一種仿刺參AjE101微衛星DNA標記的檢測方法
2023-05-08 22:08:56 1
專利名稱：一種仿刺參AjE101微衛星DNA標記的檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學DNA標記技術與應用領域，具體涉及海洋經濟種仿刺參 (Apostichopus japonicus)的EST (Express Sequence Tag，表達序列標籤)微衛星標記 篩選開發和應用。
背景技術：
仿刺參為刺參科仿刺參屬的動物，俗名刺參。分布於北太平洋區、包括俄羅斯、日 本、朝鮮半島沿岸以及中國，常見于波流靜穩、海草繁茂和無淡水注入的港灣內底質為巖礁 或硬底。仿刺參是食用海參中品質最好，分布最廣，產量最大的一種。在我國，仿刺參養殖 業主要分布於遼寧、河北、山東、江蘇等地等沿海地區。目前，仿刺參的研究大多是關於仿 刺參常規育種、增養殖等領域，關於分子標記方面的研究比較少。開發遺傳標記並用於遺 傳圖譜構建、品種鑑定、遺傳多樣性等方面的研究無疑是解決仿刺參養殖過程中出現問題 的一個有效途徑之一。隨著仿刺參在分子生物學領域的研究工作不斷深入，對仿刺參分子標記的需求也 越來越多。遺傳改良或品種培育是仿刺參養殖穩定發展的動力，許多研究表明，遺傳變異水 平與生物的生長速度、抗病能力等生產性狀密切相關，因此，開發仿刺參的分子遺傳標記， 檢測仿刺參遺傳多樣性、研究其遺傳結構，進而實施分子標記輔助選育，對於仿刺參的育種 和增養殖都具有十分重要的意義。EST是指通過從cDNA文庫中隨機挑取的克隆，進行大規模測序所獲得的cDNA的 5』或3』端序列，長度一般為150-500 bp。近年來大量快速增長的EST數據已成為SSR的重 要來源，約有- 5%的EST含有SSR。與gSSR (基因組微衛星)標記相比，從EST序列中 中獲得EST-SSR標記更經濟，更有特點；由於EST是功能基因的表達片段，在其中發現的微 衛星標記會直接和功能基因相關，並有可能和一些生產性狀相關聯，這些特點對遺傳圖譜 構建以及標記輔助選育都有很高的應用價值；同時，由於不同物種間基因共顯性和保守性， 從一種物種中開發的EST-SSR可能同時用於近緣的其他物種研究，從而為比較基因組學、 同源基因克隆提供新的途徑。因此，EST-SSR已被用於構建遺傳圖譜、分離與鑑定新基因、 基因表達差異研究、比較基因組研究和製備DNA晶片等方面。利用EST微衛星標記，可能把 仿刺參重要經濟性狀與之關聯起來，達到分子標記輔助育種的目的，並可進一步進行仿刺 參功能基因的研究。目前關於仿刺參EST微衛星標記的研究還很少。
發明內容
本發明的目的是為了簡便快速的鑑定仿刺參AjElOl遺傳標記基因座位的遺傳變 異圖譜，豐富現有的仿刺參微衛星標記，尋找更多的多態性好、穩定性高的微衛星標記，提 供了一種仿刺參AjElOl微衛星DNA標記的檢測方法。本發明是通過以下方案實現的
一種仿刺參AjElOl微衛星特異性DNA引物，其特徵在於其核苷酸序列分別如SEQ IDNO :1 和 SEQ ID NO 2 所示。一種利用仿刺參AjElOl微衛星特異性DNA引物的PCR反應體系，其特徵在於所 述的 PCR 體系為10XPCR 緩衝液2. Ομ ;10mM 的 SEQ ID N0:1 禾Π SEQ ID NO :2 引物對 各:0. 2-0. 5 μ 1 ； IOmM dNTP :0. 4-5 μ 1 ；ddH20 :14. 6-15. 9 μ 1 ；5U/y 1 Taq酶:0. 2-0. 3 μ 1 ； IOng 仿刺參 DNA :1-1. 5 μ 1。一種仿刺參AjElOl微衛星DNA標記的檢測方法，其特徵在於包括以下步驟先 提取仿刺參基因組並稀釋備用，再利用仿刺參AjElOl微衛星DNA核心序列(AT) η其中 η=22-24，在其序列兩端設計特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1_2所示；然後使用 該引物對仿刺參不同群體或者群體內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變 性聚丙烯醯胺凝膠檢測。利用產物出現的條帶銀染顯色後進行分析，確定每個個體的基因 型，從而獲得仿刺參在AjElOl遺傳標記基因座位的多態性遺傳變異圖譜(如圖1所示)。AjElOl微衛星DNA序列的特異性引物核苷酸序列分別為正鏈SEQ ID NO 1 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，負鏈 SEQ ID NO 2 5，-ATGACAAGAAACGGGAGA-3，，退火溫度 為 49-55 0C ο其PCR反應加樣參數正反向引物各為0. 2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 1.5-2.5 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶，50-100 ng DNA模板，用雙蒸水補足到20ul ；使用該引物 的時設置PCR程序參數為94°C預變性2分鐘；然後94°C變性30-40秒，45°C _60°C退火30 秒，72°C延伸30秒-1分鐘，重複此反應35個循環。PCR產物的檢測基因組DNA模板進行PCR擴增，其產物在聚丙烯醯胺凝膠上電 泳，利用長度差異為50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker (上海生工)作為分子量標記， 擴增產物用6%-8%變性聚丙烯醯胺凝膠電泳統進行檢測，電壓是8V/cm PCR產物中加上變 性Buffer之後95°C變性5分鐘，之後立刻置於冰上降溫，使用微量進樣器上樣5ul，85 W 恆功率電泳至溴酚蘭帶至膠板的底端，約120分鐘，電泳完畢之後用EB(終濃度是0. 5μ g/ ml)染色30分鐘，在凝膠成像系統下觀察記錄成像結果，分析多態性，確定各個個體的基因 型，並進一步得到AjElOl遺傳標記基因座位的多態性圖譜。本發明適用於仿刺參種質資源和遺傳多樣性分析，家系鑑定，分子群體遺傳學，遺 傳圖譜的構建，重要經濟性狀的定位，功能基因的研究，進一步用於輔助仿刺參分子遺傳育 種和養殖。現有的仿刺參微衛星標記還不夠豐富，建立仿刺參遺傳連鎖圖譜，物理圖譜，以及 QTL定位需要更多的多態性好、穩定性高的微衛星標記。與現有技術相比，本發明具有以下 優點
(1)本發明可以簡便快速的鑑定仿刺參AjElOl微衛星遺傳標記基因座位的遺傳變異 圖譜，方法簡便，所得結果可直觀的檢測出仿刺參每個個體的基因型。(2)本發明的核心是AjElOl微衛星DNA標記的特異性引物，其核苷酸序列為正 鏈 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，負鏈 5，-ATGACAAGAAACGGGAGA-3，，退火溫度為 49°C，可在 仿刺參總群檢測中呈現高度遺傳變異的多態性。(3)本發明主要應用於仿刺參種質資源和遺傳多樣性分析，家系鑑定，分子群體遺 傳學，遺傳圖譜的構建，重要經濟性狀的定位，功能基因的研究。
圖1本發明的AjElOl微衛星DNA標記在M尾仿刺參個體中的基因型圖譜。
具體實施例方式實施例1
1. 提取仿刺參的DNA
本實驗所取的仿刺參材料是隨機提取M個DNA樣品，從冷凍的肌肉組織中提取DNA。剪 取IOOmg肌肉組織，剪碎後置於0. 7 ml的抽提緩衝液(6 M toea (尿素)，10 mM Tris-HCI. 125 mM NaCI (氯化鈉)，1% SDS (十二烷基肌硫酸鈉)，10 mM EDTA (乙二胺四乙酸)，pH=7. 5) 中，加入終濃度為0.1 mg/ml的蛋白酶K (20 mg/ml)，37°C消化一夜。用苯酚氯仿(1 1)抽提反應物三次，提取上清液用等體積的氯仿抽提一次。取上清液用異丙醇進行沉澱， 然後溶解於 500 1 μ IXTE (10 mM Tris. HCI, 1 mM EDTA, pH =8.0)中。用 RNase (20 μ g/ml) 37°C處理DNA樣品1小時，然後用苯酚/氯仿提取液進行DNA純化用苯酚/氯仿抽 提一次、氯仿抽提一次。然後提取上清液加入兩倍體積的無水乙醇和十分之一倍體積的3M NaAc (醋酸鈉)，搖勻之後12000rpm離心收集DNA，再用70%乙醇洗滌兩次，待乙醇完全 蒸發之後，加入50 μ 1 IXTE於一 20°C保存待用。2. PCR 擴增
PCR的反應條件是50ng仿刺參基因組DNA，引物SEQ ID N0:1和SEQ ID NO 2各 1μ M、0. 2mMdNTP、lXPCR buffer、1. 5mM 的 Mg2 +、0· 5UTaq 酶。PCR 的反應程序是 94°C變 性10分鐘之後進入循環，94°C變性30秒，Tm50°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，反應進行35 個循環。4°C保存PCR產物。3. 電泳檢測
PCR擴增產物用8%的聚丙烯醯胺凝膠電泳，電壓是8V/cm，電泳完畢之後用EB (終濃 度是0. 5 μ g/ml)染色30分鐘，在凝膠成像系統下觀察記錄成像結果(如圖1所示)。該試驗結果說明AjElOl是一個多態性豐富的標記可以用於群體遺傳學的分析， 並且特異性很好。實施例2
微衛星位點的篩選及其多態標記的確定 1. 微衛星位點的來源和微衛星序列的篩選
從NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)資料庫搜集並下載(以FASTA格式)已有的 EST序列，利用SSmumter軟體逐一查找分析所得的5736個序列，對2 — 6個鹼基重複單 元、重複次數大於5的微衛星DNA序列進行分離。採用軟體DNAstar中的kqMan對含有微 衛星的ESTs進行聚類分析，選取聚類在不同contig中的ESTs設計引物。2. 微衛星標記引物的設計
在微衛星重複的側翼序列利用引物設計軟體I^rimer Premier 5. 0和DNAstar中的 Primerselect設計引物；引物要求滿足以下條件(1)引物長度為17 — 25bp ;(2)GC含量 要求大於40%; (3)退火溫度大於40°C; (4)預期的PCR產物長度為100 — 300bp。設計的 引物為正鏈 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，負鏈 5' -ATGACAAGAAACGGGAGA-3，。3. 引物的優化對AjElOl Tm值進行優化(50°C)。擴增反應分別用MJ-100 PCR儀，PCR程序為94°C 變性2分鐘之後進入循環，94°C變性30或者40秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒到1分 鐘不等，反應進行35個循環。反應體系為20 μ 1 其中含有正反向引物0.2 μ M、0. 2mMdNTP (四種脫氧核苷酸的混合物)、1 XPCR buffer、1.5 mM的Mg2 +、0. 6UTaq酶，模板量分別是 50ng。模板是隨機的5個仿刺參樣本。擴增得到的產物用8%的聚丙烯醯胺凝膠電泳一銀 染檢測，選取無或雜帶少、特異性產物較高的PCR對應的溫度作為最佳的退火溫度，對應的 最佳Mg2+的濃度是2. OmM。10XPCR buffer 含有 100 mM Tris-HCL (三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸 pH9. 0)，500 mM KCL (氯化鉀 ρΗ9· 0)，1% Triton X-100 (曲拉通 X-100)
4. 微衛星位點的確定
AjElOl用50°C和Mg2+ 2. OmM選取20個個體檢測這些微衛星標記的多態性。PCR的反 應程序是94°C變性10分鐘之後進入循環，94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒， 反應進行35個循環。反應體系為20 μ 1 其中含有正反向引物0. 2 μ Μ、0· 2mMdNTP、1 XPCR buffer、1. 5mM的Mg2 +、Taq酶，模板量分別是lOOng。PCR擴增產物用8%的聚丙烯醯胺電 泳，電壓是1 一 8V/cm，電泳完畢之後用EB (溴化乙錠，終濃度0. 5 μ g/ml)染色30分鐘， 然後在凝膠成像系統下觀察記錄成像結果，分析確定多態性，最後篩選出1個位點作為仿 刺參微衛星標記，標記的具體信息如表一。表一.開發獲得的1個仿刺參(Apostichopus japonicus)的EST-SSR標記
權利要求
1.一種仿刺參AjElOl微衛星特異性DNA引物，其特徵在於其核苷酸序列分別如SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 2 所示。
2.一種利用如權利要求1所述DNA引物的PCR反應體系，其特徵在於所述的PCR體系 為10 XPCR 緩衝液2. Ομ ； IOmM 的 SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO 2 引物對各0. 2-0. 5μ1 ； IOmM dNTP :0. 4_5μ1 ；ddH20 :14. 6-15. 9μ1 ；5υ/μ1 Taq 酶0. 2-0. 3μ1 ；IOng 仿刺參 DNA 1-1. 5μ1。
3.一種仿刺參AjElOl微衛星DNA標記的檢測方法，其特徵在於包括以下步驟先 提取仿刺參基因組並稀釋備用，再利用仿刺參AjElOl微衛星DNA核心序列(AT) η其中 η=22-24，在其序列兩端設計特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1_2所示；然後使用 該引物對仿刺參不同群體或者群體內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變 性聚丙烯醯胺凝膠檢測。
4.如權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於其PCR反應加樣參數為正反向引物SEQ ID NO :1-2各為0.2 uM, 0. 2 mM dNTP, IXPCR 緩衝液，1. 5-2. 5 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶， 50-100 ng DNA模板，用雙蒸水補足到20ul ；使用該引物的時設置PCR程序參數為94°C預 變性2分鐘；然後94°C變性30-40秒，45°C -60°C退火30秒，72°C延伸30秒-1分鐘，重複 此反應35個循環。
5.如權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於對PCR產物的檢測基因組DNA模板進行 PCR擴增，其產物在69Γ8%的聚丙烯醯胺凝膠上電泳，乾燥後在掃描保存圖片，分析多態性， 得到各個個體的基因型，並進一步確定AjElOl遺傳標記基因座位的多態性遺傳變異圖譜。
6.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於在PCR產物的檢測中利用長度差異為50 bp的DNA梯型及PBR322標記作為電泳的分子量標記；電泳的電壓為1 一 8V/cm。
7.如權利要求5所述的檢測方法，其特徵在於PCR擴增產物用變性聚丙烯醯胺凝膠電 泳-銀染系統進行檢測PCR產物中加上變性緩衝液之後95°C變性5分鐘，之後立刻置於 冰上降溫，使用微量進樣器上樣5ul，85 W恆功率電泳至溴酚蘭帶至膠板的底端，120分鐘 後，用終濃度0. 5μ g/ml的溴化乙錠染色30分鐘，然後在凝膠成像系統下觀察記錄成像結
全文摘要
本發明屬於分子生物學DNA標記技術與應用領域，具體涉及仿刺參的EST微衛星標記篩選開發和應用。本發明提供了一種仿刺參AjE101微衛星特異性DNA引物，一種利用上述引物的PCR反應體系以及一種仿刺參AjE101微衛星DNA標記的檢測方法，包括先提取凡納濱對蝦基因組並稀釋備用，再利用仿刺參AjE101微衛星DNA核心序列，在其序列兩端設計特異性引物，然後使用該引物對凡納濱對蝦不同群體或者群體內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對產物進行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得仿刺參多態性遺傳變異圖譜。本發明主要應用於仿刺參種質資源和遺傳多樣性分析，分子群體遺傳學，遺傳圖譜的構建，功能基因的研究。
文檔編號C12Q1/68GK102140522SQ20111002833
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月26日 優先權日2011年1月26日
發明者任春華, 夏建軍, 王豔紅, 胡超群 申請人:中國科學院南海海洋研究所