一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝的製作方法

2023-05-08 23:01:21 2

本發明屬於生物發酵領域，具體涉及一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝。
背景技術：
：心力衰竭是一個重大的公共衛生難題，研究顯示：中國35歲以上人群中患病率高達2％，患者約1000萬人，並且每年新增患者50萬例，嚴重威脅我國人民的生命健康安全，隨著人口老齡化，我國的心力衰竭患者數量還將進一步上升。重組人腦利鈉肽(rhbnp，商品名：新活素)，能夠有效治療心力衰竭等病症，快速緩解患者呼吸困難、利尿排鈉、拮抗神經內分泌、抗心臟重塑，對心臟起到全面保護作用，已被《中國心力衰竭診斷和治療指南(2014年版)》載入並推薦使用。現階段，重組人腦利鈉肽主要是通過基因重組技術製備得到，它利用rhbnp基因工程菌發酵培養，然後，分離純化，製劑，最終得到重組人腦利鈉肽產品；其中，發酵工藝是決定重組人腦利鈉肽產量的關鍵步驟之一，它直接影響到融合蛋白表達量的高低，如果蛋白表達量過低，將會導致單位產品的生產成本大幅度增加，從而被認為不具有商業開發價值，進而也就無法實現產業化生產。因此，為了能夠實現重組人腦利鈉肽的產業化生產，降低單位產品的生產成本，首要任務就是開發一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝。本發明提供的一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發酵工藝，它包括以下步驟：在發酵罐中，加入bhd培養基18l～20l和甘油65ml～80ml，以及氨苄青黴素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽基因工程菌300ml～500ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量為30％～50％，調節ph值為6.8～7.2，培養溫度為37℃；當od600為10～15時，加入異丙基硫代半乳糖苷至其終濃度為0.5mmol/l～1.0mmol/l誘導，並向發酵罐內流加150ml/h～300ml/h的補料液a，3h～6h後停止發酵培養，收穫細菌，即可；其中，所述bhd培養基的配方為：每升bhd培養基中，含有胰蛋白腖4g～6g、酵母粉8g～12g、磷酸二氫鉀2g～5g、磷酸氫二鉀10g～15g、硫酸鎂0.4g～1g、氯化鈉0.4g～1g、維生素10mg～15mg和微量金屬元素20mg～30mg，溶劑為水；所述補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白腖150g～200g、酵母粉60g～100g和甘油160ml～220ml，溶劑為水。進一步的，加入bhd培養基18.5l和甘油74ml；或者，加入bhd培養基20l和甘油68ml。進一步的，接種重組人腦利鈉肽基因工程菌400ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量為30％～50％，調節ph值為7.0。進一步的，當od600為12時，加入異丙基硫代半乳糖苷至其終濃度為0.5mmol/l～1.0mmol/l誘導，並向發酵罐內流加200ml/h的補料液a，4h後停止發酵培養。進一步的，所述bhd培養基的配方為：每升bhd培養基中，含有胰蛋白腖5g、酵母粉10g、磷酸二氫鉀2.31g、磷酸氫二鉀12.54g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.6g、維生素13.68mg和微量金屬元素25.8mg，溶劑為水。進一步的，所述維生素選自泛酸、葉酸、吡哆醇中的一種或兩種以上；所述微量金屬元素選自六水三氯化鐵、四水氯化鋅、六水氯化鈣、五水硫酸銅中的一種或兩種以上。進一步的，所述維生素是由以下重量份數的組分組成：泛酸10份～12份、葉酸0.05份～0.1份、吡哆醇2.5份～3份；優選的，所述維生素是由以下重量份數的組分組成：泛酸10.8份、葉酸0.08份、吡哆醇2.8份。進一步的，所述微量金屬元素是由以下重量份數的組分組成：六水三氯化鐵12份～15份、四水氯化鋅2份～5份、六水氯化鈣2份～5份、五水硫酸銅2份～5份；優選的，所述微量金屬元素是由以下重量份數的組分組成：六水三氯化鐵14份、四水氯化鋅4份、六水氯化鈣4份、五水硫酸銅3.8份。進一步的，所述補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白腖172g、酵母粉86g和甘油200ml，溶劑為水。本發明還提供了一種用於重組人腦利鈉肽基因工程菌發酵的bhd培養基，其配方為：每升bhd培養基中，含有胰蛋白腖4g～6g、酵母粉8g～12g、磷酸二氫鉀2g～5g、磷酸氫二鉀10g～15g、硫酸鎂0.4g～1g、氯化鈉0.4g～1g、維生素10mg～15mg和微量金屬元素20mg～30mg，溶劑為水。本發明發酵工藝，採用特定的工藝步驟和工藝條件，以及特定配方的培養基，顯著地提高了rhbnp融合蛋白的表達水平，其表達量高達34.5％～38.3％，具有十分良好的商業開發價值；而且，本發明發酵工藝穩定可靠、重複性好，便於操作和控制，單位產品的生產成本低，已成功應用於重組人腦利鈉肽的產業化生產，累計實現數百萬支注射用重組人腦利鈉肽產品的生產和銷售，取得了商業上的極大成功。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。附圖說明圖1為三批重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌發酵培養後全菌蛋白的sds-page電泳圖譜，其中：m-marker，0-誘導前，1-第一批，2-第二批，3-第三批。具體實施方式本發明具體實施方式中使用的原料、設備等均為已知產品，可以通過購買市售產品等方式獲得，例如：重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌：由西藏諾迪康藥業股份有限公司或成都諾迪康生物製藥有限公司提供，可以通過購買獲得；胰蛋白腖(tryptone)、酵母粉(yeastextract)：為oxoid市售產品。實施例1在發酵罐中，加入bhd培養基18.5l和甘油74ml，以及氨苄青黴素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量(即d.o.值)為50％，加鹽酸或氫氧化鈉調節ph值為7.0，培養溫度為37℃；當od600(是指在600nm波長處的吸光值)為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為0.5mmol/l(mmol/l是指毫摩爾/升)誘導，並向發酵罐內流加200ml/h的補料液a，4h後停止發酵培養，收穫細菌；其中，bhd培養基的配方為：每升bhd培養基中，含有胰蛋白腖(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氫鉀(kh2po4)2.31g、磷酸氫二鉀(k2hpo4)12.54g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)0.6g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白腖(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達情況，結果見圖1和表1。表1、發酵培養後rhbnp融合蛋白表達量批次rhbnp融合蛋白表達量第一批38.3％第二批37.5％第三批37.8％實施例2在發酵罐中，加入bhd培養基20l和甘油68ml，以及氨苄青黴素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量(即d.o.值)為30％，加鹽酸或氫氧化鈉調節ph值為7.0，培養溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為1.0mmol/l誘導，並向發酵罐內流加200ml/h的補料液a，4h後停止發酵培養，收穫細菌；其中，bhd培養基的配方為：每升bhd培養基中，含有胰蛋白腖(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氫鉀(kh2po4)2.31g、磷酸氫二鉀(k2hpo4)12.54g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)0.6g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白腖(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結果為34.5％。實施例3在發酵罐中，加入bhd培養基18.5l和甘油74ml，以及氨苄青黴素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量(即d.o.值)為50％，加鹽酸或氫氧化鈉調節ph值為7.0，培養溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為0.8mmol/l誘導，並向發酵罐內流加200ml/h的補料液a，4h後停止發酵培養，收穫細菌；其中，bhd培養基的配方為：每升bhd培養基中，含有胰蛋白腖(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氫鉀(kh2po4)2.31g、磷酸氫二鉀(k2hpo4)12.54g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)0.6g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白腖(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結果為35.8％。對比例1在發酵罐中，加入lb1培養基18.5l和甘油74ml，以及氨苄青黴素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量(即d.o.值)為70％，加鹽酸或氫氧化鈉調節ph值為6.8，培養溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為1.5mmol/l誘導，並向發酵罐內流加200ml/h的補料液a，4h後停止發酵培養，收穫細菌；其中，lb1培養基的配方為：每升lb1培養基中，含有胰蛋白腖(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)10g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白腖(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結果為25.6％。對比例2在發酵罐中，加入lb1培養基18.5l和葡萄糖92g，以及氨苄青黴素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量(即d.o.值)為25％，加鹽酸或氫氧化鈉調節ph值為6.9，培養溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為1.2mmol/l誘導，4h後停止發酵培養，收穫細菌；其中，lb1培養基的配方為：每升lb1培養基中，含有胰蛋白腖(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)10g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；利用凝膠成像系統，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結果為19.2％。對比例3在發酵罐中，加入lb2培養基20l和葡萄糖85g，以及氨苄青黴素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量(即d.o.值)為15％，加鹽酸或氫氧化鈉調節ph值為7.2，培養溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為0.1mmol/l誘導，並向發酵罐內流加100ml/h的補料液b，4h後停止發酵培養，收穫細菌；其中，lb2培養基的配方為：每升lb2培養基中，含有胰蛋白腖(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)10g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)，溶劑為水；補料液b的配方為：每升補料液b中，含有胰蛋白腖(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和葡萄糖250g，溶劑為水；利用凝膠成像系統，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結果為22.5％。對比例4在發酵罐中，加入m9ca培養基18.5l和甘油70ml，以及氨苄青黴素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調節通氣量使發酵液中的溶氧量(即d.o.值)為10％，加鹽酸或氫氧化鈉調節ph值為6.9，培養溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為1.5mmol/l誘導，並向發酵罐內流加180ml/h的補料液a，4h後停止發酵培養，收穫細菌；其中，m9ca培養基的配方為：每升m9ca培養基中，含有m9鹽溶液(5×，ph＝7.4)200ml、酪蛋白胺基酸(casaminoacid)2g、葡萄糖5g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白腖(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結果為14.7％。上述結果表明，本發明發酵工藝，採用特定的工藝步驟和工藝條件，以及特定配方的培養基，顯著地提高了rhbnp融合蛋白的表達水平，其表達量高達34.5％～38.3％，具有十分良好的商業開發價值；而且，本發明發酵工藝穩定可靠、重複性好，便於操作和控制，單位產品的生產成本低，已成功應用於重組人腦利鈉肽的產業化生產，累計實現數百萬支注射用重組人腦利鈉肽產品(商品名：新活素)的生產和銷售，取得了商業上的極大成功。當前第1頁12