N-(4-(1氫-吡唑-4-)苯基)-2,3-二氫-1,4-苯並二噁烷-2-醯胺衍生物在製備治療青光眼...的製作方法

2023-04-27 20:45:46 2

專利名稱：N-(4-(1氫-吡唑-4-)苯基)-2,3-二氫-1,4-苯並二噁烷-2-醯胺衍生物在製備治療青光眼 ...的製作方法
技術領域：
本發明屬於有機合成及醫藥領域，特別涉及N- (4- (1氫-吡唑-4-)苯基)-2，3- 二 氫-1，4-苯並二噁烷-2-醯胺衍生物在製備治療青光眼的藥物中的用途。
背景技術：
青光眼是中國乃至世界最常見的致盲眼病之一。目前，中國人口的1-1. 5 %的人群 患有青光眼，其中60歲以上人群患病機率佔4%。2003年第四屆國際青光眼大會的統計資 料顯示，全球青光眼的致盲率已居致盲眼病的第二位。中國現有約1200萬青光眼患者，美 國約300萬青光眼患者，在國際醫學界，青光眼的致病機理尚不清楚，但眼壓增高是青光眼 患病的重要因素。眼壓增高后，會導致視網膜節細胞(RGC)死亡，從而致盲。目前用藥物或 手術降眼壓是臨床唯一治療青光眼病的緩解方法，現無可治癒藥物。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種N-(4_(l氫-吡唑-4-)苯基)-2，3_ 二
氫-1，4-苯並二噁烷-2-醯胺衍生物(式I所示)在製備治療青光眼藥物中的用途。 禮為-H或-CfflH(2ffl+1)，R2 為-H 或-CfflH(2ffl+1)，X 為 CfflH2ffl, m = 1 8。式I所示一類衍生物為已知化合物，可購買得到或通過現有製備方法製得。優選的，本發明式I所示的化合物中隊為-H或-CmH(2m+1)，R2為_H或-CmH(2m+1)，X為 CmH2m，m = 1 4。最優的，本發明式I所示的化合物中隊為-ch3，R2為-CH3，X為C2H4。本發明通過實驗證明N-(4_(l氫-吡唑-4_)苯基)-2，3_ 二氫-1，4_苯並二噁 烷-2-醯胺衍生物具有較好的降眼壓、保護神經節細胞的作用，可以在降眼壓的同時又起 到保護視神經和RGC的雙重作用，為製備治療青光眼的藥物提供一種新的選擇。


圖1是給藥後眼壓變化圖，a、R0CK001給藥組，b、PBS陰性對照組。圖 2 是降眼壓效果圖，a、R0CK001，b、R0CK002。圖3是Ne ii N染色結果圖，a是NMDA+R0CK001，b是NMDA+PBS，c是染色結果數據 分析圖，2 是 NMDA+R0CK001，1 是 NMDA+PBS，P < 0. 01。圖4是T ii j-1染色結果圖，a是NMDA+PBS，b是NMDA+R0CK001，c是染色結果數據 分析，2 是 NMDA+R0CK001，1 是 NMDA+PBS，P < 0. 001。圖5是TMNEL染色結果圖，a是NMDA+PBS，b是NMDA+R0CK001，c是染色結果數據 分析，2 是 NMDA+R0CK001，1 是 NMDA+PBS，P < 0. 001。圖 6 是 C57 小黑鼠用 R0CK001 治療效果圖，1 :NMDA+R0CK001 ；2 NMDA+PBS, P = 0. 009。圖7是有視神經損傷的C57小黑鼠用R0CK001治療效果圖，1 :R0CK001 ；2 :PBS，P < 0. 05。
具體實施例方式RhoA是小分子GTP酶家族的一員，其功能像分子開關，調節肌動蛋白細胞骨架的 組織、細胞黏合、細胞運動、基因表達等多種細胞生理過程，Rho激酶(Rho-kinase，ROCK) 是一種絲氨酸、絡氨酸激酶，是目前研究最清楚的RhoA下遊效應分子，具有R0CK1和R0CK2 兩種亞型，每種亞型自N端依次含有激酶催化結構域(kinase domain), Rho蛋白結合結構 (Rho binding domain，RBD)、PH結構(pleckstrin homology domain)和半胱氨酸富集結構 域(cysteine rich repeat domain，CRD)，其中催化結構域的同源性高達92%。然而，兩種 亞型PH結構的同源性僅為65 70 %，可能解釋了他們細胞內定位和功能的差異，R0CK002、 R0CK001 分別阻斷 R0CK1、R0CK2。本發明通過實驗驗證N-(2-(2_( 二甲基胺基)乙氧基)-4_(lH-吡唑-4-)苯 基)-2，3_ 二氫-1，4-苯並二噁烷-2-醯胺(R0CK001，如下式所示)作為通式I這類化合物 的典型化合物具有降眼壓、保護神經節細胞的作用。從藥學上課推斷此類通式I化合物均 具備相應新用途。 實驗例IN-(2-(2-(二甲基胺基)乙氧基)-4_(lH-吡唑-4-)苯基)_2，3_ 二氫-1， 4_苯並二噁烷-2-醯胺(R0CK001)的降眼壓作用1、實驗動物飼養管理屏障系統Sprag u e-Dawley大鼠15隻(雌10隻、雄5隻)，體重180 220克，年 齡6 7周齡，查體無明顯歪頸，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏。入室大鼠試驗前先適應環境並檢疫一周，選擇健康(雌性須未孕)動物作為受試 動物，檢疫內容是否與訂購時要求的質量指標一致；體溫、攝食量、血生化、電解質；動物 一般狀態；動物體重是否達到試驗要求體重的範圍。室溫空調保持22 24°C (日溫差彡4°C )，相對溼度60 70% (55士 15% )。每 5隻同一性別於不鏽鋼金屬籠具中分籠飼養。12小時明暗交替，換氣次數8 10次/小時。 大鼠餵飼全價顆粒配合飼料，反滲透水自由飲用，飼養條件符合國標GB14925-2001。每天清洗糞盤一次，保持大鼠的生活環境乾燥乾淨，每周更換並清洗食鬥、每月消 毒籠具一次。全價顆料鼠料、飲水自由採食。每天觀察一般情況，重點觀察眼部，適應性飼 養1周後用於實驗。按體重、性別隨機分為3組，每組5隻。用苦味酸分別標記大鼠，見表1。表1實驗動物標記 2、實驗儀器及試劑見表2、3 表2 表 3 3實驗藥物表面點眼藥物標號見表4:表 4 4、實驗方法實驗分組，左右眼分別為實驗組和對照組。表5點藥表 基準眼壓測定選取實驗地晝夜長短較為相似的秋冬季10 12月進行本實驗。為減小眼壓測定 次數過頻對實驗動物正常生理節律的影響，本實驗分兩天測定9:00、12:00、15:00眼壓做 出日間眼壓變化曲線，確定眼壓最高時間點給藥。測定清醒狀態下各動物眼壓，測眼壓時，實驗溫度保持室溫，相對溼度70%左右， 光照強度日間保持200LX左右，夜間保持10LX左右。為避免感染，眼壓測定後滴0. 3%左氧氟沙星滴眼液抗菌。給藥前/後觀察與檢查4. 1. 一般觀察、眼科肉眼觀察內容一般狀態觀察內容A、中樞神經系統表情呆滯或不安，對刺激反應遲緩、減弱、消失、或對刺激反應過 敏，興奮，強直。行動姿態有無改變或異常，叫聲異常，震顫、共濟失調等。B、自主神經系統瞳孔縮小、放大，分泌增多，流涎，流淚。C、呼吸系統鼻孔流鼻涕，呼吸頻數減慢，呼吸困難，潮式呼吸，或呼吸速率加快寸。D、心血管系統心動加速、緩慢，心律不齊，心跳過強、過弱。E、胃腸系統食量變化，飲水變化，氣脹，腹灣，便秘，糞便不成形，糞便黑色，嘔吐， 流涎等。F、生殖系統乳腺膨脹，外生殖器汙濁，陰囊下垂等。G、泌尿系統尿頻、尿急，小便顏色。H、皮膚、被毛皮膚發紅、充血，出血性紫紺，被毛松亂等(皮疹)。I、黏膜口腔流粘液、充血、潰瘍。J、其它體表溫度升高、降低，消瘦，禁食。眼科眼部檢查(檢查眼瞼、淚器、結膜、眼球位置及運動、眼眶)、眼球前段檢查 (檢查角膜、鞏膜、虹膜、瞳孔及晶狀體)、檢眼鏡檢查(檢查視盤、視網膜血管)。眼瞼是否 水腫，上瞼下垂，眼球突出，混濁等，瞼緣是否有分泌物，晶體是否透明等。體重每7天稱一次體重。4. 2.裂隙燈觀察給藥後、24、48小時行裂隙燈檢查，觀察眼前節及後節有無炎症反應，藥物表達情 況，以及其它異常變化，並進行裂隙燈活體顯微鏡照相。具體觀察內容
檢查時間同上，按以下方式記錄角膜和前房的炎症反應角膜水腫_正常；+角膜水腫厚度增加；++角膜渾濁水腫，仍可見虹膜；+++角膜 渾濁水腫，中央虹膜窺不見；角膜後沉著物KP -正常；+極少KP ；++散在的，細小KP ；+++瀰漫的，中等大小的 KP ； ；++++簇狀大塊KP;房水閃輝_正常；+極少量；++中度；+++重度，但無纖維成分；++++重度，可見纖 維成分或聚集成團塊狀；結膜充血_正常；+輕度；++中度；+++重度；++++混合充血；4. 3.眼壓測量眼壓測定給藥後0h、0. 5h、lh、2h、3h、6h每天同一時間用Tonolab眼壓計測量眼 壓，並作圖對比。4. 4實驗數據處理本實驗所有計數計量數據均使用SPSS 17. 0和Micsoft Office 2003Excel軟體 進行統計學分析。1)動物的一側眼作受試眼，對側眼作對照眼或者一隻眼作為其自身對照，在給予 載體前後比較眼壓的變化。用標準統計(St indent t-檢驗，配對t檢驗，回歸分析，方差分 析)分析。2)形態觀察結果分析則以照相，描述為主。3)實驗過程中及時書寫實驗記錄，並階段性的製作實驗報告。實驗結果沒有觀察到全身及局部、眼部的副作用。R0CK001 與 PBS 結果分析R-R0CK001給藥組用R0CK001 120uM,6u 1點眼後，給藥後0. 5小時，眼壓無明 顯變化。給藥後1小時眼壓值開始下降，給藥後2、3小時眼壓值繼續下降，給藥後6小時眼 壓逐漸上升，給藥後24小時基本回到基線眼壓。PBS陰性對照組眼壓值無明顯變化。同一時間點給藥組(R-R0CK001)與對照組(L-PBS)對比結果顯示給藥後0. 5小 時，眼壓無明顯變化，與PBS對照組對比，無統計學意義，P = 0. 654;給藥後2小時眼壓值下 降明顯，給藥組和對照組相比，有統計學意義(P = 0. 001,P < 0. 05)；給藥後3小時眼壓繼 續下降，給藥組和對照組相比P < 0. 001 ；給藥後6小時眼壓繼續下降，給藥組和對照組相 比 P < 0. 001。同一組內給藥前後對比結果顯示R-R0CK001給藥組用R0CK001，120 ii M，6 yl點 眼後，給藥後0. 5小時，眼壓無明顯變化；給藥後1小時眼壓值開始下降，給藥後2、3小時眼 壓值繼續下降，給藥後6小時眼壓逐漸上升，給藥後24小時基本回到基線眼壓.給藥後0. 5 小時，眼壓無明顯變化，與給藥前眼壓值對比，無統計學意義，P = 0. 756 ；給藥後1小時眼壓 值開始下降，與給藥前對比，有統計學意義(P = 0. 007，P < 0. 05)，給藥後2小時眼壓值繼 續下降，與給藥前對比，有統計學意義(P = 0. 001，P < 0. 05)，給藥後3小時眼壓值繼續下 降，與給藥前對比，有統計學意義(P = 0. 001，P< 0.05)；給藥後6小時眼壓逐漸上升，與 給藥前對比，有統計學意義，(P = 0. 006，P < 0. 05)；給藥後24小時與給藥前對比，無統計
8學意義，(P = 1. 167，P > 0.05)L-PBS對照組各個時間點給藥前後對比P > 0. 05，尚不能說明PBS對照組給藥前
後眼壓值有變化。R0CK001與R0CK002分析結果見圖2，R0CK001降低眼壓的作用比無選擇性的 R0CK002 優越。實驗例2R0CK001的神經節細胞的保護作用動物及麻醉1. Sprag li e-Dawley 大鼠屏障系統Sprag u e-Dawley大鼠8隻(雌4隻、雄4隻)，體重180 220克，年齡 6 7周齡，查體無明顯歪頸，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏。全身麻醉腹腔注射，10%水合氯醛(0. 3ml/100g體重)麻醉。眼部麻醉0. 4%鹽酸奧布卡因滴眼液(倍諾喜)滴入結膜囊2 3次作角膜表面 麻醉。術前準備0. 3%左氧氟沙星滴眼液(海倫)滴入結膜囊3次作術眼準備，用碘伏消 毒術眼手術區。玻璃體腔給藥Hamilton-10 u 1微量注射器2支按實驗設計分別抽取NMDA+R0CK0015 u 1和對照 NMDA (N-methyl-D-aspartic acid,天冬氛酸)5 y 1 備用。麻醉後的大鼠置於手術臺上，在手術顯微鏡下，自顳上方，用Hamilton-lOiU微 量注射器於背側角膜緣後1mm處經睫狀體平坦部刺穿眼球壁後以50°左右的斜角進入眼 內，針尖始終向後朝向視神經，在相當於赤道部處，經瞳孔區可見針尖，避免損傷晶狀體和 視網膜，緩慢注入藥液或對照液，推注完畢針頭至少停留3秒鐘後緩慢抽出，術眼塗以紅 黴素眼膏。對照組給予NMDA(4mM) 5u 1,治療組給予NMDA(8mM) 2. 5 u 1+R0CK001 (40 y M原 液)2. 5iil。最終眼內的R0CK001濃度是4iiM。組織病理形態學檢查大鼠玻璃體注射後5天，以腹腔注射過量水合氯醛的方式處死大鼠，對動物外觀 及眼組織進行肉眼觀察，並記錄，取出眼球進行形態學分析神經節細胞觀察5隻大鼠行視網膜全層鋪片，其中4隻行Ty jl，l只行Ne yN染 色計數正常視網膜神經節細胞RGC。處死大鼠後，標記12點方位結膜，摘除眼球；將眼球固 定於4%多聚甲醛中1小時；PBS中漂洗兩次；去除角膜、晶狀體、玻璃體，0.2M PBS液中於 顯微鏡下小心剝取視網膜；根據標記，分別於視網膜的上方、顳側、鼻側、下方做4個放射狀 切口，將同一大鼠雙眼視網膜鋪於一張0. 1 %明膠玻片上，玻璃體面朝上，用小毛筆尖小心 清除視網膜上殘存玻璃體；待視網膜鋪片幹後，分別行NeyN、TMJ1染色，染色結果見圖3、 圖4。統計結果Ne ii N顯示，雙眼Ne y N染色結果的RGC數進行統計學分析，P < 0. 05， 實驗組(NMDA+R0CK001)和造模組(NMDA)比較顯示結果有統計學差異。即對於NMDA引起 的視網膜神經節細胞形態和數量的改變，R0CK001具有保護作用(圖3)。統計結果Tyj-1 顯示左右眼RGC數進行統計學分析，P < 0. 05，實驗組(NMDA+R0CK001)和造模組(NMDA) 比較顯示結果有統計學差異。即對於NMDA引起的視網膜神經節細胞形態和數量的改變， R0CK001具有保護作用(圖4)。
神經節細胞凋亡檢測3隻大鼠，TMNEL檢測視網膜鋪片的細胞凋亡，觀察凋亡位 置，分別計數距視乳頭500 u m到1. 5mm間(或者1 1. 5mm) GCL和INL層凋亡細胞數，鋪 片四個象限取平均值。雙眼TMNEL染色結果統計學分析，P < 0. 05,實驗組(NMDA+R0CK001)和造模組 (NMDA)比較顯示結果有統計學差異。R0CK001組凋亡明顯減少(圖5)。2. C57 小黑鼠在這些小鼠實驗中，我們通過將全視網膜組織鋪片，Tujl染色來分析視網膜神經 節細胞存活情況，與前述在大鼠中的實驗類似。對照組給予lPl NMDA (4mM)，治療組給予 0. 5u lNMDA(4mM)和0. 5 yl A(40yM原液)。最終的玻璃體腔R0CK001終濃度為4 y M， NMDA4mM，實驗結果見圖6。3. C57小鼠視神經損傷模型的建立小鼠視神經壓榨損傷模型的建立方法見以往文獻(Park et al. , Science, 2008).，簡述為在手術顯微鏡下剪開顳上方球結膜，輕輕向後分離至球後區，暴露視神經， 分離周圍肌肉，脂肪組織，為保持眼球血供，注意勿損傷其下面的眼動脈，用jeweler』 s鑷 夾持球後1 2mm，視神經，時間10s，造成視神經損傷。對照組給予1 yl PBS，治療組給予 1 ill A (20 ii M原液)，玻璃體腔終濃度為A 4 ii M。參照上述方法試驗，對照組給予1 P 1 PBS後，治療組給予1 ii 1 R0CK001 (20 y M原 液)，最終的玻璃體腔R0CK001終濃度為4 y M。實驗結果見圖7。
權利要求
式I所示N-(4-(1氫-吡唑-4-)苯基)-2，3-二氫-1，4-苯並二噁烷-2-醯胺衍生物在製備治療青光眼藥物中的用途，R1為-H或-CmH(2m+1)，R2為-H或-CmH(2m+1)，X為CmH2m，m＝1～8。FDA0000023355810000011.tif
1.式I所示N-(4-(1氫-吡唑-4-)苯基)_2，3-二氫-1，4-苯並二噁烷-2-醯胺衍生R為-H 或-CffiH(2ffl+1)，R2 為-H 或-CmH(2lll+1)，X 為 CmH2m，m = 1 8。
2.根據權利要求丄所述的用途，其特徵在於:Rl為-H或-CmH(aii+i)，R2為_H或_CmH一， x 為 CmH2m，m = 1 4。
3.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於Ri為-洱，Ra為_Ch3，x為c^。
全文摘要
本發明屬於有機合成及醫藥領域，特別涉及N-(4-(1氫-吡唑-4-)苯基)-2，3-二氫-1，4-苯並二噁烷-2-醯胺衍生物在製備治療青光眼的藥物中的用途。本發明通過實驗證明式I所示N-(4-(1氫-吡唑-4-)苯基)-2，3-二氫-1，4-苯並二噁烷-2-醯胺衍生物具有較好的降眼壓、保護神經節細胞的作用，可以在降眼壓的同時又起到保護視神經和RGC的雙重作用，為製備治療青光眼的藥物提供一種新的選擇。
文檔編號A61P27/06GK101879161SQ20101022725
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者張康 申請人:張康