一種檢測肥胖相關基因snp的檢測試劑盒的製作方法

2023-06-22 15:04:56 5

專利名稱：一種檢測肥胖相關基因snp的檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及生物晶片領域，具體地涉及一種用於檢測肥胖相關基因的單核苷酸多態性(SNP)的寡核苷酸晶片及相應的檢測試劑盒。

背景技術：
我國正處於經濟快速增長的社會發展階段，近年來的統計資料表明，心血管疾病已經成為導致中國居民死亡的首要原因。在心血管疾病的眾多病因中，肥胖是一個重要的因素。肥胖是一種以機體脂肪的過度積聚與脂肪組織的過量擴增為表現的疾病，它不僅會導致高血壓、動脈粥樣硬化和冠脈系統疾病，同時還是內分泌系統疾病，如糖尿病，及各種腫瘤的誘發因素。
目前對於體脂的含量，雖可用脂溶氣體同位素85氪(85Kr)密閉吸入稀釋法直接測得，或用體密度或比重測定計算、同位素40鉀或42鉀全身掃描以及重水(D2O)稀釋法等間接測得。但由於這些方法操作複雜，並需特殊設備，不便於臨床應用。在臨床實踐中，對肥胖程度最為簡易的辦法，一般認為是體重測量和皮褶厚度測量。然而，以上所有方法均無法對肥胖的發生進行有效地預測。
然而，目前為止尚缺乏快速、靈敏地同時檢測多個與肥胖相關基因的SNP的晶片。因此，本領域迫切需要開發可快速、靈敏地同時檢測多個與肥胖相關基因的SNP的晶片。

發明內容
本發明的目的就是提供一種可快速靈敏地同時檢測多個與肥胖相關基因的SNP的晶片和相應的檢測試劑盒。
在本發明的第一方面，提供了一種用於檢測肥胖相關基因單核苷酸多態性的寡核苷酸晶片，它包括 2-10000種(較佳地3-1000種，更佳地4-500種)球形的固相載體，所述的固相載體分別帶有不同的螢光標記，從而可以互相區分，並且每一種固相載體的數量為103-107個(較佳地103-106個，更佳地104-105個)； 並且在每一種固相載體上，連接有單鏈寡核苷酸分子，所述的單鏈寡核苷酸分子特異性地結合於一種肥胖相關基因。
在另一優選例中，所述的球形固相載體的直徑為1-100微米。
在另一優選例中，所述的寡核苷酸選自下組 UCP2探針 正常5』-ttttttttttttttttgaacccgggtatctcacca-3』 突變5』-tttttttttttttttcccttccgctggagatttac-3』 ADRB2探針 正常5』-ttttttttttttttttgtgttcggcgacttggtag-3』 突變5』-tttttttttttttttacctgctgggccgggatgtt-3』 ADRB3探針 正常5』-tttttttttttttttggctttggacgctctttaa-3』 突變5』-tttttttttttttttaggaaaggagaggcgtcgtc-3』 PPARγ探針正常5』-tttttttttttttttaaccaccttaagggacggac-3』 突變5』-tttttttttttttttgttccggtttcgccatgaga-3』。
在本實用新型的第二方面，提供了一種用於檢測肥胖相關基因單核苷酸多態性的試劑盒，它包括 (a)一個容器a，以及裝於所述容器中的上述的用於檢測肥胖相關基因單核苷酸多態性的寡核苷酸晶片。
在另一優選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的組件 (b)一個引物容器b，以及位於位於所述引物容器中的寡核苷酸引物混合物，所述寡核苷酸引物用於擴增肥胖相關基因； (c)一個聚合酶容器c，以及位於所述聚合酶容器中的DNA聚合酶； (d)一個等位基因特異性引物容器d，以及位於所述容器b的等位基因特異性寡核苷酸引物混合物。
在另一優選例中，所述的試劑盒還包括 (e)裝於容器e內的標記的核苷酸； (f)容器f，和裝於容器f內的用於特異位點引物延伸(ASPE)反應的DNA聚合酶； (g)容器g，和裝於容器g內的雜交液； (h)容器h，和裝於容器h內的雜交後洗液； (i)容器i，和裝於容器i內的能與標記的核苷酸結合的螢光染料； (j)陽性對照和陰性對照。
在另一優選例中，球形固相載體的直徑為1-100微米，更佳地2-50微米。
在另一優選例中，裝於容器b內的引物選自下組 UCP2引物上遊5』-gagatgactggaggtgggaag-3』 下遊5』-catttggcgctgcaggccgg-3』 ADRB2引物 上遊5』-ccgccgtgggtccgcc-3』 下遊5』-ccatgaccagatcagcac-3』 ADRB3引物 上遊5』-cgcccaataccgccaacac-3』 下遊5』-ccaccaggagtcccatcacc-3』 PPARγ引物 上遊5』-gccaattcaagcccagtc-3』 下遊5』-gcagacagtgtatcagtgaagg-3』。
在另一優選例中，裝於容器c內的等位基因特異性引物選自下組 UCP2正常5』-tggtgagatacccgggttcatcaggggccagtgcgcgctacagc-3』 突變5』-gtaaatctccagcggaagggtacggtcaggggccagtgcgcgctacagt-3』 ADRB2 正常5』-ctaccaagtcgccgaacacacgccggaccacgacgtcacgcagc-3』 突變5』-aacatcccggcccagcaggtcgccggaccacgacgtcacgcagg-3』 ADRB3 正常5』-ttaaagagcgtccaaagccctgctggtcatcgtggccatcgcct-3』 突變5』-gacgacgcctctcctttcctctgctggtcatcgtggccatcgccc-3』 PPARγ正常5』-gtccgtcccttaaggtggttacagtgtatcagtgaaggaatcgctttctgg-3』 突變5』-tctcatggcgaaaccggaacacagtgtatcagtgaaggaatcgctttctgc-3』。

圖1是本實用新型寡核苷酸晶片一個實例的結構示意圖。
圖2是本實用新型的寡核苷酸晶片的檢測示意圖。
圖3是本實用新型的一個實例的檢測結果。其中泳道1為目的基因，泳道2為分子量標準品。
圖4顯示了本實用新型的一個實例中對UCP2、ADRB2、ADRB3、PPARγ的SNP檢測結果。
圖5顯示了的PCR操作流程圖。
具體實施方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，將針對不同肥胖相關基因SNP的寡核苷酸固化在不同的球形的固相載體上，製得寡核苷酸晶片和檢測試劑盒。通過取樣、基因組的提取，核酸靶片段的擴增，及對核酸靶片段中特定位點SNP的分析等步驟，本發明的晶片利用寡核苷酸鏈間可特異性互補配對的特性來檢測具有不同核苷酸序列的目的基因，從而可以快速靈敏地同時檢測多個與肥胖相關基因的SNP。
本實用新型的目的是提供一種檢測4個與肥胖相關基因SNP的液相寡核苷酸晶片檢測試劑盒，這種液相寡核苷酸晶片檢測試劑盒其主要技術特徵在於將液相寡核苷酸晶片與ASPE方法相結合，對與肥胖相關的UCP2(55A/V)、ADRB2(27Q/E)、ADRB3(64W/R)、PPARγ(12P/A)進行聯合基因SNP位點分析。
本實用新型的晶片結構可參見圖1。其中10為第一球形載體，12為與球形載體10連接並固定的第一種寡核苷酸探針，20為第二球形載體，22為與球形載體20連接並固定的第二種寡核苷酸探針，第一球形載體10與第二球形載體20自身具有可區別的不同螢光信號。
在另一優選例中，本實用新型的晶片所用的固相載體是一種直徑5.5微米，以不同螢光標記的微珠。在每種微珠(固相載體)均偶聯了具有不同結合特異性的寡核苷酸(檢測探針)。
本發明還提供了一種用於檢測肥胖相關基因單核苷酸多態性的試劑盒，它包括一個容器a，以及裝於所述容器中的上述的用於檢測肥胖相關基因單核苷酸多態性的寡核苷酸晶片。
在另一優選例中，本實用新型的試劑盒還至少包括一管寡核苷酸引物混合物，該寡核苷酸引物混合物可在DNA聚合酶及相應緩衝溶液、dNTP和人基因組模板存在時，通過至少一個循環周期的PCR反應，對4個目的基因進行有效地擴增。
可用於本實用新型的DNA聚合酶有多種，如由Takara公司生產的Taq DNApolymerase。PCR反應循環周期包括a)加熱變性；b)退火，引物與模板或樣品中的靶核苷酸雜交；c)延伸，DNA聚合酶延長靶核苷酸鏈。
本實用新型公開的液相寡核苷酸晶片試劑盒其特徵在於至少包括一管ASPE寡核苷酸引物混合物，一管特定標記的核苷酸和一管可用於ASPE反應的DNA聚合酶。該ASPE寡核苷酸引物混合物可在DNA聚合酶及相應緩衝溶液、特定標記的核苷酸和經擴增純化後的目的基因存在時，通過至少一個循環周期的PCR反應(ASPE)，對4個目的基因進行有效地標記。
可用於本實用新型的ASPE反應的DNA聚合酶有多種，其具有5』端至3』端聚合酶活性，但不具有3』端至5』端外切酶活性；當引物3』端與靶基因SNP位點不匹配時，該DAN聚合酶無法擴增目的基因，只有當引物3』端與靶基因SNP位點完全匹配時，引物才能進一步延伸，同時已標記的核苷酸參入到新合成的目的基因中。
在另一優選例中，本實用新型的晶片試劑盒還至少包括一管雜交液，該雜交液用於液相寡核苷酸晶片與經標記的新合成的目的基因的雜交。
在另一優選例中，本實用新型的晶片試劑盒還至少包括一管雜交後洗液，該雜交後洗液用於液相寡核苷酸晶片與經標記的新合成的目的基因的雜交後的洗滌。
在另一優選例中，本實用新型的晶片試劑盒還至少包括一管能與特定標記的核苷酸結合的螢光染料。
在另一優選例中，本實用新型的晶片試劑盒還至少包括一管陽性對照，該陽性對照用於在擴增4個目的基因時，對擴增過程進行控制。
在另一優選例中，本實用新型的晶片試劑盒還至少包括一管陰性對照，該陽性對照用於在對4個目的基因擴增標記時，對該過程進行控制。
本實用新型還提供了相應的檢測方法。通常，檢測方法包括如下步驟 1.取待檢人員外周血或其它組織，提取基因組DNA； 2.以適量的基因組DNA為模板，經PCR反應擴增相應的目的基因片段； 3.收集目的基因PCR擴增產物，並對其進行PCR產物純化； 4.以適量的經純化的目的基因PCR擴增產物為模板，經PCR反應擴增得到帶有特定標記的寡核苷酸； 5.使用集成了不同結合特異性的液相寡核苷酸晶片對經PCR反應擴增得到帶有特定標記的寡核苷酸進行鑑定(參見圖2)； (a)將製備好的液相寡核苷酸晶片加入PCR薄壁管中，將帶有特定標記的寡核苷酸加入液相微珠寡核苷酸晶片中，並加入適量的雜交液，42度孵育30-60分鐘； (b)將雜交後的液相晶片轉入96孔抽濾板或離心管中。抽濾或高速離心後棄上清，加入雜交後洗液洗去未結合的寡核苷酸； (c)向液相晶片中加入相應螢光染料，反應後以液相晶片檢測儀進行檢測； 6.經過寡核苷酸晶片篩選鑑定到的陽性樣本，即表明其基因組中與肥胖相關的基因存在相應位點的點突變。
本實用新型的優越性在於 第一，可以同時對某一個體基因組樣本中與肥胖相關的基因進行SNP分析。
第二，節省了大量時間與資金，同時在很大程度上降低了檢測時的背景信號。大大促進了對基因組中廣泛存在的SNP的研究。寡核苷酸晶片將具有不同結合特異性的寡核苷酸集成於晶片上，採用ASPE的方法對基因SNP金星分析，最大限度降低了不同基因在雜交時存在的非特異性的結合，從而大大降低了背景信號的產生。
第三，本實用新型在促進了基因組學研究的同時，對人群進行大規模的篩查，並在基因水平上對預測人類肥胖的發生及對肥胖和相關疾病的治療有很好的促進作用。
下面結合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應理解，這些實施例僅用於說明本實用新型而不用於限制本實用新型的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 晶片製備方法(微珠包被方法) 取5×105個微珠(購自Bio-Rad公司)，震蕩、超聲30秒→50微升0.1M MES重懸，震蕩、超聲30秒→加入0.3nmol檢測探針(博亞生物技術公司合成，見下表a)→加入0.5ul 50mg/ml EDC→震蕩30分鐘→加入0.5ul 50mg/ml EDC，震蕩30分鐘→1.0毫升含0.02％ Tween-20的PBS洗滌→1.0毫升含0.1％SDS的PBS洗滌→50微升TE重懸。
表a 晶片上用於肥胖相關基因的檢測探針 (3)微珠包被效率的檢測。
(a)檢測微珠包被效率的標籤序列 Lug Tag Sequence5』-acttggcctg-3』其中5』端生物素標記 (b)雜交反應體系如下 1.5×TMAC雜交緩衝液33微升 微珠2500個 Lug Tag序列0.05nmol TE適量 總量50微升 (c)雜交反應條件如下 94℃變性10分鐘，然後42℃ 1小時。
結果製得了分別針對4種SNP的微球，即晶片。
實施例2 ASPE擴增產物的製備 一、人基因組DNA的製備 (1)取人適量全血或其它組織，提取基因組DNA。
(2)採用PCR對基因組DNA中的4個目的基因進行擴增。4個目的基因分別為UCP2、ADRB2、ADRB3和PPARγ。
(a)4個目的基因的引物序列分別為 表b 4個目的基因的引物序列 (b)PCR反應條件如下 如圖5所示。
(c)PCR反應體系如下 10×PCR緩衝液5微升 25mM MgCl23微升 2.5mM dNTP5微升 Taq DNA聚合酶5單位 10mM引物各2微升 模板1微克 H2O適量 總量50微升 (d)回收並純化多重PCR反應產物。
檢測結果如圖3所示。
二、採用PCR對純化後的多重PCR反應產物進行等位基因特異性引物延伸。
(a)4個目的基因的等位基因特異性引物序列分別為 表c 4個目的基因的等位基因特異性引物序列 (b)PCR反應條件如下 同1(b)中所示的條件(圖5)。
(c)PCR反應體系如下 10×PCR緩衝液1.5微升 25mM MgCl20.45微升 5mM dATP，dGTP，dTTP0.4微升 0.4mM Biotin-dCTP4微升 Tsp DNA聚合酶1單位 10mM引物各2微升 模板0.5微克 H2O適量 總量15微升 結果ASPE擴增，得到ASPE擴增產物。
實施例3 SNP的檢測 在本實施例中，用實施例1製備的晶片對實施例2中ASPE擴增產物進行檢測。
(a)雜交反應體系如下 1.5×TMAC雜交緩衝液33微升 微珠各2500個 PCR產物5微升 TE適量 總量50微升 (b)雜交反應條件如下 94℃預變性10分鐘→94℃ 30秒，42℃ 30秒(共52個循環，每循環-1℃)→42℃ 1小時 (c)雜交後洗滌及螢光染色方法對雜交後溶液，16000rpm離心5分鐘。棄上清，加入150微升6×SSPET溶液重懸，然後16000rpm離心5分鐘。再次棄上清，加入75微升適量濃度(Sigma公司產品1mg/ml，1∶25稀釋)的SA-PE溶液重懸，高速震蕩10分鐘，然後取50微升上樣檢測。
(d)SNP檢測結果 採用本方法對30餘份人基因組樣本進行分析。
結果如圖4以及表1和表2所示。 表1 樣本SNP檢測結果 表2 人基因組樣本SNP檢測結果判定 上述結果顯示各基因型差異顯示良好。
對全部樣本進行基因測序，並將測序結果與晶片檢測結果相比較，結果完全一致。
實施例4 檢測試劑盒的製備 製備包含以下組件的試劑盒 (a)一個容器a，以及裝於所述容器中分別偶聯了UCP2(55A/V)、ADRB2(27Q/E)、ADRB3(64W/R)、PPARγ(12P/A)這4個基因檢測探針的4對(8種)不同微珠的混合物。(實施例1中製備) (b)一個引物容器b，以及位於位於所述引物容器中的寡核苷酸引物混合物，所述寡核苷酸引物用於擴增肥胖相關基因(見表b)； (c)一個聚合酶容器c，以及位於所述聚合酶容器中的Taq DNA聚合酶； (d)一個等位基因特異性引物容器d，以及位於所述容器b的等位基因特異性寡核苷酸引物混合物(見表c)。
(e)裝於容器e內的螢光標記的核苷酸； (f)容器f，和裝於容器f內的用於特異位點引物延伸(ASPE)反應的DNA聚合酶； (g)容器g，和裝於容器g內的雜交液； (h)容器h，和裝於容器h內的雜交後洗液； (i)容器i，和裝於容器i內的能與標記的核苷酸結合的螢光染料； (j)陽性對照和陰性對照。
其中，組件(e)～(j)的試劑與實施例1-3中所用的相同。
討論 隨著人類基因組計劃的實施和推進，生命科學研究已進入了後基因組時代。各種基因在個體之間表現的差異，越來越受到人們的關注。在所有這些基因表現的差異中，最為常見的是單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphism，SNP)。對於人類基因組SNP的分析有助於確定人類疾病易感基因、藥物敏感性和遺傳多樣性。
近來對參與「體脂恆定調控網絡」若干候選基因的SNP研究發現，這些基因包括瘦素(LEP)、瘦素受體(LEPR)、黑皮素4受體(MC4R)、腎上腺素能受體(ADRB)2，3、解偶聯蛋白(UCP)1，2，3、小腸脂酸結合蛋白2(FABP2)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、過氧化質體增殖激活受體γ(PPARγ)在不同位點上的多態性即點突變與肥胖及其相關疾病的發生存在密切的關係。其中對UCP2(55A/V)、ADRB2(27Q/E)、ADRB3(64W/R)、PPARγ(12P/A)的聯合基因分析有利於預測肥胖的發生。
傳統的對於基因SNP的分析方法包括限制性片段長度多態性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、單鏈構象多態性分析(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)及DNA測序等等。然而，以上這些方法的工作量大，且無法做到高通量檢測。採用完全匹配(PerfectMatch，PM)和錯配(Mismatch，MM)探針與目的基因直接雜交(DirectlyHybridization，DH)的方法雖然可以做到較高的通量，但存在著較強的背景信號，易產生假陽性結果。寡核苷酸連接分析(Oligonucleotide Ligation，OLA)對於某些基因的檢測同樣存在假陽性的問題。由於上述方法對於高通量檢測基因SNP均存在著明顯的弊端，兩種新的方法被提出。它們是單鹼基延伸(Single-Base Chain Extension，SBCE)和特異位點引物延伸(Allele-SpecificPrimer Extension，ASPE)。在綜合考慮檢測成本和工作量等因素後，近來的研究發現，較SBCE而言，ASPE是一種更加經濟簡便，適用於大規模高通量的基因分析方法。ASPE的檢測原理是設計一條終止於基因SNP位點的引物，在特定標記的核苷酸和一定的DNA聚合酶存在的條件下對靶基因進行擴增。當引物3』端與靶基因SNP位點不匹配時，該DAN聚合酶無法擴增目的基因，只有當引物3』端與靶基因SNP位點完全匹配時，引物才能進一步延伸，同時特定標記的核苷酸參入到新合成的目的基因中。通過檢測新合成目的基因的信號，獲得靶基因SNP位點的信息。
要做到高通量的檢測，需要一個良好的技術平臺。生物晶片技術是基於生物大分子(核酸、蛋白質等)相互作用的大規模並行分析方法，已成為當今生命科學研究領域發展最快的技術之一。液相寡核苷酸晶片是檢測寡核苷酸之間相互作用的生物晶片，它是基於互補寡核苷酸特異性結合的原理，將多種寡核苷酸結合在液相微珠上，從而使傳統的生物學分析手段能夠在極小的範圍內快速完成，達到一次實驗同時分析多個生物標本或檢測多種疾病的目的。與固相寡核苷酸晶片相比，液相寡核苷酸晶片具有製備簡單、反應快易控制且結果判定準確等明顯優勢。
在本實用新型提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本實用新型的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求1.一種用於檢測肥胖相關基因單核苷酸多態性的試劑盒，其特徵在於，它包括
(a)一個容器a，以及裝於所述容器中的用於檢測肥胖相關基因單核苷酸多態性的寡核苷酸晶片，其中所述的晶片包括
2-10000種球形的固相載體，所述的固相載體分別帶有不同的螢光標記，從而可以互相區分，並且每一種固相載體的數量為103-107個；
並且在每一種固相載體上，連接有單鏈寡核苷酸分子，所述的單鏈寡核苷酸分子特異性地結合於一種肥胖相關基因。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，它還包括選自下組的組件
(b)一個引物容器b，以及位於位於所述引物容器中的寡核苷酸引物混合物，所述寡核苷酸引物用於擴增肥胖相關基因；
(c)一個聚合酶容器c，以及位於所述聚合酶容器中的DNA聚合酶；
(d)一個等位基因特異性引物容器d，以及位於所述容器的等位基因特異性寡核苷酸引物混合物。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括
(e)裝於容器e內的標記的核苷酸；
(f)容器f，和裝於容器f內的用於特異位點引物延伸(ASPE)反應的DNA聚合酶；
(g)容器g，和裝於容器g內的雜交液；
(h)容器h，和裝於容器h內的雜交後洗液；
(i)容器i，和裝於容器i內的能與標記的核苷酸結合的螢光染料；
(j)陽性對照和陰性對照。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，球形固相載體的直徑為1-100微米。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，裝於容器b內的引物是擴增肥胖相關基因UCP2基因、ADRB2基因、ADRB3基因、和PPARγ基因的引物。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測肥胖相關基因SNP的寡核苷酸晶片及試劑盒，所述的晶片包括2－10000種球形的固相載體，所述的固相載體分別帶有不同的螢光標記，從而可以互相區分，並且每一種固相載體的數量為103－107個；並且在每一種固相載體上，連接有單鏈寡核苷酸分子，所述的寡核苷酸分子特異性地結合於肥胖相關基因。本實用新型的晶片和試劑盒可快速靈敏地同時檢測多個與肥胖相關基因的SNP。
文檔編號C12Q1/68GK2918435SQ2005200424
公開日2007年7月4日 申請日期2005年6月15日 優先權日2005年6月15日
發明者張慶華, 夏明燦, 趙芹, 宋凱, 尚淵 申請人:上海生物晶片有限公司