21天進行免疫，在第35天使用毒素A進行攻擊。在為28獲取樣品(血清，糞便，唾液和陰道分泌物)。(CT＝Xug霍亂毒素；IG＝胃內；IP＝腹膜內；PBS＝磷酸鹽緩衝溶液)。權利要求1.一種組合物，包含非複製的多肽抗原，該抗原被溶解在藥學上可接受的稀釋劑中，並給鼻內給藥時，能在哺乳動物中誘導對胃腸或生殖尿道病原體的遠端黏膜免疫應答。2.權利要求1的組合物，其中所述遠端黏膜免疫應答在胃腸道中。3.權利要求1的組合物，其中所述遠端黏膜免疫應答在生殖尿道中。4.權利要求1的組合物，其中所述病原體導致腹瀉。5.權利要求4的組合物，其中所述病原體來自梭菌屬。6.權利要求5的組合物，其中所述病原體為艱難梭菌。7.權利要求1的組合物，其中所述抗原包括所述病原體的毒素或其免疫原性片段或衍生物。8.權利要求7的組合物，其中所述抗原包括艱難梭菌毒素A，或其免疫原性片段或衍生物。9.權利要求7的組合物，其中所述抗原包括艱難梭菌毒素B或其免疫原性片段或衍生物。10.權利要求8的組合物，其中所述抗原包括艱難梭菌毒素A和艱難梭菌毒素B。11.權利要求1的組合物，其中所述抗原包括類毒素。12.權利要求11的組合物，其中所述類毒素為艱難梭菌類毒素。13.一種在哺乳動物誘導對病原體的遠端黏膜免疫應答的方法，所述方法包括步驟a.施用一種能誘導針對所述哺乳動物黏膜表面的所述免疫應答的抗原；和b.對所述哺乳動物經胃腸外給藥所述抗原。14.權利要求13的方法，其中所述哺乳動物處於出現，但未患有由所述病原體導致的腹瀉的危險期。15.權利要求14的方法，其中所述抗原為艱難梭菌類毒素。全文摘要本發明涉及用在遠端黏膜位點,例如胃腸或生殖尿道,誘導免疫應答的免疫方法。本發明的方法可用於誘導針對感染這些遠端位點的病原體(例如梭菌屬的細菌,如艱難梭菌)的保護性和/或治療性免疫應答。本發明還包括其中使用黏膜(例如口或鼻內)和胃腸外(例如皮下或腹膜內)途徑結合的接種方法。文檔編號A61P13/00GK1195993SQ9619676公開日1998年10月14日申請日期1996年6月26日優先權日1995年7月7日發明者小W·D·湯馬斯,T·P·莫納思,F·託雷斯－羅佩茲,張振西,雷文德,D·M·賴爾利,J·S·莫克裡夫申請人:奧拉瓦克斯有限公司