用於診斷恙蟲病的重組融合蛋白的製作方法

2023-05-09 01:13:01

專利名稱：用於診斷恙蟲病的重組融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於診斷恙蟲病(tsutsugamush disease)的重組融合蛋白抗原，更具體而言，本發明涉及血清學診斷恙蟲病的方法，其利用以串聯嵌合物形式融合的兩個或多個蛋白的重組融合蛋白抗原，所述蛋白由恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi)抗原決定部位(epitopes)產生。
恙蟲病是由恙蟲攜帶，其為節肢動物，屬於纖恙蟎屬(Leptotrombidium)，該屬動物的生長模式不規則。恙蟎的變態需要脊椎動物的組織液。所以，恙蟎是暫時性地寄生在動物體上，而動物體就是在此時感染了蟎蟲。在韓國，約有20種恙蟲(trobiculids)(Traub，R.，M.L.Morrow和L.J.「LipovskyNewSpecies of chiggers from Korea.Proc.Ent.Soc.Wash.60145-66，1958)，這些物種所攜帶的恙蟲病東方體包括leptotrombidium pallidum和leptotrombidiumscutellare等。
恙蟲病東方體是典型的專性細胞內細菌(obligate intracellular bacteria)，0.3-0.7μm大小，具有短桿菌或球菌外形。立克次氏體科包括斑疹傷寒，斑疹熱，恙蟲病，五日熱羅卡利馬氏體(Rochalimea Quintana)包括戰壕熱，伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetti)包括Q熱。該分類依賴於宿主細胞，細菌傳代載體的類型，外-斐二氏試驗(Weil-Felix assay)和補體結合反應試驗，最近依賴於抗原分析和分子生物學方法。
所有被歸類為立克次氏體科的生物可通過恙蟲，蝨子或跳蚤以及其他載體而使人類產生各種疾病。另外，根據立克次氏體屬的劃分，疾病的症狀或流行病學表現顯示出顯著的差異。相同的種具有血清學關聯，但是不同的種不具有交叉反應性。歸類於恙蟲病的恙蟲病東方體是一個物種，但根據抗原的結構，可能被劃分為許多血清型。各種恙蟲病東方體血清型的例子包括Gilliam，Karp和Kato(Traub，R.和C.L.Wisserman，Jr.，1974)。除這些原始的血清型外，還在亞洲發現了新的血清型如TA678，TA686，TA716，TA763，TH1817等等(Shirai，A.，Robinson，D.M.，Brown，G.W.等，Characterization ofRickettsia tsutsugamushi strains in two species of naturally infectedlaboratory-reared chiggers.An.J.，Trop.Med.Hyg.，31(2)395-402，1982)。在韓國，除Gilliam，Karp和Kato外，還發現了與原始品系不同血清學反應的Boryong血清型(Chang和Kang，1987)。根據該報導，從位於北部區的京畿道分離的恙蟲病東方體與從南部的Choongchung道分離的恙蟲病東方體血清學不相同，Choongchung道分離的血清型具有血清學特異性，這與原始菌株有顯著差異。
這些血清型的變種是由來自細胞膜蛋白的抗原的區別而產生，該抗原被分為種特異性抗原，血清型特異性抗原等。在聚丙烯醯胺凝膠電泳和免疫印記分析的研究中，恙蟲病東方體蛋白如70，60，54-56，46-47kDa被鑑定為主要的抗原(Takahashi，K.，Urakami，H.和A.TamuraPurification of cellenvelopes of Rickettsia tsutsugamushi.Microbiol.Immunol.，29475，1985)。在這些主要抗原中，46-47，54-56和70kDa蛋白具有抗原性，特別地，70和46-47kDa蛋白是種特異性抗原(Tamura，A.，Urakami，H.和Tsurhara，T.Purification of Rickettsia tsutsugamushi by percoll density gradientcentrifugation.Microbiol.Immunol.26321，1982)。
同時，當用胰蛋白酶處理恙蟲病東方體時，細菌會喪失其進入小鼠L細胞的侵襲力。這個發現說明恙蟲病東方體的膜蛋白與其病原性有關(Weiss，E.The biology ofRickettsiae.Ann.Rev.Microbial.36345，1982)。所以，依賴於血清型的恙蟲病東方體病原性被認為是由特定細胞膜蛋白結構上的差異而導致的。
另外，恙蟲病東方體的病原性介導了系統微血管炎，該病由恙蟲病東方體侵入內皮細胞而導致。換言之，通過誘導的內皮細胞吞噬作用機制，侵入血液的恙蟲病東方體被吞噬。當從吞噬體中釋放出來後，恙蟲病東方體在細胞質內通過二分裂增殖(Tamura等，1982)。增殖導致內皮細胞的破裂，顯微鏡可見的血栓或在血管附近的炎症。
針對恙蟲病東方體的免疫學防禦機制目前還所知甚少。但是，一些研究顯示對於恙蟲病東方體的防禦機制包括體液免疫和細胞免疫應答。感染了恙蟲病東方體的裸鼠會產生針對該抗原的抗體，但是小鼠不能誘導記憶性恙蟲病東方體再感染的免疫應答。另外，有報導稱轉移分離自免疫小鼠的T淋巴細胞可產生恙蟲病東方體再感染的抗性。與該報導一起，有研究支持細胞免疫應答也有所參與，該研究顯示在臨床期和T淋巴細胞的數目之間存在相關性。同時，有報導稱抗體誘導感染了恙蟲病東方體的吞噬細胞的細胞數目減少50％，該報導也證明體液免疫應答和保護性免疫之間的關聯。
同時，人類對於恙蟲病的保護性免疫特異於其接受的血清型。換言之，對於相同血清型的記憶免疫應答可持續幾年，但是對於不同血清型的記憶免疫應答只能持續幾個月。例如，該結果是從對初次感染Gilliam和Karp再感染2個月後的患者的4個月的觀察和血清學測試中被報導的。
恙蟲病的臨床症狀包括，例如，全身淋巴結腫大，焦痂，皮膚潰瘍等。通常，恙蟲病導致輕微的臨床症狀，該病通過觀察臨床症狀而做出診斷。但是，恙蟲病可能會頻繁地顯示出意外的症狀，而恙蟲病通常的症狀如全身淋巴結腫大和焦痂有時卻不出現。在這種情況下，恙蟲病也許不會與鉤端螺旋性病，傷寒熱或帶有腎綜合症的出血熱區別開來。
最近，診斷恙蟲病的方法包括一種方法從患者血液分離並鑑定恙蟲病東方體，從患者血清中檢測針對恙蟲病東方體的抗體，PCR擴增來自患者血液的恙蟲病東方體DNA。但是，這種疾病診斷伴隨細菌培養，該培養需要2到4周培養時間，這樣，該方法並不優選用於診斷臨床患者。另外，該方法使用PCR，重現性不佳。所以，近來發展的恙蟲病診斷方法包括血清學方法，例如外-斐二氏方法，補體結合方法，間接免疫螢光測試，酶聯免疫吸收方法和被動血凝方法。
但是，血清學方法中的外-斐二氏方法目前未被應用，因為通常其靈敏度很低，在恙蟲病和鉤端螺旋體病，其變種的尿道感染和其他熱病的診斷中產生假陽性結果。
同樣，補體結合方法需要複雜的技術方法，導致重現性低。另外，使用補體結合方法的診斷需要純化的恙蟲病東方體抗原，這樣，當抗體的滴度較低時，就存在呈現假陰性診斷的可能性。所以，目前不應用該方法。
所以，大體上，目前恙蟲病的診斷是通過間接免疫螢光方法和酶聯免疫吸收方法(ELISA)進行的。這些方法靈敏度高，具有特異性，能夠通過IgG和IgM間的區別來測定免疫球蛋白的滴度，這樣，通過這些方法初次感染能夠與再感染區別開來。由於這些優點，WHO推薦這些方法用於診斷恙蟲病。
同時，間接螢光方法需要培養對人類具有高病原性的細菌，為獲得抗原需要細胞培養或卵孵化的設備；以及螢光顯微鏡。在使用1∶10到1∶20稀釋血清的情況下，間接螢光方法會產生假陽性診斷。
所以，我們嘗試使用重組抗原診斷恙蟲病，該抗原由含有編碼恙蟲病東方體主要抗原基因的大腸桿菌(E.coli)產生。

發明內容
為解決傳統診斷恙蟲病方法的問題而提出本發明。
換言之，本發明提供用於診斷恙蟲病的融合蛋白以及製備融合蛋白的方法。
使用本發明的融合蛋白來診斷恙蟲病的方法不需要培養微生物，而且得到的診斷結果比使用單一基因重組蛋白的傳統方法靈敏度高。這樣，使用本發明融合蛋白的診斷恙蟲病的方法可以降低使用多種單一基因重組蛋白混合物的診斷成本。發明詳述為達到上述目的，本發明使用融合蛋白作為抗原用於診斷恙蟲病，該融合蛋白是兩個或多個由恙蟲病東方體抗原決定部位所產生的蛋白的串聯嵌合物形式。
在此，所述用於診斷恙蟲病的抗原優選來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的蛋白片段的融合蛋白。更優選地，所述用於診斷恙蟲病的抗原是來源於兩個或多個物種的蛋白的融合蛋白，所述物種選自各種恙蟲病東方體異種血清型，如Gilliam，Karp，Kato等。
另外，為達到上述目的，本發明提供製備所述用於診斷恙蟲病的融合蛋白的方法，包括以下步驟1)構建所述用於診斷恙蟲病的融合蛋白的表達載體，其中所述表達載體包括DNA片段，該片段包括編碼兩個或多個蛋白的基因，所述蛋白來源於恙蟲病東方體的抗原決定部位；2)將所述表達載體轉化到宿主細胞；3)培養所述轉化的細胞；以及4)從所述培養基和/或所述轉化細胞中獲得所述融合蛋白。
由於恙蟲病東方體的56kDa蛋白可以具有抗原性，本發明通過使用恙蟲病東方體的56kDa蛋白進行恙蟲病的診斷。
為診斷恙蟲病，應通過以下步驟製備和純化融合蛋白，所述融合蛋白含有來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的蛋白a)通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增編碼來自恙蟲病東方體標準血清型(Gilliam，Karp和Kato)56kDa蛋白的蛋白的基因片段；b)將PCR產物與表達載體線性連接；c)將重組的表達載體轉化到大腸桿菌中；d)培養該轉化的大腸桿菌；以及e)純化該重組融合蛋白作為抗原用於診斷恙蟲病。
換言之，所述方法可總結為在克隆編碼來自所述56kDa蛋白的蛋白的基因片段後，大規模生產來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的蛋白。由於通過本方法得到的重組蛋白對恙蟲病血清具有很強的反應性，診斷試劑盒如被動血凝反應(PHA)試劑盒，其不需要特定儀器和設備，可通過使用所述重組融合蛋白進行開發，所述重組融合蛋白還可用於酶聯免疫吸收試驗(ELISA)方法用於測定滴度，這是大規模樣品處理所需要的。
生產用於診斷恙蟲病的重組融合蛋白抗原的方法以及診斷恙蟲病的方法在下文詳述。
首先，在小鼠L929細胞中培養每種血清型恙蟲病東方體後，分離出恙蟲病東方體菌株如Gilliam，Karp和Kato。其次，通過酶解純化每種分離的血清型的DNA，苯酚抽提以及乙醇沉澱。
在編碼來自恙蟲病東方體56kDa蛋白基因的序列基礎上，選擇出在Boryong，Gilliam，Karp和Kato血清型中胺基酸序列具有高於30％同源性的區域，分別製備用於擴增Boryong，Gilliam，Karp和Kato的寡核苷酸引物對。然後，使用上述引物，通過PCR擴增來自Boryong，Gilliam，Karp和Kato菌株的基因片段，純化的DNA作為模板。
純化PCR擴增產物之後，將擴增產物連接到pTYB12載體的多克隆位點。首先，來自Gilliam菌株的DNA片段被插入到pTYB12載體中，來構建pTG3載體，然後，來自Karp菌株的DNA片段被插入到pTG3載體中，來構建pTGP1載體，然後來自Kato菌株的DNA片段被插入到pTGP1載體中，來構建pTGPT2載體。另外，獲得DNA片段後，在該DNA片段中來自Gilliam，Karp和Kato的基因片段是線性連接的，該DNA片段被插入到pET22b(+)載體來構建pETb7載體。
用以上製備的表達載體轉化大腸桿菌後，為獲得融合蛋白的表達而培養轉化的大腸桿菌。通過電泳和western印記分析融合蛋白的表達，然後從相應的克隆中純化出融合蛋白抗原。純化的抗原被用於免疫學定量和定性分析。
在此，「免疫學定量和定性分析」是指定量或定性分析抗恙蟲病東方體的抗體的技術，以達到利用所述純化抗原來測定恙蟲病東方體既往病史的目的，所述恙蟲病東方體來自人體或動物血清。免疫學定量和定性分析的例子包括使用抗原-抗體相互反應如ELISA和被動血凝，進行定量方法和定性的方法。
使用本發明重組融合蛋白診斷恙蟲病和正常人的結果顯示，獲得了93.6％的診斷靈敏度以及94.2％的診斷特異性。
圖2是說明通過分別將編碼來源於恙蟲病東方體Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的片段依次插入到pTYB12載體中，從而由pTYB12載體製備pTG3，pTGP1和pTGPT2載體的過程示意圖。
圖3是說明從pTGPT2中引出線性連接的56kDa蛋白基因片段而導入pET22b(+)來獲得pETb7載體的過程示意圖。
圖4是克隆載體的電泳結果，其中M是λHindIII大小標記，V是pTYB12載體，G是pTG3載體，P是pTGP1載體，T是pTGPT2載體。
圖5是克隆載體pETb7的電泳結果，其中M是λHindIII大小標記，1道是pET22b(+)載體(5493bps)，2道是pETb7載體(8004bps)。
圖6是顯示編碼來源於恙蟲病東方體三種血清型Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的基因以插入到pTYB12載體的形式表達的電泳凝膠圖譜，其中，V代表來源於用pTYB12轉化的大腸桿菌ER2566的蛋白片段；G代表由用pTG3轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam的56kDa蛋白片段；P代表由用pTGP1轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam和Karp的56kDa蛋白片段的融合蛋白；T代表由用pTGPT2轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；圖7是顯示編碼來源於恙蟲病東方體三種血清型Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的基因以插入到pET22b(+)載體的形式表達的電泳凝膠圖譜，其中，第1道代表由用pTGPT2轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；第2道代表pET22b(+)轉化的大腸桿菌ER2566；第3道代表由用pETb7轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；圖8是顯示從pETb7載體轉化的大腸桿菌中純化融合蛋白的過程示意圖，該過程包括線性連接來自恙蟲病東方體Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白，其中數字輪流代表片段數字，在進行點印記分析後，洗脫組分用小鼠抗血清進行免疫酶學染色。
圖9是利用ELISA顯示融合蛋白抗原與來自恙蟲病患者或正常人的每種血清的反應性，所述融合蛋白抗原由編碼來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的線性連接基因所表達，其中，恙蟲病患者通過間接免疫螢光抗體測試(IFA)進行診斷。在圖9中，橫軸代表IFA分析的血清抗體的滴度；縱軸代表ELISA測定的吸收值。


圖10顯示使用重組融合蛋白抗原進行ELISA的靈敏度和特異性，所述融合蛋白抗原由編碼來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的線性連接基因所表達，其中診斷恙蟲病的靈敏度為93.6％，特異性為94.2％。
本發明由優選實施方式和實驗實施例更具體地說明。但是，本發明不應限於這些實施例。
本發明僅由涉及重組融合蛋白抗原的實施例說明，所述融合蛋白抗原是利用編碼來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的基因片段所產生。但是，本發明的範圍包括兩個或多個蛋白以串聯嵌合形式融合而成的抗原，所述蛋白選自來源於天然存在於自然界的恙蟲病東方體30個或更多血清型的22，47，56，8，60，110，115和130kDa蛋白，以及由恙蟲病東方體不同血清型抗原決定部位所產生的蛋白。
另外，本發明僅由用大腸桿菌作為宿主細胞用於表達上述本發明重組融合蛋白抗原的實施例解釋。但是，本發明的範圍包括應用酵母，其它真核細胞，動物或植物組織細胞和來源於DNA重組哺乳動物的細胞。
實施例1細菌菌株，質粒和培養基從恙蟲病患者中分離出Boryong菌株並保藏在漢城大學醫學院微生物與免疫系(Department of Microbiology and Immunology，College of Medicine，Seoul National University)，而獲自美國典型培養物保藏中心(American TypeCulture Collection)(Manassas，VA 20110-2209)的Gilliam，Karp和Kato菌株則用作恙蟲病東方體的實驗血清型。
質粒pCYB1，pCYB2，pCYB3，pCYB4，pCYB12(NEB#6902)，pET(Novagen)和pBluescript(Stratagene)被應用於以下實驗，而大腸桿菌BL21(DE3)和ER2566菌株用作宿主細胞來擴增質粒以及表達蛋白。
當用插入了來源於恙蟲病東方體的基因片段的載體轉化大腸桿菌後，於37℃，在含有100μg/ml氨卞青黴素(Sigma A9518)的LB(Luria-Bertani)肉湯或LB瓊脂板上培養轉化的大腸桿菌。
實施例2恙蟲病東方體的培養和純化在37℃，5％CO2的培養箱中，用EMEM-10培養基(含有10％胎牛血清(FBS；Gibco Lab.Grand island N.Y.)的Earles』最小基礎培養基，(Gibco，410-1500EG))培養在150cm3細胞培養皿(Falcon 32025)中的5×107小鼠L-929細胞(American Type Culture Collection，Manasass，VA 20110-2209)。當增殖的細胞覆蓋了培養皿的底部時，將其用於以下感染實驗。
去掉95％的培養基後，將測試量的每種恙蟲病東方體Gilliam，Karp，Kato和Boryong菌株倒入上述培養板，然後在37℃，在CO2培養箱中培養1.5小時。將含有0.4μg/ml道諾黴素和5％FBS的EMEM-5D加入5％CO2培養箱中後，在34℃繼續培養細胞。當80％的細胞被感染時，收集細胞。
用於純化基因組DNA的恙蟲病東方體製備如下從20個150cm3細胞培養皿中收集恙蟲病東方體感染的小鼠L-929細胞，然後，在4℃，8,000×g離心(Sorval)15分鐘沉澱細胞，去上清。然後，用6.5ml TS緩衝液(33mMTris-HCl pH7.4，0.25M蔗糖)重懸沉澱。用Potter-Elvehjem勻漿器勻漿懸浮液中的細胞3分鐘，然後400×g離心10分鐘。向上清中加入Percoll使其終濃度為40％，然後進行等密度離心1小時來分離恙蟲病東方體。
實施例3從恙蟲病東方體中分離DNA向純化的恙蟲病東方體中加入含有1％SDS(十二烷基硫酸鈉)和100μg/ml蛋白酶K的緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA pH8.0，150mM NaCl)，然後在50℃培養混合物2小時，致使細菌溶解。接下來，加入等體積苯酚後，緩慢搖動，12,000×g離心溶菌液5分鐘，獲得上清(下文中稱為『苯酚抽提』)。用同樣的方法，用苯酚∶氯仿∶異戊醇(isoamylalcohol)(25∶24∶1)抽提蛋白質2次。向DNA溶解相加入3M乙酸鈉(pH5.4)使其終濃度為0.3mM，再加入2倍體積的100％乙醇，在-20℃貯藏18小時。然後在4℃，12,000×g離心15分鐘沉澱DNA。向沉澱中加入與100％乙醇等體積的70％乙醇，在4℃，12,000×g離心5分鐘洗滌DNA。快速真空乾燥器(Savant SVC100-H)中乾燥10分鐘，再用50μl TE緩衝液(10mMTris-HCl pH8.0，1mM EDTApH8.0)懸浮DNA(下文中稱為『乙醇沉澱』)。
實施例4製備小鼠抗恙蟲病東方體血清為選擇克隆以及進行western印記分析，抗恙蟲病東方體Boryong菌株的C3H/HeDub小鼠抗血清按如下製備首先，從所述小鼠L-929細胞中分離並在小鼠C3H/HeDub中測定的1000×MLD50恙蟲病東方體Boryong菌株被皮下注射到實驗小鼠中作為初級免疫。然後，從最初注射的日期開始，以2周的間隔進行細菌注射給藥，進行免疫，共進行3次注射。最後一次注射2周後，將免疫小鼠斷頭，得到小鼠血清。然後，IFA測定抗體對Boryong菌株的滴度後，製備滴度高於1∶1280的血清。
利用下述方法從上面獲得的血清中去除抗大腸桿菌的抗體在1升含有100μg/ml氨卞青黴素的LB肉湯中培養pTYB12載體轉化的大腸桿菌18小時。然後，用含有0.05％Tween-20的TBST(Tris-緩衝鹽；50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH7.4)清洗培養基3遍，溶液用20ml TBST懸浮。在100℃水浴中加熱懸浮液後，用最大功率的超聲波儀(Quigley-Rochester Inc.)勻漿溶液中的細菌3分鐘。然後，向溶液中加入等體積的抗血清，在室溫下緩慢搖動，吸附4小時。然後，2,000×g離心吸附的溶液20分鐘，這樣，去除了細胞碎片，獲得上清液。
接下來，使用該抗血清進行的westem印記分析或者免疫分析顯示非特異性反應性顯著降低。
實施例5大腸桿菌中表達、分離和純化來自恙蟲病東方體的56kDa蛋白(1)PCR擴增編碼56kDa蛋白的基因在56kDa蛋白基因序列(Genebank編號04956)的基礎上，選擇出恙蟲病東方體各種血清型Boryong，Gilliam，Karp和Kato中帶有高度保守同源性的區域，並分別製備Gilliam，Karp和Kato的每對寡核苷酸引物。換言之，製備互補於含有127-140個核苷酸的DNA序列的正向引物，以及互補於含有1069-1092個核苷酸的DNA序列的反向引物，用於擴增Gilliam中具有127-1092個核苷酸的序列的DNA片段。用同樣的方法，製備以下正向和反向引物用於擴增Karp中具有118-1013的序列的DNA片段以及Kato中具有121-957的序列的DNA片段。通過Oligo.Etc.Co.Wilsonville，OR.指數製備法(order preparation)獲得以下引物Gilliam正向引物5』GGACA』T ATGATT ACT GGT GCA GAA-3』(Seq.ID No.1)Gilliam反向引物5』-ATCG』TC GACATT TAA AAG CCT AAC-3』(Seq.ID No.2)Karp正向引物5』-GTTG』TC GACGGA ATG ATT ACT GGC-3』(Seq.IDNo.3)Karp反向引物5』-GGC ATG ACA AAA TTG』AAT TCT ATC-3』(Seq.IDNo.4)Kato正向引物5』-GTC GTT GGAG』AA TTCATT ACT GGC-3』(Seq.IDNo.5)Kato反向引物5』-TTG CTG CCCGGG』CCCCTG CTG-3』(Seq.ID No.6)在此，CA』TATG是NdeI的識別位點，G』TCGAC是SalI的識別位點，G』AATTC是EcoRI的識別位點，GGG』CCC是SmaI的識別位點。
當引物對用於分離自未感染恙蟲病東方體的L929細胞的DNA的PCR時，未檢測到PCR擴增的DNA帶。該結果說明本發明的引物是恙蟲病東方體特異性的。同時，通過恙蟲病東方體純化中所用的方法進行來自L929細胞的DNA純化。
為擴增來自Gilliam，Karp和Kato的所述DNA片段，利用下述方法，使用恙蟲病東方體DNA作為模板和上述引物，進行PCR簡言之，向PCR混合物(每種引物400nM，50mM KCl，10mM Tris-HCl pH9.0，0.1％Triton X-100，dNTP每種0.2mM，MgCl21mM)中加入100ng恙蟲病東方體DNA，終體積為50μl，再加入2.5U Taq聚合酶(Promega Cat#M1861，Madison，WI)。使用Thermal循環系統9600(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)進行PCR，PCR條件如下94℃3分鐘1個循環使其預變性，94℃15秒35個循環，其中包括了變性，60℃1分鐘進行退火/延長，72℃2分鐘1個循環進行最後的延長。
用含有溴乙啶的瓊脂糖凝膠對擴增的PCR產物進行電泳，紫外燈下目測。
(2)純化PCR產物並克隆表達載體使用QIAEX凝膠抽提試劑盒(Qiagen Inc.，Catsworth CA.)從瓊脂糖凝膠中提取出每種PCR產物，然後將每種提取的產物重懸於20μl TE緩衝液。將400ng純化的PCR產物加入Klenow緩衝液(20mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH8.0)中，再加入2.5U Klenow片段(Promega，M220，Madison，WI)。37℃孵育溶液3分鐘，加入dNTP混合物(每種0.125mM)，再在37℃孵育1小時。進行所述苯酚抽提和乙醇沉澱後，獲得10μl TE懸浮液。
純化pTYB12載體後，用合適的限制性酶處理載體，然後將上述所獲的PCR產物插入到載體中。簡言之，用NdeI和SalI消化pTYB12載體以及從Gilliam中所獲的PCR產物，再用CIAP(小牛腸鹼性磷酸酶)將獲得的物質進行脫磷酸作用。然後，進行所述苯酚抽提和乙醇沉澱後，獲得10μl TE懸浮液。將100ng消化的載體和消化的PCR產物混合，終體積3.5μl，然後在45℃孵育混合物15分鐘，再置於冰上。加入0.5μl 10×Ligase緩衝液(250mMTris-HCl pH7.8，100mM MgCl2，20mM DTT和4mM ATP)和2U連接酶後，在4℃孵育反應溶液18小時。用連接的載體DNA轉化大腸桿菌ER2566，用於擴增載體。構建的載體命名為pTG3。
來自Karp的PCR產物被插入到載體pTG3中，然後用SalI和EcoRI消化，再利用與上面相同的方法，在大腸桿菌ER2566中進行連接和擴增。構建的載體命名為pTGP1。
另外，來自Kato的PCR產物被插入到載體pTGP1中，然後用EcoRI和SmaI消化，再利用與上面相同的方法，在大腸桿菌ER2566中進行連接和擴增。構建的載體命名為pTGPT2。
在構建的載體pTGPT2中，來自Gilliam的DNA片段大小為952bps；Karp DNA片段為873bps；Kato是915bps；插入的總DNA片段為2640bps，估測蛋白的大小為97kDa。
接下來，構建的pTGPT2載體用NdeI和SmaI消化，獲得了線性連接的Gilliam，Karp和Kato片段的DNA片段。用XhoI消化pET22b(+)載體，再用苯酚抽提和乙醇沉澱。然後，加入Klenow片段，dTTP和dCTP後，在37℃孵育反應溶液30分鐘。再用S1核酸酶處理通過苯酚抽提和乙醇沉澱所獲得的TE懸浮液，然後在23℃孵育15分鐘，再一次進行苯酚抽提和乙醇沉澱。然後將pET22b(+)載體平頭處理，用NdeI消化該載體，再進行苯酚抽提和乙醇沉澱。接下來，用連接方法將含有來自Gilliam，Karp和Kato的基因片段的DNA片段插入到XhoI-NdeI處理過的載體中。然後，使用ER2566擴增上面所獲的載體。該擴增的pET22b(+)載體含有來自Gilliam，Karp和Kato的基因片段的DNA片段，命名為pETb7。
用構建的載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，利用免疫學方法選擇出陽性克隆。
2000年8月5日，根據布達佩斯條約(Budapest Treaty on the InternationalRecogition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of PatentProcedure)將構建的載體pETb7保藏在位於Taejon的韓國典型培養物保藏中心(Korea Collection of Type Cultures)，保藏編號為KCTC 18042P。該保藏已在2001年9月5日轉為布達佩斯條約下的保藏，編號為KCTC 10065BP。
圖1是顯示編碼56kDa蛋白的基因片段線性連接的實例示意圖，所述蛋白來源於Gilliam，Karp和Kato，作為恙蟲病東方體的3種血清型，其中圖1a是pTGPT2載體，圖1b是pETb7。
圖2是說明通過分別將編碼來源於恙蟲病東方體Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的片段依次插入到pTYB12載體中，從而由pTYB12載體製備pTG3，pTGP1和pTGPT2載體的過程示意圖。
圖3是說明從pTGPT2中引出線性連接的56kDa蛋白基因片段而導入pET22b(+)來獲得pETb7載體的過程示意圖。
圖4是克隆載體的電泳結果，其中M是λHindIII大小標記，V是pTYB12載體，G是pTG3載體，P是pTGP1載體，T是pTGPT2載體。
圖5是克隆載體pETb7的電泳結果，其中M是λHindIII大小標記，1道是pET22b(+)載體(5493bps)，2道是pETb7載體(8004bps)。
(3)製備感受態細胞LB培養基中過夜培養的大腸桿菌BL21(DE3)在同樣的培養基中稀釋100倍，並繼續培養直到600nm的OD值達到0.3。然後，在冰上孵育細菌培養物之後，4℃，400×g離心20分鐘，用冰冷卻的0.1M CaCl2清洗培養液，離心後棄上清。然後，用1/2培養基體積的0.1M CaCl2重懸大腸桿菌細胞。在冰上孵育細胞1小時後，4℃，4000×g離心20分鐘，棄上清。然後用1/10培養基體積的0.1M CaCl2重懸大腸桿菌細胞，獲得轉化用的感受態細胞。
(4)轉化將1μl上述獲得的連接載體與100μl上述獲得的感受態細胞混合，再置於冰上1小時。然後在42℃熱休克180秒使感受態大腸桿菌細胞吸收表達載體的DNA。向熱休克的溶液中加入500μl LB培養基，再在37℃培養1小時。再8000×g離心培養基1分鐘，沉澱重懸於200μl LB培養基。然後將含有轉化細胞的懸浮液塗布到LB瓊脂板上，再在37℃培養18小時。
(5)轉化的大腸桿菌菌落的免疫學選擇在位於LB瓊脂板中的硝化纖維素(NC)紙上接種轉化的大腸桿菌，再在37℃培養18小時。然後，將3張3MM Whamann紙置於帶有菌落的NC紙上，並在3MM Whamann紙上放置新的NC紙。然後，再將3張3MM Whamann紙置於新的NC紙之上，這樣，在壓力下製備出NC紙的複製品。將原始的和複製的NC紙分別置於含有氨卞青黴素的LB瓊脂板上，並在37℃培養1小時。然後，為使蛋白表達，將複製的NC紙置於含有0.1mM IPTG和100μg/ml氨卞青黴素的LB瓊脂板上，再進一步培養3小時。
培養後，將NC紙暴露在充有氯仿的焊接玻璃瓶中10分鐘，然後通過將細胞浸泡在溶菌酶緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，5mMMgCl2，3％牛血清白蛋白(w/v，BSA)，溶菌酶400μg/ml以及Dnase 1U/ml)中約1小時使細胞破裂。然後，清洗NC紙表面後，再在溶菌酶緩衝液中培養1小時。然後用TBST緩衝液(20mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，0.05％Tween20)清洗NC紙兩遍，使用抗血清測試NC紙。
用TBST緩衝液清洗NC紙3次，再用3％牛血清白蛋白處理30分鐘，來阻斷不期望的反應。然後用TBST緩衝液稀釋抗恙蟲病東方體Boryong的血清到1/1000濃度，再在室溫下與上述NC紙反應30分鐘，再用TBST緩衝液進行三次10分鐘的清洗。TBST稀釋10000倍的二次抗體(鹼性磷酸酶連接的抗小鼠IgG，Promega S3721)與NC紙在室溫下反應10分鐘，再用TBST緩衝液進行三次10分鐘的清洗。該溶液與用3MM Whatmann紙過濾過的發色底物溶液(100mM Tris-HCl pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl2，0.3mg/ml氮藍四唑以及0.15mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate))混合，然後將該混合物在暗處培養5分鐘，產生陽性信號的檢測結果。
(6)聚丙烯醯胺凝膠電泳和western印記分析通過Laemmli改進的方法(Laemmli，1970)，如下進行聚丙烯醯胺凝膠電泳和western印記分析向含有0.1％SDS的0.37M Tris-HCl(pH8.0)溶液中加入丙烯醯胺和雙丙烯醯胺的混合物，用負壓去除空氣。分別以0.03％(w/v)和0.066％(w/v)的濃度向混合物中加入過硫酸銨和N，N，N，N-四亞甲基二胺，進行多聚反應獲得溶解凝膠。
然後，將丙烯醯胺和雙丙烯醯胺的混合物(30∶0.8)以5％的終濃度加入到含有0.1％SDS的0.125M Tris-HCl(pH6.8)中，這樣就獲得堆積的凝膠。然後，將該堆積的凝膠置於上述所獲的溶解凝膠上。
電泳所用的大腸桿菌蛋白按如下製備培養轉化的大腸桿菌18小時。該過夜培養的大腸桿菌在新培養基中稀釋100倍，並繼續培養直到600nm的OD值達到0.5。然後加入0.1mM IPTG，再進一步培養3小時。4℃，4000×g離心培養基20分鐘，棄上清。用50mMTris-HCl(pH7.4)清洗沉澱，離心後棄上清。然後，用樣品緩衝液(2％SDS，5％巰基乙醇，20％甘油，0.001％溴酚藍(w/v)，0.1M Tris-HCl pH6.8)懸浮含有大腸桿菌細胞的沉澱，再在100℃水浴加熱5分鐘。室溫下離心10分鐘後，在每個孔中用10μl收集的上清進行電泳。
電泳後，通過凝膠染色或免疫印記來鑑定蛋白質。
為進行凝膠染色，將凝膠浸泡在染料溶液中(水∶甲醇∶乙酸(5∶5∶2)和0.1％(w/v)Coomassie Brilliant Blue R250)1小時，加入脫色液(25％甲醇和10％乙酸)脫色2小時。
為進行免疫印記，將凝膠置於NC紙上，再在90V下遷移1小時。遷移後，通過免疫學方法可以檢測到NC紙上的蛋白質。
圖6是顯示編碼來源於恙蟲病東方體三種血清型Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的基因以插入到pTYB12載體的形式表達的電泳凝膠圖譜，其中，V代表來源於用pTYB12轉化的大腸桿菌ER2566的蛋白片段；G代表由用pTG3轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam的56kDa蛋白片段；P代表由用pTGP1轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam和Karp的56kDa蛋白片段的融合蛋白；T代表由用pTGPT2轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；圖7是顯示編碼來源於恙蟲病東方體三種血清型Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白的基因以插入到pET22b(+)載體的形式表達的電泳凝膠圖譜，其中，第1道代表由用pTGPT2轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；
第2道代表pET22b(+)轉化的大腸桿菌ER2566；第3道代表用pETb7轉化的大腸桿菌ER2566所表達的、來自Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白片段的融合蛋白；(7)分離和純化重組抗原(a)37℃過夜培養pTGPT2轉化的大腸桿菌，用相同的培養基稀釋培養物100倍，進一步培養。當600nm下培養物的OD值達到0.5時，加入0.3mMIPTG，再在4-37℃培養18-72小時。4℃，4000×g離心培養物15分鐘後，用溶解緩衝液(50mM Tris-HCl，30mM NaCl，0.2％Tween-20，10mM巰基乙醇，10mM EDTA，10mM EGTA pH7.0)懸浮沉澱。加入1mg/ml的溶菌酶後，在冰上溶解大腸桿菌30分鐘。然後將獲得的物質用超聲波儀以最小功率的50％超聲波處理1分鐘。4℃，9000×g離心30分鐘後，獲得上清。用與上述相同的方法，再將蛋白從沉澱中洗脫3次，混合收集的上清。然後，向上清混合物中加入等體積的含有0.05％Tween-20的柱緩衝液，分別將NaCl濃度和pH調整到0.5M和7.0。
2g親和層析樹脂(幾丁質等)與60ml柱緩衝液(20mM Tris-HCl，0.5MNaCl，1mM EDTA和1mM疊氮化鈉)混合，接下來在室溫下再水化30分鐘。用再水化的樹脂填充2.5×50cm的柱子後，用該柱體積3倍的柱緩衝液清洗柱子。然後，以1ml/分鐘的速度將大腸桿菌溶解液過柱，再用2倍體積的含有0.05％Tween-20的柱緩衝液清洗，然後只用2倍體積的柱緩衝液清洗。
收集每個洗脫組分的2ml洗脫液，混合，測定280nm下洗脫液的吸光值。收集OD值最高的10個洗脫組分，測定280nm和260nm的OD值來定量蛋白濃度。用下面的等式計算蛋白的濃度。
蛋白濃度(mg/ml)＝1.55×OD280nm-0.77×OD260nm圖8是顯示從pETb7載體轉化的大腸桿菌中純化融合蛋白的過程示意圖，該過程包括線性連接來自恙蟲病東方體Gilliam，Karp和Kato的56kDa蛋白，其中數字輪流代表片段數字，在進行點印記分析後，洗脫組分用小鼠抗血清進行免疫酶學染色。
(b)當用pETb7載體轉化大腸桿菌時，用下述方法純化重組融合蛋白。
在含有氨卞青黴素的LB培養基中37℃過夜培養pETb7轉化的大腸桿菌BL21(DE3)，用相同的LB培養基稀釋培養物100倍，進一步培養。當600nm的OD值達到0.6時，加入IPTG使其終濃度為0.3mM，再在37℃進一步培養3小時。5000×g離心培養物30分鐘後，棄上清。然後，用結合緩衝液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)重懸沉澱。超聲波處理重懸液以抽提蛋白，12000×g離心30分鐘以得到包含體形式的蛋白。在冰上孵育1小時使這些包含體在含有4M尿素的結合緩衝液中變性。16000×g離心30分鐘後，將上清應用於His-樹脂。
用於純化的His-樹脂數量約為2.5ml/100上清。將適量的樹脂填充在柱子裡，平衡柱子。然後，用樹脂體積3倍的無菌水通過該柱，再進一步通過5倍體積的電荷緩衝液(50mM NiSO4)，來製備帶電荷的樹脂。然後，加入足夠量的含有4M尿素的結合緩衝液平衡柱子。
接下來，將上述製備的蛋白懸浮液通過該柱，再通過10倍樹脂體積的含4M尿素的結合緩衝液，以去除非特異性結合蛋白。然後再通過6倍體積的含有4M尿素的清洗緩衝液(60mM咪唑，0.5M NaCl和Tris-HCl，pH7.9)以去除殘留的非特異性結合蛋白。然後再用含有4M尿素的洗脫緩衝液(1M咪唑，0.5M NaCl和20mM Tris-HCl，pH7.9)通過柱，接著收集洗脫組分。混合洗脫的蛋白組分並在碳酸鹽緩衝液中持續透析，以減少尿素濃度。最後去除了尿素的蛋白用於進行ELISA。
在用三倍於樹脂體積的剝離緩衝液(100mM EDTA，0.5M NaCl和20mMTris-HCl，pH7.9)通過樹脂以去除由Ni+引起的電荷後，樹脂可以重複使用。
6.ELISA方法上述製備的重組融合蛋白抗原用0.05M碳酸鹽緩衝液(pH9.6)稀釋到濃度為1.25μg/ml。然後，將200μl稀釋的抗原覆蓋到聚氯乙烯板96孔中的每個孔以進行EIA(TiterTek，平底，軟板)，再4℃培養18小時，使抗原粘附。然後，用含有0.05％Tween-20的磷酸緩衝液(下問中稱為「PBST」)將每個孔衝洗3次，加入5％脫脂牛奶室溫下阻斷不期望的反應1小時。
上述製備的血清以1∶100稀釋，在室溫下培養30分鐘，再用PBST清洗6次。當用PBST稀釋二次抗體(辣根過氧化物酶連接的抗小鼠IgG，辣根過氧化物酶連接的抗小鼠IgM；Jackson 109-035-003)10000倍後，室溫下培養孵育抗體30分鐘，然後用PBST清洗6次。
加入發色底物溶液(磷酸檸檬酸緩衝液，H2O20.4μl/ml，鄰苯二胺0.4mg/ml)，每個孔都被染色15分鐘，加入2M H2SO4停止顏色反應。然後使用ELISA閱讀儀(Dynatech MR 700)測定492nm的吸收值。
圖9是利用ELISA顯示融合蛋白抗原與來自恙蟲病患者或正常人的每種血清的反應性，所述融合蛋白抗原由編碼來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的線性連接基因所表達，其中，恙蟲病患者通過間接免疫螢光抗體測試(IFA)進行診斷。在圖9中，橫軸代表IFA分析的血清抗體的滴度；縱軸代表ELISA測定的吸收值。
圖10顯示使用重組融合蛋白抗原進行ELISA的靈敏度和特異性，所述融合蛋白抗原由編碼來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的線性連接基因所表達，其中診斷恙蟲病的靈敏度為93.6％，特異性為94.2％。
如上所述，使用本發明重組基因蛋白抗原診斷恙蟲病，具有很高的診斷靈敏度，並且具有與使用培養的恙蟲病東方體病原體作為診斷抗原的間接免疫螢光抗體方法同樣的特異性。所以，相對於使用單獨基因重組蛋白的傳統方法而言，本發明並不需要培養微生物，能獲得更靈敏的診斷效果，降低診斷費用，這樣，相對於使用許多單一基因重組蛋白的診斷而言，使用本發明融合蛋白進行的恙蟲病診斷可以降低診斷費用。
儘管上文已經詳細地說明了本發明優選的實施方式，但是應該清楚地知道改變和/或修飾本文所教導的基礎創造性概念對於本領域技術人員而言是顯而易見的，這些改變和修飾仍然屬於本發明如權利要求所定義的精神和範圍。
序列表110 株式會社太平洋製藥金翼祥成承鏞120 用於診斷恙蟲病的重組融合蛋白130 pct-010908150 KR2000-532692000-09-08160 6170 KopatentIn 1.71210 1211 24212 DNA213 人工序列220223 用於製備恙蟲病東方體抗原決定子蛋白的引物400 1ggacatatga ttactggtgc agaa 24210 2211 24212 DNA213 人工序列220223 用於製備恙蟲病東方體抗原決定子蛋白的引物400 2atcgtcgaca tttaaaagcc taac 24210 3211 24212 DNA213 人工序列220223 用於製備恙蟲病東方體抗原決定子蛋白的引物400 3gttgtcgacg gaatgattac tggc 24210 4211 24212 DNA213 人工序列220223 用於製備恙蟲病東方體抗原決定子蛋白的引物400 4ggcatgacaa aattgaattc tatc 24210 5211 24212 DNA213 人工序列220223 用於製備恙蟲病東方體抗原決定子蛋白的引物400 5gtcgttggag aattcattac tggc 24210 6211 21212 DNA213 人工序列220223 用於製備恙蟲病東方體抗原決定子蛋白的引物400 6ttgctgcccg ggcccctgct g 2權利要求
1.一種用於診斷恙蟲病的融合蛋白，其特徵在於融合兩個或多個來自恙蟲病東方體抗原決定部位的蛋白。
2.根據權利要求1的融合蛋白，其中所述兩個或多個蛋白來自恙蟲病東方體的56kDa蛋白。
3.根據權利要求1或2的融合蛋白，其中所述兩個或多個蛋白來自恙蟲病東方體異源血清型。
4.根據權利要求3的融合蛋白，其中所述兩個或多個蛋白來自恙蟲病東方體的Gilliam，Karp或Kato。
5.一種載體DNA，其特徵在於包含DNA片段，該片段包含編碼兩個或多個來自恙蟲病東方體抗原決定部位的蛋白的基因。
6.根據權利要求5的載體DNA，其中所述載體包含DNA片段，該片段包含編碼兩個或多個來自恙蟲病東方體56kDa蛋白的基因。
7.根據權利要求5至6的載體DNA，其中所述載體包括DNA片段，該片段包含編碼兩個或多個來自恙蟲病東方體異源血清型蛋白的基因。
8.根據權利要求7的載體DNA，其中所述載體包括DNA片段，該片段包含編碼兩個或多個來自恙蟲病東方體Gilliam，Karp或Kato的蛋白的基因。
9.根據權利要求8的載體，其中所述載體為pTGP1。
10.根據權利要求8的載體，其中所述載體為pTGPT2。
11.根據權利要求8的載體，其中所述載體為pETb7，其由韓國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為KCTC 10065BP。
12.用權利要求5-8中任一所描述的載體轉化的宿主細胞。
13.用於製備權利要求1-4中任一所描述的用於診斷恙蟲病的融合蛋白的方法，其特徵在於該方法包括培養用權利要求5-8中任一所描述的載體轉化的細胞的步驟。
14.根據權利要求12的方法，其中所述轉化的細胞是選自下述組中的至少一個大腸桿菌，酵母，真核細胞，動物組織細胞和植物組織細胞。
15.一種診斷恙蟲病的方法，其特徵在於使用權利要求1-4中任一所描述的融合蛋白。
16.一種用於診斷恙蟲病的組合物，其特徵在於含有權利要求1-4中任一所述的融合蛋白。
全文摘要
本發明涉及用於診斷恙蟲病的重組融合蛋白抗原，更具體地說，本發明涉及血清型診斷恙蟲病的方法，該方法使用重組融合蛋白抗原，所述重組融合蛋白抗原是以串聯嵌合物形式融合的兩個或多個來自恙蟲病東方體抗原決定部位的蛋白。
文檔編號C12P21/02GK1452635SQ01815344
公開日2003年10月29日 申請日期2001年9月7日 優先權日2000年9月8日
發明者金翼祥, 成承鏞 申請人:株式會社太平洋製藥, 金翼祥, 成承鏞