葡激酶微乳製劑及其製備方法
2023-05-05 05:48:21
專利名稱：葡激酶微乳製劑及其製備方法
微乳是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例混合後自發形成的各相同性、透明、熱力學穩定的分散體系，80年代後作為藥物載體受到醫藥界的重視，在藥物製劑研究及臨床方面的應用日益廣泛。
微乳的實質是乳劑的一種，乳滴小於50nm，乳滴均勻地分散在連續相中。連續相為油相，分散相為水相的微乳稱W/O型微乳；而連續相為水相，分散相為油相的微乳稱O/W型微乳。根據藥物的溶解特性，藥物常分散或溶解於分散相中。對於水溶性良好的蛋白質，一般把蛋白質溶解於水相中，形成W/O型微乳。
W/O型微乳的吸收機理有兩種方式，一種是擬脂滴吸收方式，因為微乳乳滴很小，只有20-40nm，若選擇適當的表面活性劑和助表面活性劑，使其穩定性增加，則微乳與微小脂滴很相似，可以以擬脂滴形式被吸收，即以被動轉運方式進入淋巴管，再入血循環；另一種吸收方式是胞飲，因為外相油膜呈脂性，可以與腸上皮細胞接觸，再加上微乳內含有的表面活性劑可改變細胞膜張力，引起膜內陷，細胞膜與微乳外相油膜融合，把蛋白質導入胞內。基於這樣的吸收機制，微乳的吸收量有可能比其它任何一種製劑都大。
微乳作為蛋白質的口服載體，通過對蛋白質的包裹，可以避開胃酸和胃腸道內各種酶的降解，例如把水溶性良好的胰島素製成W/O型微乳，胰島素溶解於內水相中，外油相可有效把蛋白水解酶拒之於外。微乳還具有緩釋作用，W/O型微乳猶如水溶性藥物的儲庫，可使藥物持續釋放，增加藥物的生物利用度、延長藥物半衰期。
除了用於降低移植後排斥反應的環孢菌素(cyclosporine A，MW＝1202)微乳外，至今還不見水溶性蛋白質的口服微乳面市。cyclosporine A是一種含11個胺基酸的環狀多肽化合物，不溶於水，易溶於乙醇，幾乎不溶於油，但通過乙醇的介導很好地溶於油中後，加入O/W型表面活性劑及相應的助表面活性劑，口服，進入胃腸道，自發形成O/W型微乳，這就是1994年5月Sandoz公司在德國上市的第二代Sandimmun Neoral軟膠囊。cyclosporine A微乳的成功給藥劑工作者不少啟示。
cyclosporine A與一般蛋白質的本質區別在於溶解性，一般蛋白質呈水溶性，其微乳只能製備W/O型。因為內水相體積有限，如佔10％左右，和毫微粒一樣，蛋白質包裹率約0.5mg/g微乳；同時微乳製備工藝中需要多種親脂性物質，如外油相、表面活性劑和助表面活性劑，這些物質的總量相對水相大得多，以致親水性的蛋白質在這樣非極性環境中容易變性析出。W/O型微乳的另一個問題是穩定性，包括儲存穩定性和體內親水環境中的穩定性。雖然存在以上問題，但是微乳仍不啻是口服蛋白質的一種相當有前途的載體。
組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)等溶栓藥物廣泛應用於臨床以後，葡激酶(staphylokinase，Sak)以其纖維蛋白特異性強、良好的溶栓能力、分子量小等優點日益受到人們重視。上述幾種藥物均以靜脈滴注方式給藥，用於急性心肌梗塞等血管栓塞性疾病的急救，溶栓治療最佳時間是發病6hr內。但是，靜脈注射必須在醫院進行，由此，許多病人失去了溶栓治療的機會。
本發明的目的是提供一種以葡激酶為原料的，適合於較長期使用的非靜脈滴注預防性藥物製劑，提高人血漿中纖溶或抗凝活性，預防急性心肌梗塞和腦梗塞等血栓性疾病。能服用方便。
本發明採用葡激酶包括從葡萄球菌中提取的天然葡激酶(有公開文獻報導)、重組葡激酶(recombinant staphylokinase，r-Sak，專利號為94112105)、通過基因突變產生的葡激酶各種突變體及上述品種的體外修飾物為原料。
本發明集中於以下幾個方面a.對油相的選擇，如長鏈、中鏈脂肪酸，長鏈、中鏈脂肪酸酯，長鏈脂肪醇及上述幾種的混合物，包括它們的飽和、不飽和、直鏈、含支鏈形式。如大豆油、蓖麻油、亞油酸、油酸、單硬脂酸甘油酯(如Myvaple 600，Eastman Fine Chemical Company)、單油酸甘油酯(如Myverol 18-92，Eastman Fine Chemical Company)、中鏈(C8-C10)脂肪酸的甘油酯(如Captex 366、Captex200、Capmul MCM，Abitec Corporation)、十六醇等。
b.選擇適當的表面活性劑，增加藥物的包裹量。選擇毒性小、口服安全的非離子型表面活性劑，如脂肪酸甘油酯、PEG類衍生物(如PEG 400單油酸酯、PEG 400單月桂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇醚類(如Brij類)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween類)、山梨醇及失水山梨醇脂肪酸酯(Span類)、聚氧乙烯脂肪酸酯類(Myrj類)、Vitamin E衍生物類(如Vitamin E TPGS，Eastamn Fine ChemicalCompany)、聚氧烯烴整體共聚表面活性劑(Pluronic類)；天然表面活性劑，如卵磷脂、豆磷脂、膽甾醇和膽酸類、海藻酸鈉等；部分陰離子表面活性劑，如二辛基琥珀醯磺酸鈉(Aerosol OT)。
c.選擇刺激性小的助表面活性劑，減少或不用助表面活性劑。例如選擇聚合度小的聚乙二醇類，如PEG 400。
d.增加微乳的穩定性，包括對水稀釋的穩定性及儲存穩定性。水相中加入一定量高分子物質(如明膠、PVP)以提高水相粘度、高HLB值的表面活性劑和低HLB值的表面活性劑混合使用(如將單甘酯、卵磷脂、膽固醇等表面活性劑混合使用)、加入一定量O/W型表面活性劑以使微乳進入胃腸道內立即形成W/O/W型復乳等措施有助於提高微乳的對水稀釋穩定性。
e.增加微乳的粘度，使微乳固化。選擇適當的親脂性添加劑，使微乳在常溫下成流動性很小的凝膠狀或固狀，進入體內後又融化成液態。硬脂酸鈉、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、Vitamin E-TPGS等都有此作用。選擇適當的固化載體，如CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、HPC等，將液狀的微乳吸收，轉化成固狀，可提高微乳的儲存穩定性。
f.微乳中加入適量抑菌劑、抗氧劑。
g.將微乳(液狀、凝膠狀或固狀)裝入膠囊(軟膠囊或硬膠囊，小腸溶、結腸溶或胃溶)。
本發明採用下列技術方案1.微乳製備油相的選擇見上述a。若油相本身在室溫下部分或全部呈固狀或半固狀，需熔融或以適量溶劑如乙醇、PEG 400溶解。油相中加入0.005-0.02％叔丁基對羥基茴香醚(BHA)或二丁甲苯酚(BHT)作抗氧劑。
水相為含Sak的緩衝液(pH 4-9)，可加1-10％高聚合度PEG(聚合度≥20)、0.1-1％明膠或0.1-5％PVP等高分子物質，增加內水相粘度，使微乳穩定。水相中含0.01-0.25％尼泊金類抑菌劑。
乳化劑一般是表面活性劑，包括非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、天然表面活性劑(見上述b)，含量大於油相量的20％，親水親油平衡值(HLB)範圍比較廣。可以使用一種表面活性劑，也可高HLB值的表面活性劑和低HLB值的表面活性劑混合使用，一般地，HLB總＝5-20。若乳化劑水溶性好，則可部分先溶解於含Sak的緩衝液裡，再滴入油相、助乳化劑(見上述c)及其它乳化劑的混合液中；若乳化劑水溶性較差，可先以助乳化劑、油相溶解，或與油相熔融混勻後加入水相。
操作順序一般是在攪拌下，把水相滴入含表面活性劑(和助表面活性劑)的油相中。
所有操作在37℃或室溫下完成，得到透明W/O微乳。
增加微乳的穩定性的措施，包括對水稀釋的穩定性及儲存穩定性見上述d、e。
為了使微乳服用方便、易於運輸及增加微乳的儲存穩定性，可把微乳固體化，如把微乳裝入膠囊(見e)。腸溶型材料包括鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(HPMCP)、鄰苯二甲酸聚乙烯醇酯(PVAP)、苯乙烯馬來酸共聚物(StyMA)、丙烯酸樹脂(如Eudragit L100、Eudragit S100)等，軟膠囊可採用壓製法製得。
2.生物活性法檢測微乳體外穩定性及大鼠口服Sak W/O微乳生物利用度2.1微乳體外穩定性微乳1g，加入PBS 100ml，37℃攪拌2-4hr後，10000rpm×20min離心，酪蛋白板溶圈法測水層纖溶活性。
2.2大鼠口服Sak W/O微乳生物利用度SD大鼠24隻，分成對照組和給藥組，每組12隻，其中給藥組服含1.5mg Sak的微乳，對照組服等體積空白微乳，給藥前及給藥後每隔2hr尾部取血0.4ml，肝素抗凝，3000rpm×5min離心，取血漿。
不影響Sak活性的Sak單抗純化後包被於96孔板，加入待測血漿及含有Sak活性標準系列，37℃溫育1hr，傾去，洗滌後加入發色底物S2390與人纖溶酶原混合液，37℃溫育，測A405，作活性-時間曲線，計算AUCpo。
大鼠12隻，戊巴比妥鈉麻醉，靜脈注射與上述口服劑量相同的Sak，不同時間取血，酪蛋白板溶圈法測血漿中纖溶活性變化，計算AUCiv。
計算大鼠口服口服Sak微乳的生物利用度。
微乳載藥量定義為每g微乳含有的Sak毫克數。
微乳按1∶100用PBS稀釋，37℃攪拌2hr，酪蛋白板溶圈法顯示，水相Sak量佔總Sak量2-10％，表明微乳比較穩定。
大鼠口服Sak微乳後血漿纖溶活性明顯上升，證實了部分Sak進入血液循環。
人或大鼠靜脈注射Sak，快速消除相t1/2＝3.0min，而口服Sak微乳t1/2為2-3hr(見附表4)，說明口服Sak製劑具緩釋作用。
本發明的Sak微乳除了可用於口服吸收(小腸吸收、結腸吸收)之外，還可用於透皮吸收。
表1例舉了Sak 5種W/O型微乳的製備方案(以A、B、C、D和E表示)。其中水相為含有Sak、抑菌劑、0.5％明膠的PBS(pH7.4)溶液，油酸中含抗氧劑。
實施例1把油酸、Tween 80、Span 80混合，三者互溶，加入助表面活性劑正丁醇、PEG 400，室溫攪拌下滴入水相，混勻即可。
實施例250℃融化Vitamin E TPGS，加入油酸、Span 80，三者互溶，使溫度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保溫的水相，混勻即可。
實施例360℃融化Pluronic F68，加入油酸、Span 80，三者互溶，使溫度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保溫的水相，混勻即可。
實施例4卵磷脂以乙醇溶解，加入PEG 400、油酸，混合均勻，室溫攪拌下滴入水相，混勻即可。
實施例510％AOT以乙醇溶解，加入PEG 400、油酸，混合均勻，室溫攪拌下滴入水相，混勻即可。
實施例6大豆油4g、Pluronic F68 2g、Span 85 1.2g、Sak溶液0.9ml。60℃融化Pluronic F68，加入大豆油、Span 85，三者互溶，使溫度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保溫的水相，混勻即可。
實施例7亞油酸3.5g、Vitamin E TPGS1.8g、Span 830.8g、Sak溶液1.1ml。50℃融化Vitamin E TPGS，加入亞油酸、Span83，三者互溶，使溫度降至37℃，37℃下逐滴滴加37℃保溫的水相，混勻即可。
1g該微乳可以3g海藻酸或單硬脂酸酯吸收，成固體製劑。
實施例8Captex 366 10g、Tween 20 5g、Myvaple 600 1.5g、PEG400 3ml、Sak溶液2.7ml。Myvaple 600與Captex 366、PEG400混合，加熱熔融，加入Tween 20，混勻，使溫度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保溫的水相，混勻即可。
例2、3、6、7、8在37℃呈流動性良好的液體狀，當溫度降至20℃左右，粘度逐漸增高，流動性差；溫度進一步降低，可呈固狀，易於貯存，此時若再將溫度升至37℃，製劑又呈流動性良好的液體。
表2例舉了表1中Sak 5種W/O型微乳的載藥量(mg/g微乳)。
表3例舉了表1中Sak 5種W/O型微乳在PBS中37℃攪拌2hr後，水層的纖溶活性佔微乳中Sak總活性的百分數。
表4例舉了表1中Sak 5種W/O型微乳大鼠口服的生物利用度(活性代謝方式)。
附
圖1為大鼠口服微乳後血漿纖溶活性的變化。
由例1-5可見，表面活性劑的選擇直接影響微乳的載藥量、穩定性及口服給藥的生物利用度。
表1是微乳成分表表1
表2是W/O微乳載藥量表2單位mg/gA BC D E0.18 0.75 0.63 0.38 0.82表3是微乳在PBS中37℃攪拌2hr後，水層的纖溶活性佔微乳中Sak總活性的百分數表3A B CD E8.9％ 4.1％ 2.0％7.0％ 2.5％表4為大鼠口服r-Sak W/O微乳生物利用度(活性代謝方式)表4A B C D EAUCpo1035 1542 1491 9901959(HU.min.ml-1)AUCiv26502(HU.min.ml-1)生物利用度 3.9％ 5.7％ 5.7％ 3.6％ 7.2％t1/2po(hr) 2.54 2.54 2.45 2.43 2.94t1/2iv(min)3.0
權利要求
1.一種葡激酶的微乳製劑，其特徵在於採用葡激酶作為原料，採用水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑混合物作為藥物載體，製備微乳製劑。
2.按權利要求1所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的葡激酶包括天然葡激酶、重組葡激酶、通過基因突變產生的各種突變體及上述品種的體外修飾物。
3.按權利要求1所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的油相包含長鏈、中鏈脂肪酸，長鏈、中鏈脂肪酸酯，長鏈脂肪醇及上述幾種的混合物，包括它們的飽和、不飽和、直鏈、含支鏈形式。
4.按權利要求3所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的油相包含如大豆油、蓖麻油、亞油酸、油酸、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯、中鏈(C8-C10)脂肪酸的甘油酯、十六醇等。
5.按權利要求1所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的表面活性劑為非離子型表面活性劑、天然表面活性劑、部分陰離子表面活性劑。
6.按權利要求5所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的非離子型表面活性劑是脂肪酸甘油酯、PEG類衍生物、聚氧乙烯脂肪醇醚類、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、山梨醇及失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯類、Vitamin E衍生物類、聚氧烯烴整體共聚表面活性劑。
7.按權利要求5所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的天然表面活性劑是卵磷脂、豆磷脂、膽甾醇和膽酸類、海藻酸鈉等。
8.按權利要求5所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的部分陰離子表面活性劑是二辛基琥珀醯磺酸鈉。
9.按權利要求1所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的助表面活性劑是採用聚乙二醇類。
10.按權利要求1所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於採取水中加入高分子物質、高HLB值的表面活性劑和低HLB值的表面活性劑混合使用、加入O/W型表面活性劑等措施提高水相粘度和微乳對水稀釋的穩定性。
11.按權利要求1所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於採用親脂性添加劑和固化載體。
12.按權利要求10所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的親脂性添加劑為硬脂酸鈉、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、VitaminE-TPGS等。
13.按權利要求10所述的葡激酶微乳製劑，其特徵在於所述的固化載體為CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、HPC等。
14.一種葡激酶微乳劑的製備方法，其特徵在於採用下述步驟(1)選擇油相，若油相是固體的半固體狀，熔融或加溶劑溶解，再往油相內加入抗氧劑。(2)製備水相，水相中含葡激酶。(3)選擇表面活性劑作乳化劑。(4)在37℃或室溫下，攪拌中把水相滴入含表面活性劑的油相中。(5)增加微乳粘度或固化微乳，提高微乳穩定性。(6)微乳裝入膠囊。
全文摘要
本發明採用不同的油相、表面活性劑、助表面活性劑及多種添加劑,製備葡激酶(Sak)W/O型微乳製劑,實驗證明:微乳體外稀釋試驗穩定;動物及人口服吸收效果良好,與注射Sak水溶液比較,口服微乳使血漿纖溶活性升高的時間明顯延長。本發明微乳能提高血漿纖溶活性,在通過消化道時保護Sak活性,有緩釋作用,具有預防血栓性疾病的功效。
文檔編號A61K38/43GK1264598SQ00111418
公開日2000年8月30日 申請日期2000年1月5日 優先權日2000年1月5日
發明者宋後燕, 黃陽濱 申請人:上海醫科大學