一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌o157：h7的方法

2023-05-05 05:38:16

一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌o157：h7的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌O157：H7的方法，它是用CdTe量子點與大腸桿菌O157:H7多克隆抗體的偶聯，大腸桿菌O157:H7單克隆抗體包被光纖，光纖探針插入含有待測菌的溶液中，使抗原與捕獲抗體發生的特異反應從而將抗原固定於光纖上，然後再將該光纖探針插入發含有檢測抗體的溶液中，使檢測抗體上的納米量子點也結合到光纖表面，再利用光纖倏逝波生物傳感器對大腸桿菌O157:H7進行檢測，該對提高食品中病原微生物的檢出率具有重要應用價值，對於促進人類健康和我國的經濟發展具有重要意義。
【專利說明】—種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於免疫技術及衛生檢測【技術領域】，具體涉及一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法。
【背景技術】
[0002]大腸桿菌0157:H7是腸出血性大腸埃希氏菌的主要血清型，是重要的人類致病菌，可引起出血性腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合症(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)及死亡等。由於腸出血性大腸埃希菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)0157:H7對人的致病力強，近年來世界範圍內由該菌引起的不同規模、不同區域的爆發流行不斷發生，發病呈明顯上升趨勢。該菌主要通過食物、水以及直接接觸感染,動物是其主要的宿主，因此加強對進口冷凍肉類、禽類及其製品的檢驗力度是預防該菌汙染食品的重要手段。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種安全、快速、靈敏的檢測食品中大腸桿菌0157:H7的方法，一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法。
[0004]—種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法,它包括:
DCdTe量子點與大腸桿菌0157:H7多克隆抗體的偶聯
取水溶性CdTe量子點與PBS緩衝液混合，大腸桿菌0157:H7多克隆抗體加入到上述混合液中，然後將加入新製備的EDC溶液，將混合樣品在37°C培養箱中避光反應2個小時，然後4°C過夜，將反應混合液離心，上清液用超濾膜反覆進行超濾，去除小分子物質和未反應的CdTe量子點，收集超濾膜截留的CdTe-多克隆抗體偶聯物；
2)捕獲抗體光纖探針的製備
將聚苯乙烯光纖表面，先用鹽酸和乙醇混合液清洗，再用硫酸清洗，接下來在超純水中煮沸，使光纖表面具有親水的極化層；然後將處理好的光纖放入I大腸桿菌0157單抗的溶液中浸泡，取出用去離子水洗淨，即得到包被有捕獲抗體光纖探針；
3)大腸桿菌0157:H7的檢測
將CdTe-多克隆抗體偶聯物製成水溶液，將捕獲抗體光纖探針插入待測溶液中，然後再將捕獲抗體光纖探針放入CdTe-多克隆抗體偶聯物製成水溶液中，用光纖倏逝波生物傳感器檢測；
步驟I)所述的混合樣品，包含1.0mL量子點，1.0mL PBS，400uL抗體，IOOuL EDC。
[0005]步驟2)所述的光纖為聚苯乙烯光纖；
步驟2)所述的大腸桿菌0157:H7單抗溶液為10 μ g/ml ；
步驟3) CdTe-多克隆抗體偶聯物製成水溶液為100 μ g/ml。
[0006]本發明所採用的技術方案是:將捕獲抗體(大腸桿菌0157:H7單克隆抗體)與探針共價偶聯形成光纖探針；所用檢測抗體為用納米量子點(CdFe)進行了標記的大腸桿菌0157:H7多克隆抗體；其中捕獲抗體和檢測抗體均能特異與大腸桿菌0157:H7結合；當將光纖探針插入含有待測菌的溶液中，使抗原與捕獲抗體發生的特異反應從而將抗原固定於光纖上，然後再將該光纖探針插入發含有檢測抗體的溶液中，使檢測抗體上的納米量子點也結合到光纖表面，再通過向光纖傳感器中輸入激發光使其形成的倏逝波場效應，從而激發光纖傳感器表面的檢測抗體上的納米量子點標記物產生螢光信號，根據檢測螢光信號強度變化可判斷免疫反應是否發生以此來實現對大腸桿菌0157:H7的特異檢測。
[0007]本方法建立了一種基於倏逝波場激發的納米量子點免疫光纖生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法。基於倏逝波場激發的量子點免疫光纖生物傳感器是螢光生物傳感器的一種。它主要結合了光在光纖中傳播時產生倏逝波場以及抗體一抗原免疫反應的高特異性和高靈敏度的特點。倏逝波場激發的原理是:當光在光纖內以全反射方式傳輸時，產生一種橫貫光纖的波，通過纖芯與包層的交界處傳出光纖，這種波隨傳播距離呈指數衰減，稱為倏逝波。由於傳送到待測微生物溶液中的倏逝波場深度只有波長量級，所以光纖倏逝波生物傳感器只能探測到結合於倏逝波場範圍內的螢光染料發出的螢光，而溶液中游離的螢光染料對測量結果無影響。因此與其他生物檢測手段相比，光纖倏逝波生物傳感器具有如下優點:1)靈敏度高，生物特異性強；2)操作簡單，測量速度快；3)可以對生物反應過程進行動態監測；4)可以使儀器小型化。
[0008]而量子點具有激發光譜寬，且連續分布，發射光譜呈對稱分布且寬度窄，顏色隨粒徑大小可調，不同發光波長的量子點可用同一波長的光激發，並且光化學穩定性極高，不易分解。量子點代替傳統的螢光染料檢測食品中的病源性微生物，其獲得了更強的螢光強度，更長的發光時間和更靈敏的信號，從而使得大大的降低了待測樣品的檢測限。
本發明提供了一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法，它是用CdTe量子點與大腸桿菌0157:H7多克隆抗體的偶聯，大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被光纖，光纖探針插入含有待測菌的溶液中，使抗原與捕獲抗體發生的特異反應從而將抗原固定於光纖上，然後再將該光纖探針插入發含有檢測抗體的溶液中，使檢測抗體上的納米量子點也結合到光纖表面，再利用光纖倏逝波生物傳感器對大腸桿菌0157:H7進行檢測，該方法提高了檢測效率，對提高食品中病原微生物的檢出率具有重要應用價值，對於促進人類健康和我國的經濟發展具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1、大腸桿菌0157靈敏度的檢測結果；
圖2、大腸桿菌0157特異性檢測結果。
【具體實施方式】
[0010]實施例1大腸桿菌0157:H7抗原菌液的製備和BALB/c小鼠免疫
取本研究實_80°C保存的標準大腸桿菌0157:H7 (ATCC11229)，經肉湯培養後，劃線法於LB上培養，常規方法增菌培養，6000r/min離心lOmin，收集菌體沉澱，用滅菌生理鹽水重複離洗三次後進行菌落計數(2.0X 108CFU/mL)，加入終濃度為0.3%的甲醛4°C過夜使菌體滅活。次日將洗脫好的菌液在20KHz、150W的冰浴條件下進行超聲波使菌體細胞破碎，每次破碎10s，間隔10s，總用時20min。採用BCA蛋白測定試劑盒測定菌體蛋白含量，結果為2.636 mg/mL0
[0011]取8周齡雌性BALB/c小鼠進行免疫。首免採用上述滅活菌液(2X 108CFU/mL)與等量弗氏完全佐劑混合後腹腔注射50 μ L，皮下注射50 μ L，以後每隔2周免疫I次，換用弗氏不完全佐劑，劑量同前，共免3次。
[0012]3免後，小鼠斷尾採血，用常規間接ELISA方法檢測血清效價。其中，包被抗原是實施例I所製備的大腸桿菌0157:Η7菌液，稀釋度為1:50，小鼠血清濃度為200X稀釋度開始的梯度濃度，酶標二抗為HRP(辣根過氧化物酶)標記的兔抗小鼠IgG(稀釋度為1:15000)。測定結果表明，抗體效價為1:25600。
[0013]實施例2 CdTe量子點與大腸桿菌0157:Η7多克隆抗體的偶聯
取ImL的水溶性CdTe量子點與ImL PBS (ρΗ=7.4)緩衝液混合，將400uL的大腸桿菌0157:H7多克隆抗體(lmg/ml)加入到上述混合液中，然後將IOOuL新製備的EDC溶液(4mg/ml)加入到混合液中，樣品在37°C培養箱中避光反應2個小時，然後4°C過夜。將2.5mL反應混合液(包含 1.0mL 量子點，1.0mL PBS,400uL 抗體，IOOuL EDC)5000r/min 離心 2min，取上清液，上清用截留分子量為100000的超濾膜反覆進行超濾，去除小分子物質和未反應的CdTe量子點，收集超濾膜截留的CdTe-抗體偶聯物，然後用PBS (pH7.4)溶解。4°C避光保存備用。
實施例3光纖與捕獲抗體的包被
將聚苯乙烯光纖表面，先用清洗液(36-38%濃HCL:70-90%乙醇溶液體積比為1:1)清洗10分鐘，再用70%濃硫酸清洗10分鐘，接下來在超純水中煮沸10分鐘，使光纖表面具有親水的極化層。然後將處理好的光纖放入10 μ g/ml大腸桿菌0157:H7單抗(保藏編號為:CGMCC N0.6251，抗大腸桿菌0157: H7單克隆抗體雜交瘤細胞株，已於2012年06月20日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市北辰西路I號院3號保藏。)的溶液中浸泡lh，取出用去離子水洗淨，即得到包被有捕獲抗體光纖探針。
[0014]實施例4應用光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法
將捕獲抗體光纖探針插入待測溶液中，如果該溶液中存在與光纖探針上捕獲抗體反應的大腸桿菌0157:H7，由於該菌能與捕獲抗體特異性結合從而形成複合分子；然後再將光纖探針放入含有100 μ g/ml納米量子點標記的檢測抗體溶液中，則該溶液中的檢測抗體與光纖上與捕獲抗體結合的大腸桿菌0157:H7通過免疫反應結合，則該納米量子點被固定在光纖探針上，然後通過倏逝波生物傳感器(光纖傳感器及光纖均由中科院長春光學精密機械與物理所提供)進行檢測。
[0015]實施例5檢測靈敏度的確定
將大腸桿菌0157:H7菌株在LB液體培養基中，42 °C培養18 h?24 h。瓊脂平板進行計數。將包被大腸桿菌0157:H7菌的單克隆抗體的光纖探針分別插入濃度為5 X 10° CFU/mL '5X101 CFU/mL、5X102 CFU/mL、5X103 CFU/mL、5X104 CFU/mL、5X105 CFU/mL和5X106CFU/mL的大腸桿菌0157:H7菌溶液及空白溶液中孵育10 min，加陰性對照，PBS清洗三遍後再與量子點標記的多抗反應lOmin，然後上機進行測量。測試結果如下圖1所示，其中大腸桿菌0157菌液濃度高於5 X IO1 CUF/mL都能夠檢出，說明該方法最低能檢測到50個CFU/ml的大腸桿菌0157。
[0016]實施例6特異性試驗用建立的光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7菌的方法對已知的產氣莢膜梭菌(ATCC13124)、綿羊李斯特氏菌(ATCC11387)、英諾克李斯特氏菌(ATCC19119)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、腸炎沙門氏菌(ATCC13076)、傷寒沙門氏菌(ATCC13311 )、大腸埃希菌(ATCC25922)、蠟樣芽胞桿菌(ATCC11778))、大腸桿菌0157 (ATCC35150)、空腸彎曲桿菌(ATCC33291)等細菌進行特異性交叉試驗，同時空白對照。如圖2所示，結果表明該方法特異性較強，只對大腸桿菌0157:H7具有發生反應，而對其他菌沒有交叉反應。
[0017]實施例7人工添加樣品的檢測
取雞肉25g加入225mL的LB培養基中，分別加入大腸桿菌0157菌懸液，使其初始菌液濃度達到 5 CFU/mL, 10 CFU/mL, 20 CFU/mL, 50 CFU/mL, 100 CFU/mL，均質後，取 2mL 上清，煮沸滅菌，各取ImL用於檢測。檢測結果如表1所示，其檢測靈敏度可達到50 CFU/mL,即在樣品中若含有50 CFU/mL的在大腸桿菌0157即可被檢出，而對於20 CFU/mL的濃度的樣品3次檢測中可能有I~2次結果為陽性。
【權利要求】
1.一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法,它包括: DCdTe量子點與大腸桿菌0157:H7多克隆抗體的偶聯 取水溶性CdTe量子點與PBS緩衝液混合，大腸桿菌0157:H7多克隆抗體加入到上述混合液中，然後將加入新製備的EDC溶液，將混合樣品在37°C培養箱中避光反應2個小時，然後4°C過夜，將反應混合液離心，上清液用超濾膜反覆進行超濾，去除小分子物質和未反應的CdTe量子點，收集超濾膜截留的CdTe-多克隆抗體偶聯物； 2)捕獲抗體光纖探針的製備 將聚苯乙烯光纖表面，先用鹽酸和乙醇混合液清洗，再用硫酸清洗，接下來在超純水中煮沸，使光纖表面具有親水的極化層；然後將處理好的光纖放入I大腸桿菌0157單抗的溶液中浸泡，取出用去離子水洗淨，即得到包被有捕獲抗體光纖探針； 3)大腸桿菌0157:H7的檢測 將CdTe-多克隆抗體偶聯物製成水溶液，將捕獲抗體光纖探針插入待測溶液中，然後再將捕獲抗體光纖探針放入CdTe-多克隆抗體偶聯物製成的水溶液中，用光纖倏逝波生物傳感器檢測。
2.根據權利要求1所述的一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法，其特徵在於:步驟I)所述的混合樣品，包含1.0mL量子點，1.0mL PBS，400uL抗體，IOOuL EDC0
3.根據權利要求2所述的一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法，其特徵在於:步驟2)所述的光纖為聚苯乙烯光纖。
4.根據權利要求3所述的一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法，其特徵在於:步驟2)所述的大腸桿菌0157:H7單抗溶液為10 yg/mL.
5.根據權利要求4所述的一種基於光纖倏逝波生物傳感器檢測大腸桿菌0157:H7的方法，其特徵在於:步驟3) CdTe-多克隆抗體偶聯物製成的水溶液為100 μ g/ml。
【文檔編號】G01N21/64GK103913577SQ201410082184
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】劉金華, 劉韜, 孟日增, 魏春豔, 盧春梅 申請人:吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心