在連續細胞培養中產生所關心多肽或病毒的方法

2023-05-09 01:51:26

專利名稱：在連續細胞培養中產生所關心多肽或病毒的方法
技術領域：
本發明涉及在哺乳動物細胞培養物中產生所關心多肽或病毒的連續細胞培養策略。本文所述的連續細胞培養策略合併了恆化器和灌流培養技術的優點。
背景技術：
產生所關心多肽或病毒的能力對於生物技術工業日益重要。過去二十年，生物技術的進步引起了對許多多肽和病毒的關注，這些多肽和病毒具有作為疫苗和醫藥的潛在治療用途。大規模生產一般涉及例如在細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞或其它細胞類型中重組產生所述所關心多肽或病毒。具體來說，在哺乳動物細胞培養物中產生所關心多肽或病毒優於在細菌或其它低級微生物宿主中的產生，原因在於哺乳動物細胞能夠對複雜的蛋白質結構進行翻譯後加工，例如經由依賴於二硫鍵的摺疊和糖基化作用。哺乳動物細胞在體外一般以兩種模式繁殖作為非錨定依賴性細胞，在培養物的整個本體中自由懸浮生長；或作為錨定依賴性細胞，需要粘附到供其繁殖的固體基質(即， 單層類型的細胞生長)。已經開發出微載體系統來容納兩種類型的生長。例如，錨定依賴性細胞可以在包含小固體顆粒的微載體系統中繁殖，所述小固體顆粒利用緩慢攪動懸浮於生長培養基中。該系統允許錨定依賴性細胞粘附到懸浮顆粒的表面，並生長到匯合，而同時微載體保持懸浮於生長培養基中。或者，可以使用大孔微載體從而在生物反應器中含有非錨定依賴性細胞，例如利用細胞到這些微載體的表面的非特定粘附。非錨定依賴性細胞或錨定依賴性細胞的微載體懸浮培養是大規模生產細胞和細胞產物的最廣泛使用的方式。大規模懸浮培養可以在封閉系統中操作，例如作為分批式(batch)或流加式 (fed-batch)封閉系統，封閉系統比開放系統更方便操作和放大。通常，在封閉系統中，沒有細胞、產物和/或廢物除去(儘管可能利用通風來加入空氣(例如氧氣)和除去CO2)。在分批式生長系統情況下可見的典型生長曲線涉及遲緩期，後面為指數期、穩定期和衰亡期。 在這些分批式系統中，隨著養分耗盡和代謝物積聚，環境連續發生變化。在流加式系統中， 關鍵養分被連續送入系統中從而延長生長周期，儘管細胞、產物、副產物和廢物(包括毒性代謝物)未除去。因此，利用分批式或流加式系統來產生所關心多肽或病毒受到細胞和有害物質諸如毒性代謝物的積聚的限制。大規模懸浮培養也可以在開放系統中操作，例如在灌流系統或恆化器系統中。在灌流系統中，使新鮮培養基灌流穿過培養物，同時利用各種細胞截留裝置截留細胞。細胞截留裝置的類型包括例如微載體、微孔旋轉過濾器、中空纖維、平板膜過濾器、沉降管、超聲波細胞截留裝置等。通常，灌流培養物設計成增加細胞密度到最大值，而細胞截留裝置設計和操作成具有> 90%的細胞截留率。這些培養物通常達到> 2X107的細胞密度，這必須利用稀釋率大於約2. OcT1的細胞培養基進料來供應。然而，由於生物質不受控制的增加，使得系統很難保持穩態，並且難以控制和/或達到一致的生產條件。恆化器系統利用培養基連續流入與細胞和產物的流出來操作。在恆化器系統中， 沒有細胞截留裝置，以致生物反應器中細胞的濃度和從生物反應器收穫的上清液中細胞的濃度大致相同。通常，培養基以預定的恆定速率送入反應器，從而保持培養物的低稀釋率 (通常為0. 3d-1至0. Sd-1)。為防止細胞衝壞，稀釋率一般選擇為小於、有時等於細胞的最大比生長率。含有細胞、細胞產物、副產物、廢物等的培養流體同時除去，或大致同時除去。 恆化器系統通常提供高的控制程度，因為培養物可以在比生長率等於稀釋率下平衡，即，達到穩態。此平衡決定了細胞、代謝物、廢物、表達產物(例如，分泌蛋白)等的濃度。由於至少一種限制性基質，恆化器系統中的比生長率通常低於最大生長率。不過，在一些系統中， 穩態可以通過控制和調整生物質而保持在最大比生長率，例如在恆化器培養的turbidstat 系統中。優選地，這些恆化器培養物含有在整個生物反應器中均勻分布的細胞(例如，單細胞懸浮液)。但是，與灌流系統相比，恆化器系統通常產生較低的細胞密度。此外，恆化器系統的固有缺點在於，細胞的進料不能夠獨立於生物反應器系統中的細胞密度來進行控制。用於在無血清和/或化學成分明確的培養基中產生重組蛋白的懸浮細胞培養也受到限制，因為無血清和/或化學成分明確的培養基與含有血清的培養基中生長的細胞相比，通常支持較慢的生長率。培養物中生長率降低意味著所關心多肽或病毒的產量降低。因此，仍需要開發能夠持續所關心多肽或病毒的產生的細胞培養系統，尤其是能夠長時間持續以便滿足例如低成本下產量增加的需求的培養。本發明提供針對此需要和其它需要的方法和組合物。

發明內容
本文公開了一種用於在哺乳動物細胞、尤其非錨定依賴性細胞中產生所關心多肽和/或病毒的連續細胞培養。本文公開的連續細胞培養方法合併了灌流開放系統和恆化器開放系統的優點，並允許細胞密度和細胞生長的增加，特別是在無血清或化學成分明確的培養基中。細胞密度和細胞生長的增加提高所關心蛋白質和/或病毒的產率，同時允許更好地控制工藝參數。因此，本發明的一個方面涉及用於在連續細胞培養中產生所關心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含在連續細胞培養系統中培養表達所述多肽和/或病毒的哺乳動物細胞，其中細胞培養系統包含細胞截留裝置並且具有小於約2d-1的稀釋率和小於約2X107細胞/mL的細胞密度；和從自細胞培養系統除去的培養基中回收所關心多肽和/或病毒。在一些實施方案中，細胞經過基因修飾以便重組表達所關心多肽和/或病毒。在一些實施方案中，細胞截留裝置選擇為截留細胞的能力低於典型的細胞截留裝置。在一些實施方案中，細胞截留裝置產生的細胞截留率為小於約90%、小於約85%、小於約80%或小於約75%。在一些實施方案中，細胞截留裝置包含大孔微載體，例如基於纖維素的顆粒。稀釋率和細胞密度優選保持在所選值或範圍。在一些實施方案中，稀釋率為小於約Id—1，例如在約0. IcT1與約1. OcT1之間。在一些實施方案中，細胞密度為小於約IXlO7細胞/mL。在一些實施方案中，細胞培養系統的稀釋率和比生長率的比率(D/μ)保持在所選值或範圍。在一些優選實施方案中，細胞培養系統的稀釋率和比生長率的比率為大於約1， 例如在約1. 2與約5. 0之間或在約1. 8與約3之間。在一些實施方案中，比生長率保持在 0. 2(Γ 與 0. 8cT 之間。本文所述的連續細胞培養系統的某些實施方案的優點在於該培養可以持續較長時間。例如，在一些實施方案中，稀釋率和/或細胞密度保持細胞在連續細胞培養系統中培養時間的至少約80%。在一些實施方案中，細胞在細胞培養系統中培養例如大於20天、優選大於40天、更優選大於50天，從而允許在低成本下增加所關心多肽和/或病毒的產量。連續細胞培養系統的某些實施方案的另一優點為較高細胞密度引起的相比於典型恆化器培養的體積生產率的增加。例如，在特定優選實施方案中，體積生產率增加70%、 90%或更高。連續細胞培養系統的某些實施方案的再一優點為例如由於在培養單元中滯留時間降低而引起的所回收蛋白質的比活性提高，這可能會對蛋白質的穩定性、結構和/或功能具有有利影響。本文所述的連續細胞培養系統的某些實施方案的另一優點在於系統可以放大以進行大規模生產。也就是說，通過允許與標準恆化器培養系統相比增加細胞密度和/或細胞生長，本文公開的連續細胞培養系統提供所關心多肽和/或病毒的商業規模生產。例如， 在一些實施方案中，在至少約250L培養基，例如至少約500L或至少約1，000L培養基中培養細胞。在一些優選實施方案中，在無血清培養基和/或化學成分明確的培養基中培養細胞。在一些實施方案中，所述方法進一步包含預培養步驟，例如以便使細胞適應如本文所述的在連續細胞培養系統中所關心多肽和/或病毒的產生。因此，在一些優選實施方案中，所述方法進一步包含在培養步驟之前，懸浮預培養細胞，例如直到培養物達到適當體積。在特定實施方案中，所關心多肽為去整合素樣金屬肽酶含血小板反應蛋白1基元 13(ADAMTS13)蛋白。在一些實施方案中，哺乳動物細胞為CHO細胞，例如經過基因修飾以表達ADAMTS13蛋白的CHO細胞。在特定實施方案中，提供用於在連續細胞培養中產生所關心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含(a)在連續細胞培養系統中培養表達所關心多肽和 /或病毒的非錨定依賴性哺乳動物細胞，其中細胞培養系統包含細胞截留率小於90%的細胞截留裝置，且具有在0. IcT1與1. OcT1之間的稀釋率⑶和小於IXlO7細胞/mL的細胞密度；和(b)從自細胞培養系統除去的培養基中回收所關心多肽和/或病毒。在另一特定實施方案中，提供用於在連續細胞培養中產生所關心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含(a)在連續細胞培養系統中培養表達所關心多肽和/或病毒的非錨定依賴性CHO細胞，其中細胞培養系統包含細胞截留率小於90%的大孔微載體細胞截留裝置，且具有在0. IcT1與1. OcT1之間的稀釋率(D)和小於IXlO7細胞/mL的細胞密度；和(b) 從自細胞培養系統除去的培養基中回收所關心多肽和/或病毒。在再一特定實施方案中，提供用於在連續細胞培養中產生ADAMTS13的方法，所述方法包含(a)在連續細胞培養系統中培養表達重組ADAMTS13蛋白的非錨定依賴性哺乳動物細胞，其中細胞培養系統包含細胞截留率小於90%的大孔微載體細胞截留裝置，且具有在0. IcT1與1. OcT1之間的稀釋率⑶和小於IXlO7細胞/mL的細胞密度；和(b)從自細胞培養系統除去的培養基中回收ADAMTS13。
在又一特定實施方案中，提供用於在連續細胞培養中產生所關心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含(a)在連續細胞培養系統中培養表達所關心多肽和/或病毒的非錨定依賴性哺乳動物細胞，其中細胞培養系統包含細胞截留率小於90 %的細胞截留裝置，且具有在0. IcT1與1. OcT1之間的稀釋率⑶和小於IXlO7細胞/mL的細胞密度，以及在1. 2 與5之間的稀釋率和比生長率的比率(D/μ)；和(b)從自細胞培養系統除去的培養基中回收所關心多肽和/或病毒；且進一步，其中細胞在細胞培養系統中培養大於50天，並且稀釋率、細胞密度以及稀釋率和比生長率的比率各自保持細胞在細胞培養系統中培養時間的至少 80%。本發明的另一方面涉及包含根據本文所述的方法產生的所關心多肽和/或病毒的組合物，例如包含據此產生的重組ADAMTS13蛋白的組合物。下面更詳細地描述本發明的這些和其它方面。
具體實施例方式本文所述的連續細胞培養系統合併了哺乳動物細胞的灌流培養和恆化器培養的一些優點。如上文所述，灌流培養系統利用新鮮培養基灌流穿過細胞培養物來操作，同時使用細胞截留裝置截留細胞；恆化器培養系統利用培養基的連續流入與細胞和產物的流出來操作，沒有細胞截留裝置。本文所用的「灌流」指代生理營養液在穩定速率下的連續流動，穿過或經過細胞群。由於灌流系統一般涉及細胞在培養單元內的截留，所以灌流培養物特有地具有相對高的細胞密度，但培養條件難以保持和控制。另外，因為細胞生長到高密度並接著在高密度下截留在培養單元內，所以生長率通常隨時間連續減小，從而達到細胞生長的指數末期或甚至穩定期。相比之下，本文所用的「恆化器」指代生理營養液的連續流入結合細胞和其它產物隨取出培養基的連續流出，穿過細胞培養物，例如在恆化器系統中。然而，由於細胞被連續除去，使得恆化器系統通常只支持較低細胞密度。本文所述的連續培養策略一般包含在連續細胞培養系統中在生產階段期間培養表達所關心多肽和/或病毒的哺乳動物細胞，例如非錨定依賴性細胞。「非錨定依賴性細胞」表示與繁殖期間粘附於或固定於固體基質相反，在培養物整個本體中自由懸浮繁殖的細胞。連續細胞培養系統將包含與灌流系統中所使用的類似的細胞截留裝置，但其允許連續除去細胞的較大部分，優選使得與灌流培養中相比截留較小百分比的細胞。「細胞截留裝置」表示能夠在細胞培養期間的特定位置上截留細胞、尤其非錨定依賴性細胞的任何結構。 非限制性實例包括可以將非錨定依賴性細胞截留在生物反應器內的微載體、微孔旋轉過濾器、中空纖維、平板膜過濾器、沉降管、超聲波細胞截留裝置等。所關心多肽和/或病毒(例如重組多肽和/或重組病毒)可以從細胞培養系統回收，例如從自細胞培養系統除去的培養基中回收。本文公開的用於產生所關心多肽和/或病毒(例如重組多肽和/或重組病毒)的方法包含提供類似恆化器培養系統並使用細胞截留裝置的細胞培養方法。所述系統包含在具有細胞截留裝置的連續細胞培養系統中培養表達所關心多肽和/或病毒的哺乳動物細胞。細胞截留裝置的作用在於防止用新鮮培養基補充用過的培養基期間從培養物除去一部分、優選較大一部分活細胞。成功的細胞截留裝置應當儘可能多地滿足以下要求(1)極小的細胞損傷或對細胞生長和生產率的影響，( 僅對活細胞的選擇性截留(非活細胞由於釋放毒性代謝物到培養環境中所以優選地從培養物中除去)，(3)長期培植的不間斷操作， (4)低能耗，(5)操作與維護簡便，(6)對於大規模生產單元的放大能力，(7)結構緊湊，和 (8)成本有效性。在特別優選的實施方案中，所用的細胞截留裝置準許細胞的部分截留。細胞截留裝置和/或方法在本領域眾所周知。其中許多以常規的沉積、離心和/或過濾技術為基礎。 細胞截留裝置的非限制性實例包括微載體、旋轉過濾器諸如微孔旋轉過濾器、中空纖維、平板膜過濾器、沉降管、超聲波細胞截留裝置、重力沉降槽、離心機、聲學細胞過濾器、基於介電電泳的細胞分離器等(例如參見美國專利第5，019，512號；第5，626，734號，以引用的方式全部併入本文)。根據本文所述的培養系統的一個實施方案，可以使用微載體作為細胞截留裝置。 微載體可以充當低成本可定標(scalable)表面，非錨定依賴性細胞可以固定在上面以便幫助細胞截留。本文所用的「微載體」指代待用於懸浮培養中的足夠小的顆粒，優選地攪拌速率不會引起對細胞的顯著剪切損傷。微載體可以為實心、多孔的，或者具有實心核心和多孔塗層。微載體可以為，例如但不限於，基於纖維素或葡聚糖的，並且它們的表面(多孔載體情況下的外表面和內表面)可以帶正電。關於微載體的更多細節可見於例如WO 02/29083中，該專利以引用的方式全部併入本文。在一個實施方案中，微載體為大孔微載體。本文所用的「大孔微載體」指代具有以下性質的顆粒，例如基於纖維素的顆粒(a)足夠小以允許用於懸浮培養中，優選地攪拌速率不會引起對細胞的顯著剪切損傷；和(b)具有足夠大小的孔和內部空間以允許細胞遷移到內部空間中。在一個實施方案中它們的表面(外部和內部)可以帶正電。在一個實施方案中，載體(a)具有約150 μ m與約350 μ m之間的總體粒徑；(b)具有平均孔開口直徑在約 15 μ m與約40 μ m之間的孔；和(c)具有約0. 8meq/g與2. Omeq/g之間的正電荷密度。在一些實施方案中，正電荷由DEAE(N，N，_ 二乙氨基乙基)基團提供。有用的大孔微載體包括但不限於 CYTOPORE Its^pcytopore 2 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) 特別有用的大孔微載體為CYTOPORE 2 載體，其平均粒徑為230 μ m,平均孔徑為30 μ m，正電荷密度為1. 8meq/g。在一些實施方案中，攪動培養單元。如本領域中所知，攪動可以包含振蕩、攪拌、搖擺、振動等。在優選實施方案中，利用具有擋板的Rushton型葉輪進行攪動。擋板可以在約 140rpm，對應於近似40W/m3的比功率/體積輸出。在一些實施方案中，比功率/體積輸出大於約40W/m3，例如約50W/m3、約60W/m3、約70W/m3、約80W/m3或更高。根據所使用的特定細胞或培養法適用時，可以使用其它速度。如本文所述的微載體的濃度一般較低，例如以便幫助保持稀釋率和細胞密度在特定範圍內。在一個實施方案中，培養單元可以包含的微載體的量對應於在0. 05-1. Og/L範圍內的微載體終濃度。在一個實施方案中，微載體終濃度為約0. 05-0. lg/L。在一個實施方案中，微載體終濃度為約0. 1-0. 25g/L。在另一實施方案中，微載體終濃度為約0. 25-0. 5g/ L。在另一實施方案中，微載體終濃度為約0. 5-0. 75g/L。在另一實施方案中，微載體終濃度為約0. 75-1. Og/L。在另一實施方案中，載體濃度可以在連續培養期間增加或降低，例如以便調整細胞密度和稀釋率在預定範圍內。
所公開的連續細胞培養系統具有優選的稀釋率(D)和優選的細胞密度。具體來說，稀釋率和細胞密度保持在預定值或預定範圍內。此外，所公開的連續細胞培養系統可以在整個工藝時間內具有極小比生長率或預定範圍的比生長率。稀釋率(D)指代每天供應的培養基體積除以培養物的體積。雖然本文所述的連續細胞培養系統涉及細胞截留，但連續細胞培養系統的稀釋率一般小於灌流培養的稀釋率， 例如小於約2稀釋體積/天OcT1)。在一個實施方案中，稀釋率保持在大於約0. 2CT1至小於約2. OcT1之間。在另一實施方案中，稀釋率保持在小於約2. OcT1，例如小於約1. Scf1，例如小於約1.5CT1，例如小於約1.2CT1等。在另一實施方案中，稀釋率保持在小於約l.Ocf1， 例如小於約0. 9CT1，例如小於約0. 8CT1，例如小於約0. 7CT1，例如小於約0. 6CT1等。在另一實施方案中，稀釋率保持在大於約0. 2CT1，例如大於約0. 3CT1，例如大於約0. 4CT1，例如大於約
0.5(Γ 等。另外，在本文所述的連續細胞培養系統中，細胞密度的值保持在小於灌流培養系統中所保持的值，但高於恆化器系統中所達到的細胞密度。在一個實施方案中，細胞密度小於約2Χ107細胞/mL，例如小於約1. 5X107細胞/mL，例如小於約IXlO7細胞/mL，例如小於約 8X106細胞/mL，例如小於約6X106細胞/mL，例如小於約5X106細胞/mL。在另一實施方案中，細胞密度可以為大於約IXlO6細胞/mL，例如大於約1. 5X106細胞/mL，例如大於約2X106 細胞/mL，例如大於約3X106細胞/mL，例如大於約4X106細胞/mL等。在另一實施方案中， 細胞密度保持在約1.0X106細胞/mL到約2X106細胞/mL之間。在另一實施方案中，細胞密度保持在約2X106細胞/mL到約4X106細胞/mL之間。在另一實施方案中，細胞密度保持在約5X106細胞/mL到約IXlO7細胞/mL之間，例如約6X106細胞/mL到約8X106細胞/mL之間。在另一實施方案中，細胞密度保持在約IXlO7細胞/mL到約2X107細胞/mL之間。所屬領域的技術人員將認識到用以保持細胞密度的機制涉及減少利用細胞截留裝置截留的細胞部分，即降低細胞截留率。一般來說，灌流培養的細胞截留率大於90%或 95%，在許多情況下接近100%。在所公開的連續細胞培養系統中，細胞截留率小於90%。 在一個實施方案中，細胞截留率小於約85 %，例如小於約75 %。在一個實施方案中，細胞截留率小於約70%，例如小於約60%，例如小於約50%，例如小於約40%，例如小於約30%。 在一個實施方案中，細胞截留率保持在約30%與約90%之間。在另一實施方案中，細胞截留率保持在約30 %與約80 %之間。在另一實施方案中，細胞截留率保持在約30 %與約70 % 之間。在另一實施方案中，細胞截留率保持在約40%與約60%之間。在另一實施方案中， 細胞截留率保持在約40%與約70%之間。在另一實施方案中，細胞截留率保持在約50%與約90%之間。在另一實施方案中，細胞截留率保持在約60%與約90%之間。在另一實施方案中，細胞截留率保持在約70%與約90%之間。在另一實施方案中，細胞截留率保持在約 80%與約90%之間。培養物還可以利用稀釋率和比生長率的比率來表徵。比生長率(μ)指代每天每細胞質量的細胞質量增加(相對於總細胞質量):μ = (1化幾))膽)-「-1))；其中Xt 為時間(t)的生物質濃度和Xw為前一時間點的生物質濃度。一般來說，如本文所述的連續培養系統的比生長率應當恆定在預定範圍內，優選在某一極低水平以確保生長相關的多肽和/或病毒表達的極低值。例如，本文所述的連續培養系統的比生長率可以為約o. id—1到約
1.OcT1。在一個實施方案中，本文所述的連續培養系統所保持的比生長率為大於約o. id-1,例如大於約0. 15CT1，例如大於約0. 2CT1，例如大於約0. 25CT1，例如大於約0. 3CT1，例如大於約0. 35(1-1等。在另一實施方案中，本文所述的連續培養系統所保持的比生長率為小於約 1. Ocf1，例如小於約0. 8CT1，例如小於約0. 7CT1，例如小於約0. 6CT1，例如小於約0. 5CT1，例如小於約0. 45CT1。在另一實施方案中，比生長率可以保持在約0. IcT1到約0. 45CT1之間。在一個實施方案中，本文所述的連續培養系統所保持的比生長率在約0. Ιδ -1到約0. 3CT1之間。 在一個實施方案中，本文所述的連續培養系統所保持的比生長率在約0. 2CT1到約0. 25(^2 間。如上文所述，本文公開的連續培養系統保持小於約2X107細胞/mL的細胞密度。如本文所述細胞密度可以得到保持的機制涉及保持稀釋率與比生長率的特定比率。恆化器培養的稀釋率近似等於比生長率，D/μ比率近似為1。灌流培養一般具有較高的絕對稀釋率和非常低的比生長率，故D/μ比率顯著大於1。但在本文公開的連續培養系統中，優選保持稀釋率稍高於比生長率。因此，在本文公開的連續培養中，保持大於1的D/μ比率。在特別優選的實施方案中，依據截留裝置的效率計算和設定稀釋率以便保持比生長率在預定範圍內。在一個實施方案中，稀釋率與比生長率的比率為大於約1. 0，例如大於約1. 2，例如大於約1. 5，例如大於約2，例如大於約2. 5。在另一實施方案中，稀釋率與比生長率的比率為小於約5，例如小於約4，例如小於約3。在一個實施方案中，D/μ比率在約1.2與約5之間。在另一實施方案中，稀釋率與比生長率的比率在約1.8與約3之間。在另一實施方案中，稀釋率與比生長率的比率在約2. 0與約2. 5之間。本發明的方法可以在適當的培養單元或生物反應器中進行。生物反應器可以具有任何尺寸，只要它適用於培養細胞，例如哺乳動物細胞。由於具有低細胞密度的工藝一般容易放大，所以本發明的方法對於大規模培養(即，培養體積大於250L)特別有利並且特別適合從小的實驗室規模培養(例如10L)放大到生產規模培養(例如250L和250L以上)， 其中培養條件進行極小修改。培養單元的內部條件，包括但不限於ΡΗ、ρ02和溫度，通常在培養期期間進行控制。生產培養單元指代在所關心多肽、病毒和/或任何其它產物的生產中使用的最終培養單元。大規模生產培養單元的體積一般大於約250升，可以為約300、約 500、約800、約1000、約2500、約5000、約8000、約10，000、約12，0000L或更多，或任何中間體積。適合的培養單元或生產培養單元可以由適合在其中所涵蓋的培養條件下容納懸浮於培養基中的細胞培養物以及有益於哺乳動物細胞生長和成活的任何材料構成(即，由所述材料構造)。適用材料的實例包括但不限於玻璃、塑料和/或金屬。在優選實施方案中，所述材料不幹擾、或不顯著幹擾或大致不幹擾所需產物例如所關心多肽和/或病毒的表達和 /或穩定性。所屬領域的技術人員將會認識到並且將能夠選擇適用於實踐本發明連續培養系統的培養單元。在一些實施方案中，細胞培養工藝在多於一個不同的培養單元中操作，諸如使用一個或多個種子(繁殖)培養單元，之後使用生產培養單元。這樣，在一些實施方案中，該工藝涉及轉移約50L繁殖後的種子培養物(具有約1. OXlO6細胞/mL)到含有約150L培養基的250L培養單元中。一般來說，本文所述的連續培養系統僅施加至生產培養單元。例如， 首先使種子哺乳動物細胞在一個或多個種子培養單元中繁殖，例如在分批式、流加式、灌流和/或恆化器系統中。在細胞轉移到生產培養單元後，可以根據本文所述的連續培養系統培養細胞，例如利用細胞截留裝置在稀釋率小於約2CT1和細胞密度小於約2X107細胞/mL的CN 102549142 A
細胞培養系統中。或者，可以在一個物理培養單元中將細胞擴增到生產培養單元和生產階段。例如， 可以將細胞擴增到最終生產規模並將工藝切換到生產條件，由此可以使用針對本文所述的連續細胞培養系統的條件。意外發現，可以使用本發明的培養方法保持細胞密度和稀釋率在預定範圍內，例如以便支持持續時間類似於恆化器或灌流系統的生產階段。「預定範圍」表示目標範圍，例如本文中針對根據本發明實施方案操作連續培養系統所述的範圍。例如，在一些實施方案中，稀釋率的目標範圍在0. 2CT1到2. OcT1之間，而細胞密度的目標範圍為小於2X107細胞/ mL。在另一實施方案中，稀釋率保持為小於2. Ocf1，例如小於1. 8CT1，例如小於1. 5CT1或例如小於1. 2CT1，而細胞密度為小於1. 5X107細胞/mL，例如小於IXlO7細胞/mL或例如小於 ^QO6細胞/mL。在一些實施方案中，比生長率為0. IcT1到LOcT1且稀釋率與比生長率的比率在1. 2與5之間。在一些實施方案中，稀釋率的目標範圍在0. 5CT1到1. OcT1之間且細胞密度為小於5X106細胞/mL。在一些實施方案中，比生長率為0. 15CT1到0. 3CT1且稀釋率與比生長率的比率在1. 8與3之間。在一些實施方案中，比生長率為0. 2d-1到0. 25(1^1且稀釋率與比生長率的比率在2. 0與2. 5之間。在特別優選的實施方案中，細胞密度為5X106細胞/mL或更小，稀釋率為小於0. 6CT1，且比生長率為0. 18到0. 27CT1。在另一特別優選的實施方案中，細胞密度為小於5X106細胞/mL，稀釋率在0. 55CT1與0. ecf1之間，且比生長率為 0. led-1到0. 26(1-1.實施方案包括在總連續培養時間和/或生產階段時間的至少約50%， 例如至少約60 %，例如至少約70 %，例如至少約80 %，例如至少約90 %，例如至少約95 %， 例如至少約98%，保持稀釋率和/或細胞密度和/或比生長率和/或稀釋率與比生長率的比率在目標範圍(例如，上文提及的範圍)內。本文所述的連續細胞培養系統可以允許由哺乳動物細胞持續產生所關心多肽和/ 或病毒。在一些實施方案中，細胞培養大於約7天的總連續細胞培養時間。在更優選的實施方案中，細胞培養大於約9天、大於約14天、大於約21天、大於約觀天、大於約35天、大於約40天、大於約45天或大於約50天。術語「細胞培養基(cellculture medium) 」和「培養基」 (culture medium 或簡稱 "medium")指代用於真核細胞生長的營養液，通常提供來自以下一個或多個種類的至少一種組分(1)促進培養基滲透壓的鹽(例如，鈉、鉀、鎂、鈣等)；(2)能源，通常呈諸如葡萄糖等碳水化合物的形式；C3)所有必需胺基酸，和通常二十種胺基酸的基本集(basic set)； ⑷維生素和/或所需的其它低濃度有機化合物；和(5)微量元素，其中微量元素定義為通常需要的非常低濃度、通常在微摩爾濃度範圍內的無機化合物。營養液任選地可以補充來自以下任一種類的一種或多種組分(a)動物血清；(b)激素和其它生長因子諸如(例如) 胰島素、轉鐵蛋白和表皮生長因子；和(c)植物、酵素和/或組織的水解產物，包括其蛋白質水解產物。在無血清培養基、化學成分明確的培養基或沒有動物源性組分的培養基中培植表達所關心多肽和/或病毒的哺乳動物細胞時，本發明連續培養系統特別有用。化學成分明確的培養基是其中的所有組分具有已知的化學結構的培養基。化學成分明確的培養基可以從商業供應商獲得，諸如(例如)Sigma、JRH Biosciences、Gibco和Gemini。在本發明的其它實施方案中，培養基可以含有來源於本領域中已知的任何來源或方法的胺基酸，包括但不限於來源於添加一個或多個胺基酸或添加蛋白腖或蛋白質水解產物(包括動物、酵母或植物來源的水解產物)的胺基酸。支持在本發明條件下的細胞生長和保持的任何細胞培養基都可以使用。通常，培養基含有水、滲透壓調節劑、緩衝劑、能源、胺基酸、無機或重組鐵源、一種或多種合成或重組生長因子、維生素和輔因子。在優選實施方案中，培養基沒有動物源性組分。本文所用的 「動物源性」組分是完整動物中產生的任何組分(諸如(例如)從血清分離和純化的蛋白質)，或使用完整動物中產生的組分產生的任何組分(諸如(例如)使用從動物分離和純化的酶來水解植物來源材料所得的胺基酸)。相比之下，具有動物蛋白的序列(即，具有動物基因組來源的序列)但是使用沒有在完整動物中產生的或從完整動物分離和純化的組分的培養基在體外的細胞培養中(諸如(例如)在重組酵母或細菌細胞中或在建立的重組或非重組的連續真核細胞細胞系中)產生的蛋白質，不是「動物源性」組分。例如，在酵母或細菌細胞中產生的胰島素，或在建立的哺乳動物細胞系諸如CHO、BHK或HEK細胞中產生的胰島素，或在Namalwa細胞中產生的幹擾素，不構成「動物源性」組分。因此，沒有動物源性組分的細胞培養基可以含有重組產生的動物蛋白；不過，這種培養基不含有例如動物血清或從動物血清純化的蛋白質或其它產物。例如，這種培養基可以含有來源於植物的一種或多種組分。在本發明的其它實施方案中，在細胞生長階段期間使用的培養基含有濃培養基， 即所含的養分濃度高於正常需要的或正常提供給生長培養物的濃度的培養基。所屬領域的技術人員將認識到哪些細胞培養基、接種培養基等適合培養特定細胞，例如動物細胞(例如CHO細胞)。例如，所屬領域的技術人員將能夠為特定培養物適當地選擇葡萄糖和其它養分諸如穀氨醯胺、鐵、微量元素等的量，以及其它培養變量，諸如(例如)發泡、滲透壓等的量(例如參見 Mather, J. P.，等人(1999) "Culture media, animal cells, large scale production,，，Encyclopedia of Bioprocess Technology :Fermentation, Biocatalysis, and Bios印aration，Vol. 2 :777-785 (尤其第780頁到第783頁)；美國專利申請公開案第 2006/0121568號(尤其第
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段)；兩者均已引用的方式全部併入本文)。本發明還涵蓋這些已知培養基的變體，包括例如這些培養基的養分富集變體、濃培養基、化學成分明確的培養基、無血清培養基，和另外根據本發明各種實施方案修改的培養基。連續培養系統不限於非錨定依賴性哺乳動物細胞的任何類型。哺乳動物細胞可以是表達所關心重組多肽(和/或重組病毒)的基因修飾哺乳動物細胞，或表達所關心多肽(和/或病毒)的未修飾哺乳動物細胞。許多哺乳動物細胞係為適合多肽和/或病毒重組表達的宿主細胞。哺乳動物宿主細胞系包括例如COS、PER. C6、TM4、VERO、MDCK、BRL-3A、 W138,Hep G2、MMT、MRC 5、FS4、CH0、293T、A431、3T3、CV-l、C3H10Tl/2、Colo205、293、HeLa、 L 細胞、BHK、HL-60、FRhL-2、U937、HaK、Jurkat 細胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP_l、PC12、Mlx、鼠骨髓瘤(例如SP2/0和NS0)和C2C12細胞，以及轉化的靈長類細胞系、雜交瘤、正常二倍體細胞，和來源於初生組織與初生外植體的體外培養的細胞株。可以適應懸浮培養的任何哺乳動物細胞都可以在所公開的細胞培養方法中使用。非限制性實例包括CHO細胞，其在血清和適當表面存在下培植時具有錨定依賴性，但很容易適應懸浮培養中的生長(參見例如 Rasmussen 1998，Cytotechnology 28 第 31-42 頁，尤其第；34_37 頁，關於培養無血清 CHO
11細胞系)。能夠表達所關心多肽和/或病毒(不管是重組產生或非重組產生)的任何哺乳動物細胞也都可以在所公開的細胞培養方法中使用。在一個實施方案中，可以使用本文公開的連續細胞培養方法來使錨定依賴性細胞系改造成非錨定依賴性細胞系。許多細胞系可以從商業來源諸如美國菌種保藏中心(ATCC)獲得。在一個實施方案中，使用連續細胞培養系統來培養基因修飾CHO細胞。如本文所述，連續細胞培養系統可以進行所關心多肽和/或病毒(例如重組多肽和/或重組病毒)的回收。多肽和/或病毒通常從自系統除去的用過的培養基中回收。本發明優選實施方案的優點包括降低蛋白質和/或病毒在生物反應器中的滯留時間，這對容易降解的產物特別有用。不過，本文公開的連續細胞培養系統並不限於這類不穩定多肽或病毒，也可以用於其它所關心多肽或病毒的回收。本發明涉及用於表達一種或多種所關心蛋白質和/或病毒的哺乳動物細胞的改進大規模連續培養的方法，不管所述表達是來自內源基因或自然感染，或是向所述細胞中引入編碼所關心蛋白質或病毒的重組基因之後。所述蛋白質的非限制性實例包括酶、激素、 抗體、蛋白質受體、融合蛋白(例如可溶受體與IgG的Fc域的融合蛋白)、疫苗、細胞因子、 趨化因子、生長因子、血液因子蛋白等。在一個實施方案中，所關心蛋白質是ADAMTS13。在另一實施方案中，所關心蛋白質是因子VII或因子VIII。在另一實施方案中，所關心蛋白質是α-1-蛋白酶抑制劑。本發明還涉及用於表達一種或多種所關心病毒(包括病毒顆粒和病毒載體)的哺乳動物細胞的改進大規模連續培養的方法，不管所述病毒是野生型還是重組病毒。所述野生型或重組病毒、病毒顆粒和/或病毒載體的非限制性實例包括腺病毒、皰疹病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、流感病毒等。重組病毒、病毒顆粒的產生以及重組病毒載體的使用在本領域眾所周知。對於病毒的表達，本發明的方法特別適合但不限於利用非溶解性(non-lytic) 病毒諸如(例如)A型肝炎和TBE病毒的感染和這些病毒在例如Vero細胞中的表達，或者利用慢病毒的感染和這些病毒在例如HEK293或其它人或哺乳動物細胞系中的表達。一旦培養基自培養單元中除去，就可以使它經歷一種或多種加工步驟以獲得所關心蛋白質和/或病毒。下遊加工步驟包括但不限於離心和/或過濾以除去先前未從培養物取出的細胞；親和色譜法、疏水性相互作用色譜法；離子交換色譜法；尺寸排除色譜法；電泳程序(例如製備型等電點聚焦(IEF)、差別溶解度(例如硫酸銨沉澱法)、萃取等。 大體上，參見 Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag,紐約，1982 ；禾Π Protein Purification，編著 J. -C. Janson 和 Lars Ryden, VCH Publishers，紐約，1989。在某些實施方案中，讓哺乳動物細胞經歷預培養步驟，例如使細胞適應所關心多肽和/或病毒的產生的預培養步驟。在一些實施方案中，所述適應包含懸浮預培養細胞，例如持續的時間使培養物達到例如約5L、約8L、約10L、約12L、約15L或約20L等的所需最終工作體積。此時，將培養物切換到連續培養基進料並根據本文所述的連續細胞培養系統進行操作。在下面提供的實施例中進一步討論本文公開的本發明的示例性實施例。但是所述實施例和它們的具體細節並非意在限制本發明。實施例實施例1 在化學成分明確的BA⑶-A13培養基(富集的DMEM/F12調配物)中利用表達人ADAMTS13的重組CHO細胞系製備恆化器培養物，所述培養基如表1. 1中所示進行補充。
表1.1:細胞培養基BACD-A13的組成組分濃度丨g/kglDMEM/HAMS F12 BaxS912.74L-穀氨醯胺1.3Synperonic1.00乙醇胺0.00153ZnSO4JH2O0.001NaHCO31.5
使表達人ADAMTS13的重組CHO細胞適應化學成分明確的培養基，即BCS培養基， 如表1. 2中所示。
表1.2:細胞培養基BCS的組成組分濃度[g/kg]DMEM/HAMS F12 Bax Special11.75L-穀氨醯胺0.9Synperonic1.00乙醇胺0.00153腐胺.2HC10.0036FeS04.7H200.0006NaHCO32.0使發展工作細胞庫(Development Working Cell Bank)融化，在BCS培養基中製備細胞接種物。把細胞轉移到具有Rushton型葉輪的IOL培養單元中，在BACD-A13培養基中的重複分批式培養中培植，利用線內控制參數，如下pH 7. 10，溫度36°C，和DO 20%空氣飽和。2批次循環後，培養物達到最終工作體積10L，第4天把培養物切換到連續培養基進料，並一直以恆化器模式操作到第18天。利用此培養物，對具有Rushton型葉輪和細胞截留裝置的第二個IOL培養單元接種以用於類似恆化器灌流，使用同樣的細胞培養基，並在重複分批式培養中培植8天。添加 CYT0P0RE 2 微載體(GE Healthcare) (0. 25g/L)，進一步以連續類似恆化器灌流模式操作培養單元，與恆化器模式的另一培養單元並行進行。在140rpm下利用具有擋板的Rushton 型葉輪攪動培養單元，所述HOrpm對應於近似40W/m3的比功率/體積輸出。兩種培養單元並行操作M天。以3個周間隔和另一 3天的間隔計算數據(表 1. 3 (恆化器)和表1. 4 (類似恆化器灌流)。表1. 3中四個間隔(第沈-32天、第33-39天、 第40-46天和第47-49天)的數據直接與表1. 4中所示的四個間隔(第9_15天、第16-22 天、第23- 天和第30-32天)的數據進行比較。從培養單元取樣，利用ELISA分析ADAMTS13濃度，利用FRETS-73試驗分析ADAMTS13活性。利用Nucleocounter技術測定細胞計數。對於灌流培養物，分開測量總細胞計數和上清液中的細胞計數以計算相對細胞截留。測量稀釋率，使用稀釋率計算生長率和體積生產率。下面提供方程恆化器培養中的生長率(μ)使用方程μ =0+111(^/^)/(^)計算，其中D = 稀釋率，Xt =時間t時的總細胞密度，和(t-tj = t與％之間的時間。類似恆化器灌流培養中的生長率(μ)使用方程μ = In (XtAw) / (t-tj+D x(logmean XSN/logmean /(t-tj計算；其中D =稀釋率，Xt =時間t時的總細胞密度，(t-tj =t與％之間的時間，logmean X =總細胞密度的對數平均值=(Xt-Xw)/ (In(Xt)-In(Xw)),和logmean Xsn =上清液細胞密度的對數平均值。細胞截留率計算為100x(l-XSN/X) [% ]0
權利要求
1.一種用於在連續細胞培養中產生所關心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含(a)在連續細胞培養系統中培養表達所述所關心多肽和/或病毒的哺乳動物細胞，其中所述細胞培養系統包含細胞截留裝置並且具有小於2CT1的稀釋率(D)和小於2X107細胞 /mL的細胞密度；和(b)從自所述細胞培養系統除去的培養基中回收所述所關心多肽和/或病毒。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞截留裝置產生小於90%的細胞截留率。
3.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述稀釋率在0.IcT1與1. OcT1之間。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞密度小於IXlO7細胞/mL。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞培養系統的稀釋率和比生長率的比率(D/μ)在1.2與5之間。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞培養系統的比生長率在 0. 2(Γ 與 0. 8cT 之間。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞在所述細胞培養系統中培養大於20天。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞在所述細胞培養系統中培養大於40天。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞在所述細胞培養系統中培養大於50天。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述稀釋率和所述細胞密度保持所述細胞在所述細胞培養系統中培養時間的至少80%。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞截留裝置包含大孔微載體。
12.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞在無血清培養基中培養。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞在至少250L培養基中培養。
14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞是非錨定依賴性細胞。
15.根據前述權利要求中任一項所述的方法，進一步包含在所述培養步驟之前，懸浮預培養所述細胞。
16.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞經過基因修飾以表達所述所關心多肽和/或病毒。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述細胞是CHO細胞。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述多肽是去整合素樣金屬肽酶含血小板反應蛋白1基元13(ADAMTS13)蛋白。
19.一種組合物，其包含根據前述權利要求中任一項所述的方法產生的所關心多肽和 /或病毒°
20.一種組合物，其包含根據前述權利要求中任一項所述的方法產生的重組ADAMTS13蛋白。
全文摘要
本文描述一種類似恆化器連續細胞培養系統，其合併了灌流開放系統和恆化器開放系統的某些優點從而改進哺乳動物細胞例如基因修飾細胞的培養，特別是在無血清或化學成分明確的培養基中的培養。本文所述的連續培養系統涉及在包含細胞截留裝置的連續細胞培養系統中培養哺乳動物細胞，其中所述細胞培養系統的稀釋率(D)小於約2d-1，細胞密度小於約2X107細胞/mL。本文還描述一種用於在連續細胞培養中產生所關心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含在包含細胞截留裝置的連續細胞培養系統中培養表達所關心多肽和/或病毒的哺乳動物細胞，其中所述細胞培養系統的稀釋率(D)小於約2d-1，細胞密度小於約2X107細胞/mL；和從細胞培養系統的培養基中回收所關心多肽和/或病毒。
文檔編號C12N5/00GK102549142SQ201080036754
公開日2012年7月4日 申請日期2010年8月2日 優先權日2009年7月31日
發明者D·弗萊施漢德爾, L·格裡爾伯格, M·賴特爾 申請人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司