氨基化矽膠協同hsccc提取醬油渣中大豆異黃酮的方法
2023-05-09 07:59:01 1
氨基化矽膠協同hsccc提取醬油渣中大豆異黃酮的方法
【專利摘要】本發明公開了氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法。該方法將醬油渣提取物經MPLC純化，洗脫；將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水放置，分離上相與下相；以上相作為固定相，下相為流動相，製得分離樣品溶液；在無水乙醇‐蒸餾水中加入正矽酸酯，調節pH值，反應，加入γ‐氨丙基三乙氧基矽烷，靜置陳化，製得γ‐氨丙基矽膠微球；將上相作為固定相，下相為流動相泵入高速逆流色譜儀，注入加有γ‐氨丙基矽膠微球的上相與下相的混合液，進行高速逆流色譜分離，得大豆異黃酮。本發明利用逆流色譜的液液分配及其矽膠微球改性基團吸附的協同作用，改善強極性天然產物的分離效果，有效解決高速逆流色譜中強極性物質分離的難題。
【專利說明】氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及大豆異黃酮，特別是涉及一種氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，屬於農副產品深加工及食品工業【技術領域】。
【背景技術】
[0002]醬油渣是醬油生產的副產品，生產過程有大量醬油渣生成。目前對其開發利用有限，主要用作飼料或肥料的配料，附加值低，對其有效成分的提取分離及高值化利用是醬油渣開發利用的一個重要方向。因此，提取分離出有藥用價值的大豆異黃酮，對醬油渣循環利用的研究將具有重要的意義。即使在製取醬油後的豆渣仍含有豐富的大豆異黃酮成分，大豆異黃酮是大豆中的一種天然植物雌激素，具有多種生物學作用，與人體健康密切相關，除具有抗腫瘤作用外，還對衰老、心血管疾病、骨質疏鬆症及更年期綜合症具有預防和治療作用。因此，為了利用醬油渣資源，提取分離出有藥用價值的大豆異黃酮，對醬油渣循環利用的研究將具有重要的意義。
[0003]中壓色譜(MPLC)相對於常壓色譜來說，分離效率更高；比高壓製備色譜來的經濟，儀器要求配置低；使用預裝柱，可以提高效率。主要用於大量的複雜有機混合物、組合化學、新藥開發或天然產物研究過程中的分離和純化，具有速度快、省溶劑、分離量大和重複性好等特點。
[0004]高速逆流色譜(HSCCC)是20世紀80年代發展起來的一種連續高效的液-液分配色譜分離技術。其原理是螺旋管分離柱在做行星式運動時產生的變化離心力場將一部分固定相永久的保留在螺旋管中，使兩相溶劑在分離柱中呈單向性分布，形成單相流體動力平衡體系。流動相與固定相反覆接觸，溶質被兩相多次萃取、分配，最終按照分配係數的不同，實現分離。其不僅使樣品能夠全部回收，回收的樣品更能反映其本來的特性，特別適用於天然生物活性成分的分離。
[0005]現時對大豆異黃酮進行提取，主要是以加熱回流提取為主，但加熱回流提取對熱不穩定成分不適用，溫度過高導致部分黃酮類化合物分解；在放大到工業生產時超聲提取效果較差。高速逆流色譜技術在分離一些簡單體系和中、低極性樣品體系方面存在其它分離技術無可超越的優勢，但對於強極性的物質分離效果卻受到溶劑體系的制約。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是克服現有技術存在的問題，提供一種氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法。
[0007]本發明利用逆流色譜的液液分配及其矽膠微球改性基團吸附分離的協同作用，來改善逆流色譜的分離效果，提高分離效率。本發明在高效逆流色譜分離天然產物的過程中加入Y -氨丙基矽膠微球，利用HSCCC溶劑系統和矽膠微球的協同作用，來改善天然產物的分離效果。本發明通過把強極性的氨基鍵合到矽膠微球的表面，可解決強極性物質的分離問題，而親水作用色譜可滿足這種分離的需要；本發明將逆流色譜柱中引入Y -氨丙基矽膠微球，利用逆流色譜的液液分配及其矽膠微球改性基團吸附的協同作用，來改善強極性天然產物的分離效果；本發明在不改變逆流色譜儀器的基礎上，借鑑高效液相色譜的研究思路，將逆流色譜液液分配原理與Y -氨丙基矽膠微球的吸附分離功能有機的結合起來，在逆流色譜柱中填入Y -氨丙基矽膠微球並對其進行改性，引入功能化基團，利用逆流色譜的液液分配及其矽膠微球改性基團吸附分離的協同作用，來改善逆流色譜的分離效果，提高分離效率。
[0008]本發明為了實現上述目的，採用如下技術方案:
[0009]一種氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，包括以下步驟:
[0010](1)粗提物的製備:將醬油渣提取物經MPLC純化，以乙醇-蒸餾水為洗脫液，流速為15 - 25ml/min進行梯度洗脫，然後將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存；
[0011](2)樣品溶液的製備:將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入到分液漏鬥中，充分震蕩後放置12 - 24小時，將上相與下相分離；按體積份數計，正己烷為100份，乙酸乙酯為150 - 200份，甲醇為150 - 250份，水為150 - 200份；以上相作為固定相，下相為流動相；將100體積份上相與80 -130份下相混合，每毫升上相與下相的混合物中溶解大豆異黃酮粗提物3 - 15毫克，製得分離樣品溶液；
[0012](3) Y -氨丙基矽膠微球的製備:按體積份數計，在100 -120份無水乙醇-蒸餾水中加入13- 15份正矽酸酯，調節pH值到7-9，反應0.5- 1.0h後，再加入2 - 3份Y -氨丙基三乙氧基矽烷，靜置陳化24 - 48h，製得Y -氨丙基矽膠微球；無水乙醇與蒸餾水的體積比為3:5 - 3:7 ；
[0013](4)高速逆流分離:將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀，將高速逆流色譜儀的多層膠管柱充滿；當高速逆流色譜儀穩定運行時，將下相為流動相，將流動相泵入到多層膠管前端；當有15 - 25ml的固定相被推出的時候,注入1- 3ml加有、-氨丙基矽膠微球的上相與下相的混合液，且每毫升上相與下相的混合物中加入Y -氨丙基矽膠微球100 -300毫克；當有流動相從多層膠管尾端流出時，將5 - 15ml樣品溶液從進樣口注入，再補充注入10 - 20ml固定相，進行高速逆流色譜分離，得大豆異黃酮。
[0014]為進一步實現本發明目的，優選地，所述梯度洗脫是在前15min內，以純水進行洗脫；15 - 30min內，洗脫液為20%乙醇-80%水；30 - 45min內，洗脫液為40%乙醇-60%水；45 - 60min內，洗脫液為60%乙醇-40%水；60 - 75min內，以80%乙醇-20%水進行洗脫；75 -90min內，以95%乙醇-5%水進行洗脫；然後將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存；
[0015]所述將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀是以8.5 - 10.5ml/min的流速將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀。所述將流動相泵入到多層膠管前端是將流動相以1.2 - 1.8ml/min的流速泵入到多層膠管前端。所述穩定運行的速度優選為600 - 800rpm。
[0016]用紫外檢測器在254nm波長持續檢測高速逆流色譜分離的流出物，得到醬油渣提取物的HSCCC色譜圖，根據譜圖中不同峰的出峰時間，收集每個峰的流出物，得大豆異黃酮。
[0017]與已有技術相比，本發明具有如下有益效果:
[0018](1)本發明不用任何固態載體的液、液色譜技術，分離效率高，產品純度高。[0019](2)本發明不存在載體對樣品的吸附和汙染，製備量大和溶劑消耗少。
[0020](3)本發明顯著提高了醬油渣的附加值，有利於醬油渣的綜合開發利用。
[0021](4)本發明也適用於其他中高極性天然產物的提取，對極性樣品的吸附作用更顯著。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1A、1B、1C、1D為對比實施例和實施例1中Y -氨丙基矽膠微球加入量分別為0mg、200mg、400mg和600mg的醬油渣提取物的HSCCC色譜圖。
[0023]圖2A、2B為實施例2流速分別為1.2mL/min和1.8mL/min時醬油渣提取物的HSCCC
色譜圖。
[0024]圖3A、3B、3C為實施例進樣量分別為50mg、150mg和200mg的HSCCC色譜圖。【具體實施方式】
[0025]以下結合具體實施例來對本發明作進一步說明，但本發明所要求保護的範圍並不局限於實施例所表述的範圍。
[0026]以高速逆流色譜法提取醬油渣中大豆異黃酮的方法為對比實施例。
[0027]對比實施例
`[0028]將醬油渣提取物經中壓色譜(MPLC)純化，以乙醇-蒸餾水為洗脫液，流速為20ml/min進行梯度洗脫。O - 15min時，以100%水進行洗脫；15 - 30min時，洗脫液為20%乙醇，80%水；30 -45min時，洗脫液為40%乙醇，60%水；45 -60min時，洗脫液為60%乙醇，40%水；60 - 75min時，以80%乙醇，20%水進行洗脫；75 - 90min時，以95%乙醇，5%水進行洗脫。以波長254nm檢測目標物大豆異黃酮。然後將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存；
[0029]將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按體積比1:2:2:1.8加入到分液漏鬥中，充分震蕩後放置一晚，將上相與下相分離，以上相作為固定性，下相為流動相。每毫升上相與下相(體積比為1:1)的混合物中溶解粗提物5毫克，製得分離樣品溶液。
[0030]將上相作為固定相以9.9ml/min通過輸液泵輸入高速逆流色譜儀，將多層膠管中充滿。將儀器以700rpm的速度穩定運行，使儀器內形成單向流體動力體系，將下相為流動相以1.2ml/min的流速泵入到多層膠管前端，達到單向流體動力平衡狀態。當有流動相從尾端流出時，將2ml分離樣品溶液(每毫升上相與下相混合物中溶解50mg樣品)從進樣口注入，繼續用流動相進行洗脫。用紫外檢測器在254nm持續檢測膠管尾部的流出物，如圖1A所示，根據譜圖中不同峰的出峰時間，從出峰時間初到出峰時間末手動收集每個峰的流出物，然後經高效液相鑑定純度。以甲醇一 0.1%乙酸水作為流動相，流動相的流速為0.8mL/min,進行二元線性梯度洗脫(甲醇:10 - 20min, 45 - 65%; 20 - 50min, 65%; 20 - 25min, 65 - 75%)，以波長254nm檢測目標物大豆異黃酮。最後用量筒測得相應的保留值。
[0031]實施例1
[0032]將醬油渣提取物經MPLC純化，以乙醇-蒸餾水為洗脫液，流速為20ml/min進行梯度洗脫。O -15min時，以100%水進行洗脫；15 -30min時，按體積計，洗脫液為20%乙醇，80%水；30 - 45min時，按體積計，洗脫液為40%乙醇，60%水；45 - 60min時，按體積計，洗脫液為60%乙醇，40%水；60 - 75min時，按體積計，以80%乙醇，20%水進行洗脫；75 - 90min時，以
95%乙醇，5%水進行洗脫。以波長254nm檢測目標物大豆異黃酮。然後將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存；
[0033]將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按體積比1:2:2:1.8加入到分液漏鬥中，充分震蕩後放置一晚，將上相與下相分離；每毫升上相與下相(體積比為1:1)的混合物中溶解粗提物5毫克，製得分離樣品溶液；
[0034]加入100ml無水乙醇/蒸餾水(ν: v=3:7)，再加入15ml正矽酸酯，調節pH值到9。反應0.5h後，再加入3ml Y -氨丙基三乙氧基矽烷，靜置陳化24h，製得Y -氨丙基矽膠微球。
[0035]高速逆流色譜技術是一種無固體載體的連續高效的液液分配色譜分離技術，採用多層纏繞的螺旋膠管柱，由柱體的高速行星式運動產生的不對稱離心力場實現兩相溶劑體系的高效混合、分配及充分保留，形成連續流萃取，從而實現不同溶解分配係數的溶質在兩相溶劑中的高效分離。以9.8ml/min的流速將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀，將多層膠管柱充滿；當儀器以700rpm的速度穩定運行時，將下相為流動相以1.2ml/min的流速泵入到高速逆流色譜儀中的多層膠管前端；觀察到有20ml的固定相被推出的時候(已經充滿)，通過六通閥注入2ml Y -氨丙基矽膠微球的上下相混合液；當有流動相從多層膠管尾端流出時，將IOml分離樣品溶液從進樣口注入，緊隨其後再補充注入15ml固定相，進行高速逆流色譜分離；用紫外檢測器在254nm波長持續檢測流出物，根據如下不同的、-氨丙基矽膠微球的加入量(圖1A表示的情況未加入Y -氨丙基矽膠微球)，分別得到圖1B、1C、ID為所示的Y -氨丙基矽膠微球加入量分別為200mg、400mg和600mg的醬油渣提取物的HSCCC色譜圖。根據圖1A、1B、1C、1D中峰I和峰II的出峰時間，手動分別收集每個峰的流出物，得到溶於流動相的大豆異黃酮，然後經高效液相色譜鑑定純度，根據大豆異黃酮的標準物質的HPLC測定結果比對，表明峰I為大豆苷元，峰II為染料木素(統稱為大豆異黃酮)。最後用量筒測得相應的保留值。檢測結果如表1所示，表1中加入的Y -氨丙基矽膠微球的量為200mg，400mg，600mg，即每毫升上相與下相(體積比為1:1)的混合物中加入Y -氨丙基矽膠微球100，200，300毫克。對比實施例未加入-氨丙基矽膠微球。
[0036]表1不同量的Y -氨丙基矽膠微球對HSCCC分離參數影響
【權利要求】
1.氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特徵在於包括以下步驟:(1)粗提物的製備:將醬油渣提取物經MPLC純化，以乙醇-蒸餾水為洗脫液，流速為15 - 25ml/min進行梯度洗脫，然後將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存； (2)樣品溶液的製備:將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入到分液漏鬥中，充分震蕩後放置12 - 24小時，將上相與下相分離；按體積份數計，正己烷為100份，乙酸乙酯為150 - 200份，甲醇為150 - 250份，水為150 - 200份；以上相作為固定相，下相為流動相；將100體積份上相與80 -130份下相混合，每毫升上相與下相的混合物中溶解大豆異黃酮粗提物3-15毫克，製得分離樣品溶液； (3)Y -氨丙基矽膠微球的製備:按體積份數計，在100 - 120份無水乙醇-蒸餾水中加入13- 15份正矽酸酯，調節pH值到7-9，反應0.5- 1.0h後，再加入2 - 3份Y -氨丙基三乙氧基矽烷，靜置陳化24 - 48h，製得Y -氨丙基矽膠微球；無水乙醇與蒸餾水的體積比為 3:5 - 3:7 ; (4)高速逆流分離:將上 相作為固定相泵入高速逆流色譜儀，將高速逆流色譜儀的多層膠管柱充滿；當高速逆流色譜儀穩定運行時，將下相為流動相，將流動相泵入到多層膠管前端；當有15 - 25ml的固定相被推出的時候,注入1- 3ml加有、-氨丙基矽膠微球的上相與下相的混合液，且每毫升上相與下相的混合物中加入Y -氨丙基矽膠微球100 - 300毫克；當有流動相從多層膠管尾端流出時，將5 - 15ml樣品溶液從進樣口注入，再補充注入10 - 20ml固定相，進行高速逆流色譜分離，得大豆異黃酮。
2.根據權利要求1所述的氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特徵在於:所述梯度洗脫是在前15min內，以純水進行洗脫；15 - 30min內，洗脫液為20%乙醇-80%水；30 - 45min內，洗脫液為40%乙醇-60%水；45 - 60min內，洗脫液為60%乙醇-40%水；60 - 75min內，以80%乙醇-20%水進行洗脫；75 - 90min內，以95%乙醇-5%水進行洗脫；然後將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存。
3.根據權利要求1所述的氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特徵在於:所述將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀是以8.5 - 10.5ml/min的流速將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀。
4.根據權利要求1所述的氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特徵在於:所述穩定運行的速度為600 - 800rpm。
5.根據權利要求1所述的氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特徵在於:所述將流動相泵入到多層膠管前端是將流動相以1.2 - 1.8ml/min的流速泵入到多層膠管前端。
6.根據權利要求1所述的氨基化矽膠協同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特徵在於:用紫外檢測器在254nm波長持續檢測高速逆流色譜分離的流出物，得到醬油渣提取物的HSCCC色譜圖，根據譜圖中不同峰的出峰時間，收集每個峰的流出物，得大豆異黃酮。
【文檔編號】C07D311/40GK103755674SQ201410013130
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月10日 優先權日:2014年1月10日
【發明者】梁勇, 吳繼明, 楊明泉, 陳穗, 劉佔, 孫麗霞, 樊瑞 申請人:廣東美味鮮調味食品有限公司