一種中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液及其製備和應用的製作方法
2023-04-27 15:23:21 2
一種中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液及其製備和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液及其製備和應用，中草藥為五倍子，通過抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌篩選試驗，五倍子可以抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌生長，運用枯草芽孢桿菌AP139對五倍子進行發酵，在動物養殖舍中進行噴霧，發酵後中草藥對空氣中多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌生長具有顯著的抑制特性，效果優於枯草芽孢桿菌AP139單獨發酵組和中草藥對照組，具有較好的應用前景。CCTCC NO:M 20140532014.02.28
【專利說明】一種中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液及其製備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物發酵殺菌劑領域，具體涉及一種中草藥五倍子的枯草芽孢桿菌 發酵液及其製備方法，和其用於抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的應用。
【背景技術】
[0002] 多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌是畜、禽、野生動物和人類的一種重要共患性病 原體，主要通過呼吸道傳播。多殺性巴氏桿菌可引發禽霍亂、豬肺疫和牛出血型敗血症等， 產毒多殺性巴氏桿菌還可引起豬萎縮性鼻炎，金黃色葡萄球菌可引起奶牛乳腺炎、食品汙 染、傷口化膿等。金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌遍布空氣、水、人畜排洩物，在畜禽養殖 場中普遍存在多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌，在不使用抗生素的畜禽舍發病率較高。
[0003] 隨著畜禽養殖集約化和規模化程度不斷提高，養殖場空氣品質逐漸降低，多殺性 巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌引起動物發病的概率和損害程度不斷增加。目前，養殖場對多 殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌引起的疾病進行控制主要通過抗生素進行預防和治療。然 而，抗生素的大量使用引起內源性感染和二重感染、細菌耐藥菌株的產生、畜禽免疫力下降 和畜產品及環境中殘留引起二次汙染等一系列嚴重問題，很多國家和地區比如歐盟和韓國 都已經禁止使用抗生素。因此，如何在對人和環境影響較小或不影響的條件下，有效預防多 殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的感染與傳播，是一個急需解決的問題。
[0004] 本發明研製的中草藥枯草芽孢桿菌發酵液能有效抑制畜禽養殖場中多殺性巴氏 桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，降低畜禽養殖場多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌發病 率，減少常規消毒劑的使用，具有環保、無毒副作用等優點，在我國養殖業生產中具有良好 的應用前景。
【發明內容】
[0005] 本發明的主要目的是提供一種中草藥五倍子的枯草芽孢桿菌發酵液及其製備和 應用方法，該發酵液能顯著的抑制養殖舍中多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌的生長繁殖， 降低養殖場由多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌引起的發病率，減少畜禽養殖場消毒劑和 抗生素的使用。
[0006] -種中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法：由保藏編號為CCTCCN0:M 2014053的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)AP139和中草藥五倍子進行液體發酵培養 製成。
[0007] 上述方法發酵培養後枯草芽孢桿菌含量為108CFU/ml-109CFU/ml。
[0008] 上述方法中五倍子添加質量比例為液體發酵培養基的1-5%。
[0009] 上述方法具體是將經過搖瓶培養所得到的枯草芽孢桿菌AP139液體培養液，按照 液體發酵培養基體積百分比1-5%接種量，接種到發酵罐中，液體發酵培養基成分及質量百 分比為：細菌學蛋白腖1%、氯化鈉0. 5%、葡萄糖1%，七水硫酸鎂1%，五倍子粉1-5%，pH 值自然；發酵條件為：裝液量體積百分比40-70%，發酵溫度30-40°C，pH值自然，發酵時間 24-36h，轉速，200-400r/min。
[0010] 上述方法發酵前先將保存的枯草芽孢桿菌AP139進行復活：
[0011] 枯草芽孢桿菌AP139在LB固體培養基上，在恆溫生化培養箱中進行劃線培養， 培養溫度30-37°C，培養時間18-24h ;LB固體培養基成分及質量百分比為：細菌學蛋白腖 1 %、酵母浸出物〇? 5%、氯化鈉0? 5%、瓊脂粉L 5%，pH值6. 8-7. 2。
[0012] 然後從LB固體培養基上挑取復活的枯草芽孢桿菌AP139單個克隆株至裝有100 毫升LB液體培養基的500毫升錐形瓶中，在恆溫生化搖床中進行培養，得到枯草芽孢桿菌 AP139液體培養液，培養溫度30-37°C，轉速180-220r/min，培養時間18-24h，LB液體培養基 成分及質量百分比為：細菌學蛋白腖1 %、酵母浸出物〇. 5%、氯化鈉0. 5%，pH值6. 8-7. 2。
[0013] 上述方法使用的中草藥五倍子在烘箱中烘乾，烘乾溫度75-80°C，烘乾時間1-2 天；用粉碎機粉碎至300目備用。
[0014] 一種中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液，是由上述的方法製備而成的。
[0015] 所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液用於抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球 菌，或者用於製備抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的製劑。具體是用於製備養殖舍 消毒的製劑或者動物飼料的添加劑。
[0016] 將所述枯草芽孢桿菌中草藥發酵液製備成溶液（枯草芽孢桿菌含量為5 X IO8CFU/ ml)，1000倍稀釋後在養殖舍中進行噴霧，噴霧後養殖舍枯草芽孢桿菌AP139的濃度為 5X 105CFU/m3,噴霧後，養殖舍中的多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌的含量顯著降低。
[0017] 本發明的有益效果在於：
[0018] 本發明的中草藥五倍子的枯草芽孢桿菌發酵液能通過抑制空氣多殺性巴氏桿菌 和金黃色葡萄球菌生長繁殖，降低多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌發病率和危害程度。
[0019] 本發明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)AP139的篩選
[0020] 從動物腸道中分離得到200多株芽孢桿菌，分別對這200多株芽孢桿菌進行大腸 桿菌、金黃色葡萄球菌、副傷寒沙門氏菌、巴氏桿菌439 (低毒巴氏桿菌）、巴氏桿菌2010 (中 毒巴氏桿菌）、巴氏桿菌2011 (強毒巴氏桿菌）抑菌試驗，結果芽孢桿菌139菌株對巴氏杆 菌的抑制效果最佳，達到18-25_，芽孢桿菌139菌株經生化及分子生物學鑑定為枯草芽孢 桿菌，並將其命名為枯草芽孢桿菌AP139。
[0021] 表1、部分芽孢桿菌菌株對巴氏桿菌及其它致病菌的抑制效果
[0022]
【權利要求】
1. 一種中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，其特徵在於：由保藏編號為CCTCC NO:M 2014053的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)AP139和中草藥五倍子進行液體發酵 培養製成。
2. 根據權利要求1所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，其特徵在於：發 酵培養後枯草芽孢桿菌含量為l〇8_l〇9CFU/ml。
3. 根據權利要求1所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，其特徵在於：五 倍子添加質量比例為液體發酵培養基的1-5%。
4. 根據權利要求1所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，其特徵在於：將 經過搖瓶培養所得到的枯草芽孢桿菌AP139液體培養液，按照液體發酵培養基體積百分比 1-5%接種量，接種到發酵罐中，液體發酵培養基成分及質量百分比為：細菌學蛋白腖1%、 氯化鈉0. 5%、葡萄糖1 %，七水硫酸鎂1 %，五倍子粉1-5%，pH值自然；發酵條件為：裝液 量體積百分比40-70%，發酵溫度30-401：，口11值自然，發酵時間24-3611，轉速，200-4001'/ min〇
5. 根據權利要求4所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，其特徵在於：發 酵前先將保存的枯草芽孢桿菌AP139進行復活： 枯草芽孢桿菌AP139在LB固體培養基上，在恆溫生化培養箱中進行劃線培養，培養溫 度30-37°C，培養時間18-24h ;LB固體培養基成分及質量百分比為：細菌學蛋白腖1%、酵 母浸出物〇? 5%、氯化鈉0? 5%、瓊脂粉1. 5%，pH值6. 8-7. 2。
6. 根據權利要求5所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，其特徵在於：從 LB固體培養基上挑取復活的枯草芽孢桿菌AP139單個克隆株至裝有100毫升LB液體培養 基的500毫升錐形瓶中，在恆溫生化搖床中進行培養，得到枯草芽孢桿菌AP139液體培養 液，培養溫度30-37°C，轉速180-220r/min，培養時間18-24h，LB液體培養基成分及質量百 分比為：細菌學蛋白腖1 %、酵母浸出物0. 5%、氯化鈉0. 5%，pH值6. 8-7. 2。
7. 根據權利要求1所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，其特徵在於：中 草藥五倍子在烘箱中烘乾，烘乾溫度75-80°C，烘乾時間1-2天；用粉碎機粉碎至300目備 用。
8. -種中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液，其特徵在於，是由權利要求1-7任一項所述的 方法製備而成的。
9. 權利要求8所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的應用方法，其特徵在於，所述的 中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液用於抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌，或者用於製備 抑制多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的製劑。
10. 根據權利要求9所述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液的應用方法，其特徵在於，所 述的中草藥的枯草芽孢桿菌發酵液用於製備養殖舍消毒的製劑或者動物飼料的添加劑。
【文檔編號】A61K35/64GK104351472SQ201410537587
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月13日 優先權日:2014年10月13日
【發明者】舒燕, 王昇平, 劉惠知, 郭照輝, 張德元, 鄔理洋, 周映華, 胡新旭, 高書鋒, 周小玲, 繆東, 曾發姣 申請人:湖南省微生物研究院