一種用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物及應用的製作方法

2023-05-05 16:32:56

專利名稱：一種用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因治療及新材料領域，具體涉及一種用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物及應用。
背景技術：
基因治療是一種利用分子生物學方法將目的基因導入患者體內，使之表達目的基因產物，從而使疾病得到治療的技術。基因載體是基因治療領域的核心技術之一。基因載體通常分為病毒載體和非病毒載體.在多數情況下，病毒載體的轉染效率高，但存在潛在毒性、免疫原性等問題，限制了其在臨床治療中的應用；非病毒載體雖然可以克服上述問題， 但是不利的生物分布以及低效的胞內運轉，導致活性基因轉染率低.因此提高非病毒基因載體的轉染率是當前研究的關鍵。陽離子聚合物，如殼聚糖、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚甲基丙烯醯氧乙基三甲基氯化銨等是最為常用的幾種非病毒基因載體聚合物材料。這些聚合物材料作為基因載體材料的主要問題是，其與DNA或RNA形成的複合物粒子易在生理環境下對一些蛋白質產生特異性的相互作用而產生吸附，從而影響其細胞內吞作用以及從內涵體或溶酶體中逃逸的速度繼而影響轉染效率。克服該問題的辦法主要通過化學改性的方式，如通過化學修飾方法在其結構中引入PEG鏈段，但是該方式往往同時也消耗了聚陽離子結構中的氨基，使其壓縮 DNA的能力下降。

發明內容
本發明的目的是針對上述存在問題，提供一種用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物及應用，該功能性寡聚物製備工藝簡單、易於實施；該功能性寡聚物與其它聚陽離子材料一起用作非病毒基因載體，具有低細胞毒性、良好的抗血清穩定性和高的基因轉染效率，有望用於臨床基因治療。本發明的技術方案一種用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物P(His-C0-DMAEL)，由烯丙基組氨酸衍生物，2-甲基丙烯醯胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)和含乳糖單體
2-氧-甲基-丙烯醯氧乙氧基-O，3，4，6-四-氧-乙醯基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3， 6-三-氧-乙醯基-β -D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)通過以水溶性硫代酯作為分子量調節劑自由基聚合製得，分子量為0. 5-20KDa，分子量分布為1. 0-2. 0，MA-His-OMe和MAEL摩爾比為
3-15 1。一種所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的製備方法，以MA-His-OMe 和MAEL為共單體，以2，2'-偶氮二 O-甲基丙腈)(AIBN)或4，4'-偶氮(4-氰基戊酸) (ACVA)為引發劑，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)為連轉移劑製備，步驟如下1)以組氨酸甲酯和烯丙基苯並三氮唑為原料合成2-甲基丙烯醯胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)
將4. 8g苯並三氮唑溶解在25ml 二氯甲烷中，加入1. 2g 二氯亞碸，攪拌30min後， 加入0. 86g甲基丙烯酸，繼續反應池，有機相用濃度為2摩爾/升的氫氧化鈉溶液萃取三次，有機相用硫酸鈉乾燥12h，旋蒸除去二氯甲烷，產物用快速層析柱純化，得到烯丙基苯並三氮唑。將1. 87g烯丙基苯並三氮唑溶解在50ml 二氧六環中；將1. 69g組氨酸甲酯溶解在 IOml去離子水中，磁力攪拌條件下，調節其pH值為8. 0，然後將溶解在二氧六環中的烯丙基苯並三氮唑緩慢滴加至上述組氨酸甲酯溶液中進行反應，並用薄層色譜監測反應進程，待薄層色譜顯示烯丙基苯並三氮唑消耗完全時，停止攪拌，用質量百分比濃度為10%的稀鹽酸調節溶液PH值至中性，旋蒸除去二氧六環，過濾除去不溶物並旋蒸除去水相，產物經冷凍乾燥後溶解在無水乙醇中並過濾，再將濾液旋幹並真空乾燥，得到MA-His-OMe ；2)2-氧-甲基-丙烯醯氧乙氧基，3，4，6_四-氧-乙醯基-β _D_半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙醯基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)的製備將20g乳糖、IOg無水醋酸鈉加到120ml醋酸酐中，混合併在回流溫度下反應2h， 反應結束後將產物倒入冰水中攪拌，過濾並用水洗滌固體三次，置於空氣中乾燥，然後用乙醇重結晶得到八乙醯基乳糖；在20ml 二氯甲烷中，加入5g八醯基乳糖和4. 8ml甲基丙烯酸羥乙酯以及2mL三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反應池，然後室溫反應12h，反應結束後加入 20ml去離子水，分離後依次用水、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌二氯甲烷相至中性，然後用硫酸鈉乾燥，旋蒸除去二氯甲烷並用色譜柱分離，得到MAEL ；3)用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的製備0. 96g MA-His-OMe、0· 5g MAEL、0. 0075g ACVA 和 0. 023g CPADB 溶解在 IOml N,
N' -二甲基甲醯胺中，冷凍除氧三次後密封置於70°C水浴中反應48小時，反應結束後， 先用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析48h並冷凍乾燥，然後將產物溶解在無水乙醇中，加入Iml質量百分比濃度為30%甲醇鈉的甲醇溶液並反應2小時，再用截留分子量為3500的透析袋在去離子水透析48小時並冷凍乾燥，得到功能性寡聚物 P(His-co-DMAEL)。一種所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的應用，將該功能性寡聚物與聚陽離子材料混合製備DNA或RNA複合物，用作非病毒基因載體材料，並進行細胞轉染試驗。所述聚陽離子材料包括殼聚糖(以下簡稱為CS)、聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺 (PEI)和聚甲基丙烯醯氧乙基三甲基氯化銨(PDMMC)。所述DNA或RNA複合物的製備方法是，先將0. 1-2. 0 μ g/μ 1的功能性寡聚物與 DNA或RNA室溫下混合均勻並放置15分鐘；然後再將0. 1-2. 0 μ g/ μ 1的聚陽離子材料溶液滴加入上述DNA混合液中，振動攪拌10秒使溶液混合均勻並放置15分鐘，即可製得Ν/Ρ =0.25 1-40 1 比的 DNA 或 RNA 複合物。所述功能性寡聚物與DNA或RNA的質量比為0-200 1。所述功能性寡聚物與聚陽離子材料的質量比為0-40 1。本發明的主要優點一些常用的聚陽離子材料單獨作為基因載體材料時，往往或因毒性大或轉染效率低而，難以臨床應用。本發明的方法通過引入一種多功能性的非離子寡聚物，既得到了對質粒DNA具有良好保護作用、穩定性高的複合納米粒子，同時又改善了複合粒子與細胞膜表面的結合作用以及質粒DNA在細胞之內從溶酶體/內涵體中的逃離效率，從而使複合粒子對HeLa、H印G2、NIH3T3等細胞的轉染效率較未改性聚賴氨酸、殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚甲基丙烯醯氧乙基三甲基氯化銨等聚陽離子大幅提高，有望達到臨床應用水平，同時經本發明方法改性的聚合物較未改性聚合物在細胞毒性方面也大幅下降。


圖1為聚[2-甲基丙烯醯胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯-co-2-氧-甲基-丙烯醯氧乙氧基-(2，3，4，6-四-氧-乙醯基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙醯基-β -D-吡喃葡糖糖苷]400Μ核磁譜圖。圖2為不同聚陽離子與DNA形成的複合物在相同Ν/Ρ比時的體外細胞轉染綠色螢光圖以及相對應的明場圖。圖3為相同聚陽離子與DNA形成的複合物在不同Ν/Ρ比時的體外細胞轉染綠色螢光圖以及相對應的明場圖。圖 4 為不同 P (His-co-DMAEL)含量的 PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)複合物在相同 N/ P比時的體外細胞轉染綠色螢光圖以及相對應的明場圖。圖 5 為 PLL/DNA、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)複合物在 0. 5%牛血清白蛋白(BSA) 溶液中粒徑隨時間的變化圖，複合物DNA用量為3 μ g，N/P = 15 1，功能性寡聚物與聚陽離子材料的質量比為4 1，培育時間依次為0、6、Mh。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明方案作進一步說明，但此說明並不限制本發明的範圍。實施例一種用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的製備方法，以MA-His-OMe和 MAEL為反應物，以2，2'-偶氮二 O-甲基丙腈)(以下簡稱為AIBN)或4，4'-偶氮(4-氰基戊酸)(ACVA)為引發劑，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)為連轉移劑製備，步驟如下l)MA-His-0Me 的製備4. 8g苯並三氮唑溶解在25ml 二氯甲烷中，加入1. 2g 二氯亞碸，攪拌30min後，加入0. 86g甲基丙烯酸，繼續反應2h。反應結束後，有機相用2摩爾每升的氫氧化鈉溶液萃取三次，用硫酸鈉乾燥12h。旋蒸除去二氯甲烷，產物用快速層析柱純化，得到烯丙基苯並三氮唑。將1.69g組氨酸甲酯溶解在IOml去離子水中，磁力攪拌條件下，調節其pH值至 8. 0左右，將1. 87g烯丙基苯並三氮唑溶解在50ml 二氧六環中，然後緩慢滴加至組氨酸甲酯溶液中反應，並用薄層色譜監測反應進程，待薄層色譜顯示烯丙基苯並三氮唑消耗完全，停止攪拌，用稀鹽酸調節溶液PH值至中性，旋蒸除去二氧六環，過濾除去不溶物並旋蒸除去水相。產物冷凍乾燥後溶解在無水乙醇並過濾，將濾液旋幹並真空乾燥，得到2-甲基丙烯醯胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯。2) MAEL 的製備；
將20g乳糖、IOg無水醋酸鈉加到120ml醋酸酐中，混合併在回流溫度下反應2h。 反應結束後將產物倒入冰水中攪拌，過濾並用水洗滌固體三次，置於空氣中乾燥，然後用乙醇重結晶得到八乙醯基乳糖。在20ml 二氯甲烷中，加入5g八醯基乳糖和4. 8ml甲基丙烯酸羥乙酯以及2mL的三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反應2h，然後室溫反應12h。反應結束後加入20ml去離子水並依次用水、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌二氯甲烷相至中性。接著用硫酸鈉乾燥，旋蒸除去二氯甲烷，並用色譜柱分離，得到MAEL。3)功能性寡聚物P(His-co-DMAEL)的製備。0. 96g MA-His-OMe,0. 5g MAEL、0. 023g CPADB、0. 0075g ACVA 溶解在 lOmlN，
N' -二甲基甲醯胺中，冷凍除氧三次後密封置於70°C水浴中反應48小時。反應結束後，先用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析4 並冷凍乾燥，然後將產物溶解在無水乙醇中，加入Iml 30%的甲醇鈉/甲醇溶液並反應2小時，再用截留分子量為3500的透析袋在去離子水透析48小時並冷凍乾燥，得到P(His-C0-DMAEL)。—種所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的應用，將該功能性寡聚物與聚陽離子材料混合製備DNA或RNA複合物，用作非病毒基因載體材料，並進行細胞轉染試驗。1)PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)、PLL/DNA 細胞基因轉染複合物的製備將P(His-co-DMAEL)溶於pH = 7. 4的0. OlM的磷酸鹽緩衝液(以下簡稱PBS)， 配製成lmg/ml的P(His-C0-DMAEL)溶液，將配置好的濃度為0. 2 μ g/μ L的經綠色螢光蛋白標記的質粒DNA溶液，用PBS稀釋後等體積加入到P (His-co-DMAEL)溶液中，DNA用量為 lyg，混合後室溫靜置15min。然後根據N/P = 5 1或者15 1，將計算好的lmg/ml的PLL 溶液用PBS稀釋後等體積加入，P(His-C0-DMAEL)與PLL質量比為4 1，混合併室溫靜置 15min，得到 PLL/DNA/P (Hi s-co-DMAEL)複合物。用等體積的 PBS 溶液代替 P (Hi s-co-DMAEL) 溶液，按與上述相同的方法製備得到PLL/DNA複合物。2) PEI/DNA/P (His-co-DMAEL)、PEI/DNA 細胞基因轉染複合物的製備將P(His-co-DMAEL)溶於 pH = 7. 4 的 0. OlM 的 PBS，配製成 lmg/ml 的 P(His-C0-DMAEL)溶液，將配置好的濃度為0. 2 μ g/μ L的經綠色螢光蛋白標記的質粒DNA 溶液，用PBS稀釋後等體積加入到P(His-C0-DMAEL)溶液中，DNA用量為1 μ g，混合後室溫靜置15min。然後根據Ν/Ρ =15 1，將計算好的lmg/ml的PEI溶液用PBS稀釋後等體積加入，P(His-C0-DMAEL)與PEI質量比為4 1，混合併室溫靜置15min，得到PEI/DNA/ P(His-C0-DMAEL)複合物。用等體積的PBS溶液代替P (His-co-DMAEL)溶液，按與上述相同的方法製備得到PEI/DNA複合物。3) PDMMC/DNA/P (His-co-DMAEL)、PDMMC/DNA 細胞基因轉染複合物的製備將P(His-co-DMAEL)溶於 pH = 7. 4 的 0. OlM 的 PBS 溶液，配製成 lmg/ml 的 P(His-C0-DMAEL)溶液，將配置好的濃度為0. 2 μ g/μ L的經綠色螢光蛋白標記的質粒DNA 溶液，用PBS稀釋後等體積加入到P(His-C0-DMAEL)溶液中，DNA用量為1 μ g，混合後室溫靜置15min。然後根據Ν/Ρ = 15 1，將計算好的lmg/ml的PDMMC溶液用PBS稀釋後等體積加入，P(His-co-DMAEL)與PDMMC質量比為4 1，混合併室溫靜置15min，得到PDMMC/ DNA/P (His-co-DMAEL)複合物。用等體積的PBS溶液代替P (His-co-DMAEL)溶液，按與上述相同的方法製備得到PDMMC/DNA複合物。4) CS/DNA/P (His-co-DMAEL)、CS/DNA 細胞基因轉染複合物的製備將P(His-co-DMAEL)溶於 pH = 7. 4 的 0. OlM 的 PBS 溶液，配製成 lmg/ml 的 P(His-C0-DMAEL)溶液，將配置好的濃度為0. 2 μ g/μ L的經綠色螢光蛋白標記的質粒DNA 溶液，用PBS稀釋後等體積加入到P(His-C0-DMAEL)溶液中，DNA用量為1 μ g，混合後室溫靜置15min。然後根據N/P = 15 1，將計算好的lmg/ml的CS溶液(pH = 5. 5的0. OlM的 CH3C00Na/CH3C00H 緩衝溶液)用 pH = 5. 5 的 0. OlM 的 CH3C00Na/CH3C00H 緩衝溶液稀釋後等體積加入，P (His-co-DMAEL)與CS質量比為4 1，混合併室溫靜置15min，得到CS/DNA/ P(His-C0-DMAEL)複合物。用等體積的PBS溶液代替P (His-co-DMAEL)溶液，按與上述相同的方法製備得到CS/DNA複合物。5)不同功能性寡聚物含量的PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)細胞基因轉染複合物的製備將P(His-co-DMAEL)溶於 pH = 7. 4 的 0. OlM 的 PBS 溶液，配製成 lmg/ml 的 P(His-C0-DMAEL)溶液，將配置好的濃度為0. 2 μ g/μ L的經綠色螢光蛋白標記的質粒DNA 溶液，用PBS稀釋後等體積加入到P(His-C0-DMAEL)溶液中，DNA用量為1 μ g，混合後室溫靜置15min。然後根據N/P = 15 1，將計算好的lmg/ml的PLL溶液用PBS稀釋後等體積加入，混合併室溫靜置15min，得到P(His-co-DMAEL)與PLL質量比分別為1 1,2 1,4 1， 8 1 的複合物，分別表示 PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)-1，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -2, PLL/DNA/P(His-co-DMAEL) -4，PLL/DNA/P(His-co-DMAEL) -8。6)不同聚陽離子與DNA形成的複合物在相同N/P比時的體外細胞轉染將HeLa細胞以每孔5X104的細胞數種入M孔培養板並培育M小時，然後用 0. 5ml含有不同基因轉染複合物的含10%牛血清白蛋白FBS的培養基替換原培養基並繼續培育，DNA的用量為1 μ g每孔，N/P = 15 LP(His-Co-DMAEL)與聚陽離子的質量比為 4 1，M小時後，用0.5ml含10% FBS的培養基替換含有基因轉染複合物的培養基並繼續培育，24h後用螢光倒置顯微鏡觀察。結果如圖2所示。圖 2 表明，在相同 N/P 比時，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)、PEI/DNA/ P(His-co-DMAEL)、PDMMC/DNA/P (His-co-DMAEL), CS/DNA/P (His-co-DMAEL)複合物較對應的PLL/DNA、PEI/DNA, PDMMC/DNA、CS/DNA複合物對HeLa細胞的轉染效率均顯著提高。7)相同聚陽離子與DNA形成的複合物在不同N/P比時的體外細胞轉染將HeLa細胞以每孔5X104的細胞數種入M孔培養板並培育M小時，然後用 0. 5ml含有基因轉染複合物的含10% FBS的培養基替換原培養基並繼續培育，DNA的用量為 Iyg 每孔，N/P = 5 1 或者 15 1，P (His-CO-DMAEL)與 PLL 的質量比為 4 1，24 小時後，用0. 5ml含10% FBS的培養基替換含有基因轉染複合物的培養基並繼續培育，24h後用螢光倒置顯微鏡觀察。結果如圖3所示。圖3表明，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)複合物在N/P = 5 1以及15 1時，較對應的PLL/DNA複合物對HeLa細胞的轉染效率均顯著提尚。8)不同 P (Hi s-co-DMAEL)含量的 PLL/DNA/P (Hi s-co-DMAEL)複合物在相同 N/P 比時的體外細胞轉染將HeLa細胞以每孔5 X IO4的細胞數種入M孔培養板並培育M小時，然後用 0.5ml 含有 PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)-1，PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)-2，PLL/DNA/ P(His-co-DMAEL) -4，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -8 或者 PLL/DNA 複合物的含 10% FBS 的培養基替換原培養基並繼續培育，DNA的用量為Iyg每孔，N/P= 15 1，M小時後，用0. 5ml 含10% FBS的培養基替換含有基因轉染複合物的培養基並繼續培育，24h後用螢光倒置顯微鏡觀察。結果如圖4所示。圖 4 表明，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)-1，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -2，PLL/DNA/ P (His-co-DMAEL)-4，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -8 複合物在 N/P = 15 1 時，較對應的 PLL/DNA複合物對HeLa細胞的轉染效率均顯著提高。該複合物穩定試驗在0. OlM 的 PBS 溶液中製備 PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)-1、PLL/DNA/ P (His-co-DMAEL) -2、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -4、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -8 以及 PLL/DNA複合物，每種複合物DNA用量均為3 μ g，Ν/Ρ = 15 1，然後往複合物溶液中加入牛血清白蛋白BSA溶液，使BSA最終濃度為0. 5%並混合均勻。37°C條件下分別培育0，6， Mh，然後用動態光散射DLS測定複合物粒徑。結果如圖5所示。圖 5 表明，在蛋白質溶液中，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)-1、PLL/DNA/ P (His-co-DMAEL) -2、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -4、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -8 複合物較 PLL/DNA複合物穩定性均顯著提高。
權利要求
1.一種用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物P(His-C0-DMAEL),其特徵在於 由烯丙基組氨酸衍生物，2-甲基丙烯醯胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)和含乳糖單體2-氧-甲基-丙烯醯氧乙氧基_(2，3，4，6_四-氧-乙醯基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙醯基-β-D-卩比喃葡糖糖苷(MAEL)通過以水溶性硫代酯作為分子量調節劑自由基聚合製得，分子量為0. 5-20KDa,分子量分布為1. 0-2. 0，MA-His-OMe 和MAEL摩爾比為3-15 1。
2.一種如權利要求1所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的製備方法，其特徵在於以MA-His-OMe和MAEL為共單體，以2，2'-偶氮二 O-甲基丙腈)(AIBN)或4， 4'-偶氮(4-氰基戊酸)(ACVA)為引發劑，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)為連轉移劑製備，步驟如下1)以組氨酸甲酯和烯丙基苯並三氮唑為原料合成2-甲基丙烯醯胺基-3-(4-咪唑基) 丙酸甲酯(MA-His-OMe)將4. 8g苯並三氮唑溶解在25ml 二氯甲烷中，加入1. 2g 二氯亞碸，攪拌30min後，加入 0. 86g甲基丙烯酸，繼續反應池，有機相用濃度為2摩爾/升的氫氧化鈉溶液萃取三次，有機相用硫酸鈉乾燥12h，旋蒸除去二氯甲烷，產物用快速層析柱純化，得到烯丙基苯並三氮唑。將1. 87g烯丙基苯並三氮唑溶解在50ml 二氧六環中；將1. 69g組氨酸甲酯溶解在IOml 去離子水中，磁力攪拌條件下，調節其PH值為8.0，然後將溶解在二氧六環中的烯丙基苯並三氮唑緩慢滴加至上述組氨酸甲酯溶液中進行反應，並用薄層色譜監測反應進程，待薄層色譜顯示烯丙基苯並三氮唑消耗完全時，停止攪拌，用質量百分比濃度為10%的稀鹽酸調節溶液PH值至中性，旋蒸除去二氧六環，過濾除去不溶物並旋蒸除去水相，產物經冷凍乾燥後溶解在無水乙醇中並過濾，再將濾液旋幹並真空乾燥，得到MA-His-OMe ；2)2-氧-甲基-丙烯醯氧乙氧基，3，4，6_四-氧-乙醯基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙醯基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)的製備將20g乳糖、IOg無水醋酸鈉加到120ml醋酸酐中，混合併在回流溫度下反應2h，反應結束後將產物倒入冰水中攪拌，過濾並用水洗滌固體三次，置於空氣中乾燥，然後用乙醇重結晶得到八乙醯基乳糖；在20ml 二氯甲烷中，加入5g八醯基乳糖和4. 8ml甲基丙烯酸羥乙酯以及2mL三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反應池，然後室溫反應12h，反應結束後加入20ml 去離子水，分離後依次用水、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌二氯甲烷相至中性，然後用硫酸鈉乾燥，旋蒸除去二氯甲烷，用色譜柱分離，得到MAEL ；3)用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的製備0. 96g MA-His-OMe,0. 5g MAEL、0. 0075g ACVA和 0. 023g CPADB溶解在 IOml N, N' -二甲基甲醯胺中，冷凍除氧三次後密封置於70°C水浴中反應48小時，反應結束後，先用截留分子量為3500的透析袋在去離子水中透析4 並冷凍乾燥，然後將產物溶解在無水乙醇中，加入Iml質量百分比濃度為30%甲醇鈉的甲醇溶液並反應2小時，再用截留分子量為 3500的透析袋在去離子水透析48小時並冷凍乾燥，得到功能性寡聚物P(His-C0-DMAEL)。
3.—種如權利要求1所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的應用，其特徵在於將該功能性寡聚物與聚陽離子材料混合製備DNA或RNA複合物，用作非病毒基因載體材料，並進行細胞轉染試驗。
4.根據權利要求3所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的應用，其特徵在於所述聚陽離子材料包括殼聚糖(以下簡稱為⑶)、聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)和聚甲基丙烯醯氧乙基三甲基氯化銨(PDMMC)。
5.根據權利要求3所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的應用，其特徵在於所述DNA或RNA複合物的製備方法是，先將0. 1-2. 0 μ g/μ 1的功能性寡聚物與DNA或 RNA室溫下混合均勻並放置15分鐘；然後再將0. 1-2. 0μ g/μ 1的聚陽離子材料溶液滴加入上述DNA混合液中，振動攪拌10秒使溶液混合均勻並放置15分鐘，即可製得Ν/Ρ = 0.25 1-40 1比的DNA或RNA複合物。
6.根據權利要求3所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的應用，其特徵在於所述功能性寡聚物與DNA或RNA的質量比為0-200 1。
7.根據權利要求3所述用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的應用，其特徵在於所述功能性寡聚物與聚陽離子材料的質量比為0-40 1。
全文摘要
一種用於非病毒基因載體材料的功能性寡聚物，由MA-His-OMe和MAEL通過以水溶性硫代酯作為分子量調節劑自由基聚合製得；其製備方法是以MA-His-OMe和MAEL為共單體，以AIBN)或ACVA為引發劑，以CPADB為連轉移劑製備；將該功能性寡聚物與聚陽離子材料混合製備DNA或RNA複合物，用作非病毒基因載體材料，並進行細胞轉染試驗。本發明的優點該功能性寡聚物對質粒DNA具有良好保護作用，改善了複合粒子與細胞膜表面的結合作用以及質粒DNA在細胞之內從溶酶體/內涵體中的逃離效率，從而使複合粒子對HeLa等細胞的轉染效率大幅提高，毒性大幅下降，有望達到臨床應用水平。
文檔編號C08F2/38GK102532411SQ20111044016
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者周德重, 李從欣, 胡玉玲, 郭天瑛 申請人:南開大學