液相晶片檢測金黃色葡萄球菌的方法
2023-05-05 11:23:11 1
專利名稱：液相晶片檢測金黃色葡萄球菌的方法
液相晶片檢測金黃色葡萄球菌的方法技術領域
本發明屬於免疫技術及食品衛生檢測技術領域。
技術背景
金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌， 可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血症、膿毒症等全身感染。金黃色葡萄球菌存在於自然界的空氣、水、灰塵及人和動物的排洩物中。因而，食品受其汙染的機會很多。近年來，美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染佔第二位，僅次於大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，佔整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，佔到45%，我國每年發生的此類中毒事件也非常多。因此建立一種及時，快速，準確的檢測金黃色葡萄球菌的方法顯得尤為重要。發明內容
本發明的目的是提供一種運用液相晶片技術，用於檢測金黃色葡萄球菌的方法， 以便實現對金黃色葡萄球菌的快速檢測。
本發明由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標記的抗抗體、鏈黴親和素-藻紅蛋白組成，所述微球為羧基化的31號微球；所述捕獲抗體是金黃色葡萄球菌單克隆抗體，所述檢測抗體是金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，生物素標記的抗抗體是經活化的生物素標記的羊抗兔IgG ；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與金黃色葡萄球菌結合，以紅色雷射激發其球型基質上的紅色分類螢光，以綠色雷射激發與生物素標記的抗抗體相結合的藻紅蛋白，測定球型基質上結合的報告螢光分子的數量，用於間接確定球型基質上結合金黃色葡萄球菌的數量；捕獲抗體與微球偶聯形成偶聯體取微球原液室溫恢復30min，用超聲波清洗機進行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布；用無菌水分別配製50mg/ml的EDC和NHS，然後取200ul的微球原液置於1. 5ml的離心管中，14000 rpm，離心5min，取出後棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化緩衝液，混勻後，用鋁箔紙包好，置於37°C搖床120 rpm，20min，然後14000 rpm，離心 5min,小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置於37°C搖床120 rpm,孵育池，取出後離心棄上清，用500ul的PBS進行洗滌，洗滌後加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個小時進行封閉，封閉後4°C保存； 液相晶片檢測金黃色葡萄球菌將已偶聯的微球混合液室溫恢復lOmin，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個微球， 加入IO8 CFU/ml的金黃色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN補足體積到lOOul，置於37°C搖床 120rpm，lh，取出後離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補足體積到lOOul，置於37°C搖床120rpm，lh,取出後離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然後加入已稀釋的生物素標記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補足體積到IOOul，置於37°C搖床反應lh，取出後離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補足體積到IOOul，置於37°C搖床反應，取出後離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸於IOOul PBS-TBN中，上機進行檢測。
本發明液相晶片是集合流式細胞技術、雷射技術、數位訊號處理技術及傳統化學技術為一體的新型生物分子檢測技術，其最大的特點是高通量，靈活性好，靈敏度高。運用液相晶片技術檢測金黃色葡萄球菌(step如A^occm aureus)的方法，以便實現對金黃色葡萄球菌的快速檢測，為食品安全做出貢獻。
圖1是本發明捕獲抗體最佳工作濃度； 圖2是本發明靈敏度檢測結果；圖3是本發明特異性的檢測結果； 圖4是本發明重複性檢測結果；圖5是本發明在進行檢測時所顯示微球位置以及數量的實時圖的點狀圖； 圖6是本發明在進行檢測時所顯示微球位置以及數量的實時圖的柱狀圖。
具體實施方式
本發明所採用的技術方案是通過金黃色葡萄球菌的特異抗體，與微球進行偶聯後，製備出可以對金黃色葡萄球菌進行檢測的液相晶片，在應用時，加入樣品增菌液，使增菌液中的金黃色葡萄球菌被微球上的捕獲抗體所捕獲，檢測抗體也與金黃色葡萄球菌結合後，再與生物素標記的抗抗體共同孵育，然後通過生物素與鏈黴親和素-藻紅蛋白反應，應用LuminexlOO檢測系統實現對金黃色葡萄球菌的特異檢測。
本發明涉及的檢測金黃色葡萄球菌液相晶片主要由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標記的抗抗體、鏈黴親和素-藻紅蛋白(SA-PE)組成。所述微球為羧基化的31號微球；所述捕獲抗體是金黃色葡萄球菌的單克隆抗體a mAb)，所述檢測抗體是金黃色葡萄球菌的多克隆抗體(份.a pAb)，生物素標記的抗抗體是經活化的生物素標記的羊抗兔 IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與金黃色葡萄球菌結合。以紅色雷射激發其球型基質上的紅色分類螢光，以綠色雷射激發與生物素標記的抗抗體相結合的藻紅蛋白，測定球型基質上結合的報告螢光分子的數量，用於間接確定球型基質上結合金黃色葡萄球菌的數量。
上述的檢測抗體是用於識別金黃色葡萄球菌的另一類抗體，其作用是將與液相晶片上捕獲抗體結合的金黃色葡萄球菌與抗抗體結合，而抗抗體能與檢測螢光偶聯，間接將結合的金黃色葡萄球菌濃度與檢測螢光的強度結合起來，從而實現對金黃色葡萄球菌的濃度進行定量測定。生物素標記的抗抗體通過生物素與鏈黴親和素-藻紅蛋白結合，最後通過LuminexlOO檢測系統對金黃色葡萄球菌進行定性定量檢測。
(1)捕獲抗體與微球偶聯形成偶聯體取微球原液室溫恢復30min，用超聲波清洗機進行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布。用無菌水分別配製50mg/ml的EDC和NHS。然後取200ul的微球原液置於1. 5ml的離心管中，14000 rpm，離心5min。取出後棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul 的活化緩衝液。混勻後，用鋁箔紙包好，置於37°C搖床120 rpm，20min，然後14000 rpm，離心5min，小心移去上清。加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置於37°C搖床120 rpm,孵育池。取出後離心棄上清，用500ul的PBS進行洗滌，洗滌後加入500ul 1 % BSA的PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個小時進行封閉。封閉後4°C保存。
(2)應用液相晶片檢測金黃色葡萄球菌的方法將已偶聯的微球混合液室溫恢復lOmin，漩渦振蕩器震蕩約;3min。取約5000個微球， 加入IO8 CFU/ml的金黃色葡萄球菌IOul，用PBS-TBN補足體積到IOOul。置於37°C搖床 120rpm, Ih。取出後離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次。加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補足體積到IOOul。置於37°C搖床120rpm，lh。取出後離心，棄上清，用PBS-TBN 洗兩次。然後加入已稀釋的生物素標記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補足體積到IOOul。 置於37°C搖床反應lh。取出後離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次。再加入SA-PE，用PBS-TBN 補足體積到lOOul，置於37°C搖床反應，取出後離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次。重懸於 IOOul PBS-TBN中，上機進行檢測。
1.捕獲抗體最佳工作濃度的確定見圖1，當單抗濃度為250ug/ml時，其MFI值達到最大，故單抗最佳的工作濃度為 250ug/mlo
2.偶聯是否成功的檢測
權利要求
1. 一種液相晶片檢測金黃色葡萄球菌的方法，其特徵在於由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標記的抗抗體、鏈黴親和素-藻紅蛋白組成，所述微球為羧基化的31號微球；所述捕獲抗體是金黃色葡萄球菌單克隆抗體，所述檢測抗體是金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，生物素標記的抗抗體是經活化的生物素標記的羊抗兔IgG ；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與金黃色葡萄球菌結合，以紅色雷射激發其球型基質上的紅色分類螢光，以綠色雷射激發與生物素標記的抗抗體相結合的藻紅蛋白，測定球型基質上結合的報告螢光分子的數量，用於間接確定球型基質上結合金黃色葡萄球菌的數量； 捕獲抗體與微球偶聯形成偶聯體取微球原液室溫恢復30min，用超聲波清洗機進行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布；用無菌水分別配製50mg/ml的EDC和NHS，然後取200ul的微球原液置於1. 5ml的離心管中，14000 rpm，離心5min，取出後棄上清，加入NHS和EDC各IOul，再加入80ul的活化緩衝液，混勻後，用鋁箔紙包好，置於37°C搖床120 rpm，20min，然後14000 rpm，離心 5min,小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置於37°C搖床120 rpm,孵育池，取出後離心棄上清，用500ul的PBS進行洗滌，洗滌後加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個小時進行封閉，封閉後4°C保存； 液相晶片檢測金黃色葡萄球菌將已偶聯的微球混合液室溫恢復lOmin，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個微球， 加入IO8 CFU/ml的金黃色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN補足體積到lOOul，置於37°C搖床 120rpm，lh，取出後離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補足體積到lOOul，置於37°C搖床120rpm，lh，取出後離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然後加入已稀釋的生物素標記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補足體積到lOOul，置於37°C搖床反應lh，取出後離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補足體積到lOOul，置於37°C搖床反應，取出後離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸於IOOul PBS-TBN中，上機進行檢測。
全文摘要
一種液相晶片檢測金黃色葡萄球菌的方法，屬於免疫技術及食品衛生檢測技術領域。本發明的目的是提供一種運用液相晶片技術，提供一種用於檢測金黃色葡萄球菌的方法，以便實現對金黃色葡萄球菌的快速檢測。本發明製備了液相晶片，然後應用液相晶片檢測金黃色葡萄球菌。本發明液相晶片是集合流式細胞技術、雷射技術、數位訊號處理技術及傳統化學技術為一體的新型生物分子檢測技術，其最大的特點是高通量，靈活性好，靈敏度高。運用液相晶片技術檢測金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的方法，以便實現對金黃色葡萄球菌的快速檢測，為食品安全做出貢獻。
文檔編號G01N33/577GK102507949SQ20111036055
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者劉金華, 宋戰昀, 王亞麗, 王振國, 羅雁非, 蔡陽 申請人:吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心