Hiv－1感染cd4的製作方法

2023-05-09 01:45:51 2

專利名稱：Hiv－1感染cd4的製作方法
技術領域：
本發明涉及了一種HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法。它涉及生命科學領域、及醫藥領域。為能夠綜合科學論證、模擬分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治療無症狀期HIV-1感染者延長生存期的綜合治療機制，和設計相關更有效治療HIV-1感染者的新藥，與建立相關實驗檢測治療HIV-1感染者用藥的新檢測機制、方法、標準的，人類愛滋病基礎/臨床/藥物綜合科學研究，提供相關綜合科學研究實驗依據。設計在理論上可以根治早期愛滋病的抗HIV-1藥。
背景技術：
自1983年人免疫缺陷病毒——愛滋病被發現以來，人類在HIV科學研究領域，HIV病毒生物學基礎科學研究、HIV病毒感染傳播流行病學科學研究、HIV病毒傳染病綜合防治與臨床治療醫藥科學研究等方面，取得了眾多舉世矚目重大科學研究成果。但是，客觀的講，人類在根治、預防愛滋病科學研究方面，至今沒有取得解決根本問題的科學研究突破。沒有科學研究跡象表明抗HIV治療可以徹底清除患者機體病毒、治癒HIV感染者。嚴酷的科學現實，使當今從事HIV科學研究的眾多學者，似乎要放棄了治癒HIV感染者的科學研究夢想！雖然抗逆轉錄病毒藥物的聯合應用可能對急性期、中期、到晚期的HIV感染者的治療效果顯著，但對早期無症狀HIV感染者治療效果並不確切。因此，這些患者長期應用抗逆轉錄病毒藥，可能引發各種毒性反應……，是否利大於弊，尚不清楚。美國DHHS 2005年4月頒布的，成人青少年HIV-1感染抗病毒指南推薦的抗病毒治療指徵對CD4+T細胞數＞350/μl、病毒載量＞100000cp/ml的患者多數醫生不贊成治療，但也有一些醫生傾向於治療。對CD4+T細胞數＞350/μl、病毒載量＜100000cp/ml的患者可暫不治療。
高效聯合抗病毒療法是當今實施愛滋病治療的標準療法。該療法通過作用於病毒的不同複製階段、或不同複製機制的抗病毒藥物聯合使用，可以顯著降低HIV/AIDS相關疾病的感染髮病率和死亡率、能夠顯著延長感染者的生存期。但是，由於HIV耐藥性毒株的產生，最終導致聯合抗病毒藥物治療失敗；由於HIV感染者機體存在1％或更多的，難以被或不能被細胞免疫清除的，長期慢性HIV病毒感染細胞、或靜止潛伏HIV病毒感染細胞儲庫，最終導致聯合抗病毒藥物治療失敗；是現有抗HIV治療不能達到徹底清除患者機體病毒的目的，不可治癒HIV感染者的兩個主要原因。
發明者認為1.應用核苷類逆轉錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯合治療HIV感染者，病毒RNA在逆轉錄過程中，受核苷類逆轉錄酶抑制劑核苷酸衍生物摻入互補cDNA鏈幹擾，會極大增加病毒RNA逆轉錄複製DNA鹼基的錯配、或丟失等的發生率，產生更多的HIV-I基因變異突變毒株，是應用核苷類逆轉錄酶抑制劑治療HIV-I感染者，增加產生HIV-I突變毒株、耐藥突變毒株，尚未被揭示的重要分子生物發生機制。2.在HIV感染者機體存在、在應用核苷類逆轉錄酶抑制劑治療HIV感染者機體存在，難以被或不能被細胞免疫有效清除的，長期慢性HIV病毒感染細胞、靜止潛伏HIV病毒感染細胞儲庫，其中某些細胞是HIV基因變異缺陷病毒所感染的細胞。某些整合在感染宿主細胞染色體上的HIV前缺陷病毒DNA，在感染細胞被激活啟動染色體複製時、帶動整合在染色體上的HIV前缺陷病毒DNA鏈一同複製，宿主細胞的DNA修復酶，可以修復HIV前缺陷病毒DNA鏈中缺失核苷酸部位，使HIV前缺陷病毒缺失核苷酸的變異基因得到修復，進而能夠轉錄複製HIV病毒、致死被感染宿主細胞，再感染、致死其它宿主細胞；是HIV感染者機體存在長期慢性HIV病毒感染細胞、靜止潛伏HIV病毒感染細胞儲庫，其中某些細胞可以被激活激活、轉錄複製HIV病毒的，一種極重要的分子生物激活發生機制。3.模擬HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學抗HIV-I藥治療機制，體外傳代培養HIV-I感染細胞，實施相關科學研究實驗，能夠為上述1./2.HIV綜合科學論證，提供相關科學研究實驗依據。4.上述1./2./3.HIV科學研究的可行性科學分析理論依據是現代分子遺傳學不需要科學論證的基本科學常識；不存在任何不可實施的現代生物科學技術難點。5.設計在理論上可以根治早期愛滋病的抗HIV-1藥。

發明內容
本發明公開了一種HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法。是分別應用取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC細胞、長期無症狀期的人PBMC細胞、終末期的人PBMC細胞，取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC細胞、同性戀者的人PBMC細胞、靜脈吸毒者的人PBMC細胞；傳代人CD4+細胞系，例如人T淋巴細胞系MT4；分別應用胎牛血清，HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、長期無症狀期的人AB血清、終末期的人AB血清，未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性戀者的人AB血清、靜脈吸毒者的人AB血清；分別設計分別針對未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體，能夠做HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學、分子生物調控網絡分析的體外傳代細胞培養系統。建立能夠被HIV-1科學研究應用於綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體，擁有不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境的改變，和不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境/CD4+細胞動力學機制的，綜合科學研究實驗平臺。設計在理論上可以根治早期愛滋病的抗HIV-1藥。
本發明的目的是，提供一種HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法。建立能夠被HIV-1科學研究應用於綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體，擁有不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境的改變，和不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境/CD4+細胞動力學機制的，綜合科學研究實驗平臺。為能夠綜合科學論證、模擬分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治療無症狀期HIV-1感染者延長生存期的綜合治療機制，和設計相關更有效治療HIV-1感染者的新藥，與建立相關實驗檢測治療HIV-1感染者用藥的新檢測機制、方法、標準的，人類愛滋病基礎/臨床/藥物綜合科學研究，提供相關綜合科學研究實驗依據。設計在理論上可以根治早期愛滋病的抗HIV-1藥。
1.模擬HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學，實施體外傳代培養HIV-I感染人PBMC細胞10代、或HIV-I感染MT4細胞10代，對最終傳代培養沒有被HIV-I感染致死的活細胞計數、HIV-I感染PCR檢測，陽性表達的活細胞-計數；模擬核苷類逆轉錄酶抑制劑治療HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學，實施體外傳代培養HIV-I感染人PBMC細胞+核苷類逆轉錄酶抑制劑10代、或HIV-I感染MT4細胞+核苷類逆轉錄酶抑制劑10代，對最終傳代培養沒有被HIV-I感染致死的活細胞計數、HIV-I感染PCR檢測，陽性表達的活細胞-計數。證實應用核苷類逆轉錄酶抑制劑治療HIV-I感染者，會極大增加病毒RNA逆轉錄複製DNA鹼基的錯配、或丟失等的發生率，產生更多的HIV-I基因變異突變毒株，是應用核苷類逆轉錄酶抑制劑治療HIV-I感染者，增加產生HIV-I突變毒株、耐藥突變毒株，尚未被揭示的重要分子生物發生機制。
2.應用加IL-2、PHA培養液，體外培養實驗1.最終傳代培養沒有被HIV-I感染致死的活細胞，直至出現某個感染細胞內的HIV-I缺陷病毒基因發生回復突變、可以複製病毒致死培養細胞，再感染、致死其它培養細胞；證實HIV-I感染者機體存在，某些難以被或不能被細胞免疫有效清除的，長期慢性HIV-I病毒感染細胞、靜止潛伏HIV-I病毒感染細胞，是HIV-I基因變異缺陷病毒所感染細胞。進而證實應用核苷類逆轉錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯合治療HIV-I感染者，能夠增加機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫，是其不可治癒HIV-1感染者，尚未被揭示的重要原因。
3.分別採用未感染HIV-1正常健康者的人血清、同性戀者的人血清、靜脈吸毒者的人血清，分別實施實驗1./2.體外細胞培養模型實驗；分別採用感染HIV-1者的最初急性期的人血清、長期無症狀期的人血清、終末期的人血清，分別實施實驗1./2.體外細胞培養模型實驗；建立能夠被HIV-1科學研究應用於綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體，擁有不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境的改變，和不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境/CD4+細胞動力學機制的，綜合科學研究實驗平臺。設計在理論上可以根治早期愛滋病的抗HIV-1藥。
具體實施例方式
為達到上述目的，實施本發明採用的方案1實驗材料與方法1.1實驗材料1.1.1體外培養CD4+細胞取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC細胞，長期無症狀期的人PBMC細胞，終末期的人PBMC細胞；取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC細胞，同性戀者的人PBMC細胞，靜脈吸毒者的人PBMC細胞；傳代人CD4+細胞系，例如人T淋巴細胞系MT4。
1.1.2感染培養CD4+細胞的HIV-I病毒來自HIV-I感染者血漿與CD4+細胞共同培養；來自HIV-I感染者PBMC細胞與CD4+細胞共同培養；來自傳代培養被HIV-I感染CD4+細胞；HIV-I毒株，例如HIV-I CNHN24毒株。
1.2藥物和試劑
1.2.1胎牛血清，未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性戀者的人AB血清、靜脈吸毒者的人AB血清，HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、長期無症狀期的人AB血清、終末期的人AB血清；RPMI-2加人AB血清或胎牛血清培養液，RPMI1640加人AB血清或胎牛血清培養液含青黴素-G100U/ml、慶大黴素50μg/ml；Ficoll-Hystopaque密度梯度溶液d＝1.077g/ml Pharmacia，把5ml Ficoll液預先內置於25ml離心管內；EDTA鈉鹽、用生理鹽水配製7.5％抗凝液，把0.1ml抗凝EDTA鈉鹽溶液預先內置於10ml注射器內；天然非重組人白細胞介素IL-2；植物凝集素PHA。
1.2.2抗HIV-I藥，例如核苷類逆轉錄酶抑制劑3TC，為葛蘭素史克製藥公司生產的賀普丁拉米夫定片，每片含100mg3TC。將100mg拉米夫定溶解於50mlRPMI1640培養液中，離心、過濾獲得3TC濃度為8.7mmol溶液，使用前應用RPMI1640培養液稀釋成所需要濃度。
1.3製備生物實驗材料1.3.1製取人PBMC細胞應用預先內置有0.1ml抗凝EDTA鈉鹽溶液的10ml注射器，無菌抽取未感染HIV-I者靜脈血5ml、或感染HIV-I者靜脈血5ml，加2倍RPMI-2培養液混勻；將其仔細緩慢加入預先內置有Ficoll液5ml的25ml離心管上層；20℃、400g離心30min；用吸管小心把離心管Ficoll液和血液分界層間的PBMC細胞吸出，置入新離心管加5倍RPMI-2培養液混勻；20℃、300g離心10min，棄上清液，加5倍RPMI-2培養液混勻；20℃、200g離心5min，棄上清液，用含有10％人AB血清或胎牛血清的RPMI1640培養液，配製細胞懸液1×107/ml、並進行活細胞計數。
1.3.1製取人血清無菌抽取未感染HIV-I者靜脈血200ml、或感染HIV-I者靜脈血200ml；分置4隻100ml離心管內，2000g離心10min，離心後4℃低溫靜置60min；然後用血管鉗擠壓血凝塊，擠出內含的血清；棄去血凝塊，再分置2隻100ml離心管內，5~10000g離心60min；用一系列過濾器進行過濾，最後用0.1μm孔徑無菌過濾器進行過濾後；分置於多個小無菌高密度聚丙烯容器，放置-70℃冰箱保存備用。如有特殊實驗要求需要，可在實驗前復溫4℃應用親和層析法除去血清中的抗體。
1.4體外傳代細胞培養系統實驗方法1.4.1建立不含有核苷類逆轉錄酶抑制劑3TC的、MT4-CNHN24毒株體外傳代細胞培養系統；建立含有核苷類逆轉錄酶抑制劑3TC的、MT4-CNHN24毒株體外傳代細胞培養系統用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養液，調整MT4細胞濃度為1×106/ml培養細胞懸液，每個50ml細胞培養瓶中加入12ml該培養MT4細胞濃度懸液，僅在第一代細胞培養瓶中接種濃度為1000TCID50的HIV-I CNHN24毒株；在含有3TC的體外細胞培養系統，加入3TC溶液第1代第2代培養液3TC濃度為0.01umol、第3代第4代培養液3TC濃度為0.02umol、第5代第6代培養液3TC濃度為0.04umol、第7代第8代培養液3TC濃度為0.08umol、第9代第10代培養液3TC濃度為0.16umol。將細胞培養瓶放置37℃，5％CO2的培養箱中培養不含有核苷類逆轉錄酶抑制劑3TC的、MT4-CNHN24毒株體外傳代細胞培養系統，每培養4d為1個培養世代，取出培養MT4細胞懸液，先用15~20μm孔徑的篩網濾除被HIV-I感染致死細胞融合體，再用10μm孔徑的篩網過濾除去被HIV-I感染致死細胞碎片、陳舊培養液，注意用培養液衝洗回收留在篩網中的所有活細胞，離心濃縮為2ml、補充10ml含MT4細胞的新鮮培養液，繼續培養下一個世代；第4d後每天在倒置顯微鏡觀察培養細胞病變。培養10代後，每4天一次取出培養MT4細胞懸液，先用15~20μm孔徑的篩網濾除被HIV-I感染致死細胞融合體，再用10μm孔徑的篩網過濾除去被HIV-I感染致死細胞碎片、陳舊培養液，注意用培養液衝洗回收留在篩網中的所有活細胞，離心濃縮為1ml、補充不含MT4細胞的新鮮培養液，調整MT4細胞濃度為5~8×105/ml後繼續培養；直至倒置顯微鏡觀察培養細胞不再出現被HIV-I感染致死細胞病變。對最終傳代培養沒有被HIV-I感染致死的活細胞計數、HIV-I感染PCR檢測，陽性表達的活細胞計數-A-。應用不含MT4細胞的新鮮培養液中加10μg/ml白細胞介素IL-2、10μg/ml植物凝集素PHA，繼續培養沒有HIV-I感染致死的活細胞，直至再出現被HIV-I感染致死細胞病變。
含有核苷類逆轉錄酶抑制劑3TC的、MT4-CNHN24毒株體外傳代細胞培養系統，每3d吸取6ml培養上清液，補充6ml不含MT4細胞的新鮮培養液，每培養6d為1個培養世代，取出培養MT4細胞懸液，先用15~20μm孔徑的篩網濾除被HIV-I感染致死細胞融合體，再用10μm孔徑的篩網過濾除去被HIV-I感染致死細胞碎片、陳舊培養液，注意用培養液衝洗回收留在篩網中的所有活細胞，離心濃縮為2ml、補充10ml含MT4細胞的新鮮培養液，繼續培養下一個世代；第4d後每天在倒置顯微鏡觀察培養細胞病變。培養10代後，每4天一次取出培養MT4細胞懸液，先用15~20μm孔徑的篩網濾除被HIV-I感染致死細胞融合體，再用10μm孔徑的篩網過濾除去被HIV-I感染致死細胞碎片、陳舊培養液，注意用培養液衝洗回收留在篩網中的所有活細胞，離心濃縮為1ml、補充不含MT4細胞的新鮮培養液，調整MT4細胞濃度為5~8×105/ml後繼續培養；直至倒置顯微鏡觀察培養細胞不再出現被HIV-I感染致死細胞病變。對最終傳代培養沒有被HIV-I感染致死的活細胞計數、HIV-I感染PCR檢測，陽性表達的活細胞計數-A+。應用不含MT4細胞的新鮮培養液中加10μg/ml白細胞介素IL-2、10μg/ml植物凝集素PHA，繼續培養沒有HIV-I感染致死的活細胞，直至再出現被HIV-I感染致死細胞病變。
1.4.1體外系統，能夠綜合模擬表達HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學抗HIV-I藥治療機制A+/A-＝a抗HIV-I藥致變異係數A-，模擬表達HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學，機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫。
A+，模擬表達核苷類逆轉錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯合，治療HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學，機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫。
a抗HIV-I藥致變異係數，模擬表達HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學抗HIV-I藥治療致變異機制a＞1，抗HIV-I藥增加病毒變異發生率，增加機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫；a＜1，抗HIV-I藥抑制病毒變異發生率，減少機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫。
1.4.2參照1.4.1體外系統，應用取自抗HIV-I藥治療HIV-I感染者PBMC細胞，應用含有20％HIV-I感染者長期無症狀期的人AB血清的RPMI1640培養液，分別建立幾個應用幾種不同的核苷類逆轉錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯合用藥，培養HIV-I感染者PBMC細胞的體外傳代細胞培養系統1、2、3對比分別應用幾種不同的核苷類逆轉錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯合用藥，培養取自HIV-I感染者PBMC細胞的體外傳代細胞培養系統1、2、3的模擬表達機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫1A+、2A+、3A+。為HIV-I感染者，選定一個應用抗HIV-I藥致變異相對最小的、個體優化治療方案。
1.4.3參照1.4.1/1.4.2體外系統，博採眾長、廣泛參照國際眾多好的體外系統。分別應用取自HIV-I感染者最初急性期的人PBMC細胞、長期無症狀期的人PBMC細胞、終末期的人PBMC細胞，取自未感染HIV-I者的正常健康人PBMC細胞、同性戀者的人PBMC細胞、靜脈吸毒者的人PBMC細胞；分別應用HIV-I感染者最初急性期的人AB血清、長期無症狀期的人AB血清、終末期的人AB血清，未感染HIV-I者的正常健康人AB血清、同性戀者的人AB血清、靜脈吸毒者的人AB血清；分別設計分別針對未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體，能夠做HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學、分子生物調控網絡分析的體外傳代細胞培養系統。建立能夠被HIV-1科學研究應用於綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體，擁有不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境的改變，和不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境/CD4+細胞動力學機制的，綜合科學研究實驗平臺。設計在理論上可以根治早期愛滋病的抗HIV-1藥。
1.5發明創新討論1.5.1現有抗HIV治療不能達到徹底清除患者機體病毒的目的，不可治癒HIV感染者。是當今HIV科學研究設計研製的，核苷類逆轉錄酶抑制劑、或與其它抗HIV-I藥聯合，治療HIV-I感染者病毒和CD4+細胞動力學的抗HIV-I藥治療機制，病毒RNA在逆轉錄過程中，受核苷類逆轉錄酶抑制劑核苷酸衍生物摻入互補cDNA鏈幹擾，會極大增加病毒RNA逆轉錄複製DNA鹼基的錯配、或丟失等的發生率，產生更多的HIV-I基因變異突變毒株、耐藥突變毒株；使a抗HIV-I藥致變異係數＞1，抗HIV-I藥增加病毒變異發生率，增加機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫，導致聯合抗病毒藥物治療失敗。是被HIV科學界疏漏的一個極重要的科學研究盲區。1.4體外系統，建立能夠被HIV-1科學研究應用於綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體，擁有不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境的改變，和不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境/CD4+細胞動力學機制的，綜合科學研究實驗平臺。將能夠為綜合科學論證、模擬分析揭示可以根治早期HIV-1感染者、有效治療無症狀期HIV-1感染者延長生存期的綜合治療機制，設計有效治療HIV-1感染者的新藥物，制定檢測治療HIV-1感染者用藥物的新檢測機制、方法、標準的，人類愛滋病基礎/臨床/藥物綜合科學研究，提供相關綜合科學研究實驗依據。可行性科學分析理論依據是現代分子遺傳學不需要科學論證的基本科學常識；不存在任何不可實施的現代生物科學技術難點。
1.5.2HIV科學界，把不能根治、預防愛滋病，取得解決根本問題的科學研究突破的原因，歸咎於HIV複製速度快、HIV基因具有高度變異性病毒的產量平均約為1010/天，HIV在體內的平均複製產生周期時間約為2.6天；體外測定每6000個核甘酸在逆轉錄過程中有一次錯誤的概率，體內測試顯示每輪複製過程可能產生一次突變。可以產生大量具有各種不同基因變異型或表型的毒株，對藥物抑制壓力、機體免疫抑制壓力，不斷衍生出新的耐藥毒株、免疫逃逸毒株優勢病毒種株。病毒通過特異性突變所獲得的選擇性優點將對病毒基因組產生有力的影響。沒有科學研究跡象表明HIV疫苗可能會有效預防HIV感染。最近針對愛滋病病毒提出一種退而求其次、再退而求其更次的新觀點，以預防病毒的傳播為目的的疫苗三級預防，即通過使用疫苗刺激起機體的抗HIV免疫力來抑制體內HIV複製，降低血液中病毒含量。如能夠保護健康人不被HIV感染當然是最理想的疫苗，但如能阻止感染後發病或阻斷已感染的人發生愛滋病亦是很好的治療疫苗，而如可以通過疫苗降低感染者體內的病毒量，減少對他人傳播也不失為具有很好公共衛生價值的疫苗。HIV科學界在此相關科學研究方面，有眾多科學研究發現，不能一一綜述。作者僅針對在此相關科學研究方面，被HIV科學界疏漏的另一個極重要的科學研究「盲區」，HIV感染是首先通過表達的膜蛋白gp120與CD4+T淋巴細胞受體特異結合，觸發免疫耐受機制，能夠比HIV具有高度變異性免疫逃逸機制，更為有效對抗機體免疫抑制壓力，作如下綜述出現高滴度的HIV的特有的抗體是HIV原發性免疫反應的特徵，它出現在病毒血症的高峰或稍晚時間。有趣的是，這最初的抗體反應不包括中和抗體。有趣的是，抗逆轉錄病毒藥和IL-2治療雖然可以使CD4+T細胞計數增加，卻未能使解體Vβ庫恢復。應用IL-2治療期間CD4+T細胞的增加來源於CD4+T細胞庫在胸腺外的擴增，因為T細胞Vβ庫的PCR分析證明缺失的克隆不能再生。用IL-2和抗逆轉錄病毒藥試圖重建T細胞Vβ庫的失敗，暗示免疫系統的損傷可能存在閾值，若超過該閾值，免疫功能便不能重建。間接感染或各種疫苗免疫的HIV感染個體都有血漿病毒血症暫時增加，並且與誘導產生免疫活性程度相關；類似的發現也可見於SIV感染的恆河猴中。上述眾多不可被一一綜述HIV科學研究發現，明確顯示HIV是在感染人體複製的最初期、還沒有激發機體免疫系統應答反應之前，會首先通過表達的膜蛋白gp120與CD4+T淋巴細胞受體特異結合，觸發免疫耐受機制，導致感染機體免疫系統針對HIV感染複製應答延遲，尤其是體液免疫應答反應延遲、不能首先產生針對gp120的中和抗體、抑制gp120與CD4+T淋巴細胞受體特異結合；進而使HIV能夠在機體免疫系統形成針對gp120的中和抗體免疫抑制應答之前，還沒有被CTL細胞免疫有效抑制時、能夠過度複製HIV最終會達到病毒血症峰值。作者認為可能是在此期間由於HIV過度表達所編碼的超抗原，能夠與某些特定的T淋巴細胞受體Vβ克隆反應，誘導抑制性T淋巴細胞，建立進一步的免疫耐受機制；並且誘導傳染性免疫耐，與導致某些特定的T淋巴細胞受體Vβ克隆損傷、漸至枯竭，從而使T細胞Vβ庫不可被再生恢復；因而確實存在HIV感染者免疫系統的損傷閾值，若超過該閾值，HIV感染者的免疫功能便不可被恢復重建。作者認為HIV感染者急性期達到病毒血症峰值期，可能是使T淋巴細胞受體Vβ克隆損傷、轉向漸至枯竭不可被重建損傷，至無症狀期達到免疫系統的損傷不可被重建閾值。因而作者認為在HIV感染者急性期、至達到免疫系統的損傷不可被重建閾值之前，可能會存在一個可以被抗HIV藥有效根治、能夠重建HIV感染者受損免疫系統的，很暫短的效治根治HIV感染者的窗口期。
1.4體外系統，建立能夠被HIV-1科學研究應用於綜合模擬揭示未感染HIV-1者的不同群體最初感染病毒的生命個體、感染HIV-1者的不同病毒感染致病期的人體，擁有不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境的改變，和不同的病毒感染複製、致病、治療免疫應答細胞活性與細胞因子網絡微環境/CD4+細胞動力學機制的，綜合科學研究實驗平臺。可以被應用於綜合模擬揭示上述HIV感染是首先通過表達的gp120與CD4+T淋巴細胞受體特異結合，觸發免疫耐受機制的，相關綜合分子生物調控網絡機制。
gp160疫苗通常需用較高劑量接種4次以上才能使少數受試者產生較低滴度的同源中和抗體。Vaxgene公司的gp120疫苗在北美和泰國進行大規模的III臨床試驗。2003年2月23日，Vaxgene公司公布了北美地區的試驗結果，其中接種疫苗人群HIV感染率為5.7％，未接種疫苗人群HIV感染率為5.8％。結果表明該疫苗不能有效預防HIV感染。眾多不可被一一綜述與各種gp160、gp120疫苗實驗失敗相關的HIV科學研究發現，可以為證實，HIV感染是首先通過表達的gp120與CD4+T淋巴細胞受體特異結合，觸發免疫耐受機制，提供相關綜合科學研究實驗依據。
可以利用HIV科學研究現有的猴免疫缺陷病毒SIV恆河猴動物模型，nef基因缺失的SIV-mac239Δnef減毒株疫苗、SIV膜蛋白疫苗，實施與SIV膜蛋白觸發免疫耐受機制相關的器官移植實驗，將能夠為證實HIV感染是首先通過表達的gp120與CD4+T淋巴細胞受體特異結合，觸發免疫耐受機制，提供可令人信服的，足夠充分的科學研究實驗依據。並且可以把表達膜蛋白gp120的HIV減活疫苗應用於器官移植實驗，在器官移植科學研究方面取得重大科學研究突破。但是它將會不幸的證實HIV科學研究在沒有充分揭示HIV感染是首先通過表達的gp120與CD4+T淋巴細胞受體特異結合，觸發免疫耐受機制，尋找到能夠解決它的問題方法前，現有的疫苗科學研究思維、科學研究方法，將不能研製出可能會有效預防HIV感染的HIV疫苗。它極有可能是HIV科學研究在應用HIV疫苗預防愛滋病科學研究方面，所難以逾越的科學障礙！因此，HIV科學研究需要設計、研製a抗HIV-I藥致變異係數＜1，抗HIV-I藥抑制病毒變異發生率，減少機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫的，新的抗HIV-I藥或抗HIV-I藥聯合。爭取在HIV感染急性期，HIV感染者的免疫系統所受到的損傷還沒有超過閾值，免疫功能還可以被重建、有可能效治根治HIV感染者的窗口期，儘早對HIV感染者實施a抗HIV-I藥致變異係數＜1，抗HIV-I藥抑制病毒變異發生率，減少機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫的，新的抗HIV-I藥或抗HIV-I藥聯合早期抗HIV感染治療。是未來人類有可能通過儘早對HIV感染者實施早期抗HIV感染治療，實現抗HIV治療達到徹底清除患者機體病毒的目的，治癒HIV感染者的，唯一希望，最基本的保障。
發明者知道有一種藥，曾在多種不同的體外系統實驗中都顯示a抗HIV-I藥致變異係數＜1；還沒有做過繼續深入的相關實驗。如果能夠通過1.4體外系統，證實它具有a抗HIV-I藥致變異係數＜1，抗HIV-I藥抑制病毒變異發生率，減少機體存在的HIV-I基因變異缺陷病毒長期慢性感染細胞、靜止潛伏感染細胞-儲庫等作用。再進一步利用SIV、HIV-II恆河猴動物模型，證實它在SIV、HIV-H感染猴的免疫系統所受到的損傷還沒有超過閾值，免疫功能還可以被恢復重建時，可以通過實施它早期抗SIV、HIV-II治療，達到徹底清除SIV、HIV-II感染猴機體病毒的目的，治癒SIV、HIV-II感染猴。它將是一種有希望被應用於在HIV感染急性期，早期治癒HIV-I感染者的抗HIV-I藥。
發明者尋求實施研製相關抗HIV-I藥的，合作者與資助者。
權利要求
1.一種HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於應用加血清(1)培養液(2)、感染培養CD4+細胞的HIV-I病毒(3)實施CD4+細胞(4)體外細胞培養(5)，對最終培養沒有被HIV-I感染致死的活細胞實施HIV-I感染檢測(6)，對HIV-I感染檢測陽性的活細胞計數(7)。
2.一種HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於應用加血清(1)培養液(2)、感染培養CD4+細胞的HIV-I病毒(3)、抗HIV-I藥(8)實施CD4+細胞(4)體外細胞培養(5)，對最終培養沒有被HIV-I感染致死的活細胞實施HIV-I感染檢測(6)，對HIV-I感染檢測陽性的活細胞計數(7)。
3.根據權利要求1、2中所述的HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於體外細胞培養(5)是傳代補充CD4+細胞(4)的體外傳代細胞培養(9)。
4.根據權利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於血清(1)是胎牛血清(10)。
5.根據權利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於血清(1)是未感染HIV-I者的人血清(11)。
6.根據權利要求1至3中所述的HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於血清(1)是感染HIV-I者的人血清(12)。
7.根據權利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於CD4+細胞(4)是感染HIV-I者的人PBMC細胞(13)。
8.根據權利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於CD4+細胞(4)是未感染HIV-I者的人PBMC細胞(14)。
9.根據權利要求1至7中所述的HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於CD4+細胞(4)是傳代人CD4+細胞系(15)。
10.根據權利要求2至10中所述的HIV-1感染CD4+細胞體外細胞培養模型與方法，其特徵在於抗HIV-I藥(8)是有核苷類逆轉錄酶抑制劑(16)的抗HIV-I藥。
全文摘要
本發明名稱為HIV－1感染CD文檔編號C12Q1/04GK1944637SQ200610140799
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月12日 優先權日2006年10月12日
發明者葉新新 申請人:葉新新