一種o型口蹄疫分子標記疫苗及其製備方法

2023-04-27 12:11:41 4

專利名稱：一種o型口蹄疫分子標記疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及的是ー種O型ロ蹄疫分子標記疫苗及其製備方法。
背景技術：
ロ蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是危害偶蹄動物的烈性傳染病，尤其對主要畜種豬、牛、羊的危害特別嚴重，能造成畜種生產カ下降和不良的社會影響，社會經濟損失巨大。因該病傳染性極強，世界動物衛生組織(FA0/0IE)將其列為頭號必報烈性傳染病，國際貿易予以嚴格限制。我國將該病列為ー類動物傳染病之首。在世界上許多國家，尤其是非洲、亞洲和南美洲國家，該病發生次數頻繁，流行嚴重。此外，不時出現全球的流行性爆發。ロ蹄疫的病原是ロ蹄疫病韋(foot-and-mouth disease virus, FMDV)。ロ蹄疫病毒有7個血清型(A，O, C，Asial，SATl，SAT2和SAT3)，各型中又有許多基因和抗原性有差異的分離株，差異主要表現在結構蛋白VPl上。VPl是ロ蹄疫病毒的主要抗原表位區，能激發產生主要的中和抗體。ロ蹄疫病毒血清型由結構蛋白決定，非結構蛋白無血清型之分。和大多數病毒一祥，ロ蹄疫病毒的基因組上既有組成病毒粒子的結構蛋白基因，也有僅參與複製過程而非病毒粒子成分的非結構蛋白基因(non-structure proteins, NSPs)(Forss b,btrebe丄 K,Beck E,et al. Nucleotide sequence and genome organization oifoot-and-mouth disease virus,Nucleic Acids Research, 1984,12 :6587-6601,AcharyaR，Fry E，Stuart D I，et al. The three-dimersional structure of foot and mouthdisease virus at 2.9人.Nature，1989，337 :709-716)。ロ蹄疫病毒感染動物後，在體內大量複製時，既能產生結構蛋白(VP4, VP2，VP3和VP1)，也能產生非結構蛋白(L，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D 以及ー些非結構蛋白的前體蛋白，如 3AB，3ABC) (Belsham GJ. Distinctiveieatures of foot-and-mouth disease virus, a member of the picornavirus family ；aspects of virus protein synthesis,protein processing and structure. Prog BiophyMol Biol，1993,60 :241-260.)。兩者作為抗原，刺激動物體產生相應的抗體。因此，感染動物體內既有結構蛋白抗體，也有非結構蛋白抗體。據此，可以判定動物是否感染(過)ロ蹄疫病毒。ロ蹄疫病毒感染動物可變成無症狀的病毒攜帯者，是ロ蹄疫傳播的一大隱患。因此，除患病動物外，無症狀的病毒攜帯者成為預防和控制ロ蹄疫的重點監控對象。預防和控制ロ蹄疫採取的措施是嚴格檢疫，進出ロ限制，屠宰患病動物，及有計劃地實施疫苗免疫易感動物。檢疫的技術難題是如何區分感染動物和免疫動物。目前，區分ロ蹄疫感染動物和免疫動物的策略是檢測ロ蹄疫病毒非結構蛋白抗體。其理論依據是ロ蹄疫病毒在感染動物體內複製產生的非結構蛋白，刺激動物體產生相應的抗體；而疫苗免疫動物的血清中檢測不到相應的抗體，因疫苗製造エ藝的除細胞碎片環節去除了大部分非結構蛋白。研究表明，在眾多非結構蛋白中，檢測3AB或3ABC抗體區分感染動物和免疫動物的可信度最高(Sorensen KJ, Madsen KA, Madsen EA, et al..Differentntiation of infection irom vaccination in foot-and-mouth disease bythe detection of antibodies to the non—structural proteins 3D，3AB and 3ABC inELISA using antigens expressed in baculovirus. Arch Virol,1998,143 :1-16,)。因此，國際上多個實驗室建立了不同模式的檢測3AB、3A或3ABC抗體ELISA方法(AlfonsoしIavi jo，Peter WrightiPaul Kitchmg, et al. Developments in diagnostic techniquesfor differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease. TheVeterinary Journal，2004，167 :9 22.)。世界動物衛生組織(FA0/0IE)的動物疫病診斷手冊中推薦應用該法(Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrialanimals，http\\www. oie. int)。ロ蹄疫免疫常用疫苗是滅活疫苗。該苗的生產採用的是病毒接種細胞、組織培養物，病毒増殖後，收穫培養物，加化學滅活劑(如ニこ烯亞胺，BEI)使病毒失去感染性，與佐劑混合乳化製成疫苗。病毒在細胞內増殖，結構蛋白和非結構蛋白同時表達，但部分非結構蛋白的ー個可能的特性是與細胞膜成份結合，在疫苗製造エ藝的除細胞碎片環節去除了。然而，游離的，以及與病毒粒子大小相近的非結構蛋白複合物是難以清除的，在疫苗中或多或少的殘留，多次免疫動物後也能產生相應的抗體(Bergmann I E,Malirat E V,NeitzertE，Beck N，et al. Improvement oi a serodiagnostic strategy for foot-and-mouthdisease virus surveillance in cattle under systematic vaccination a combinedsystem of an indirect ELISA—3ABC with an enzyme—丄inked immunoelectrotransferblot assay. Arch Virol，2000，145 :473 489)，給區分感染動物和免疫動物帶來了障礙。世界動物衛生組織(FA0/0IE)的動物疫苗手冊中將ロ蹄疫疫苗免疫動物3次能否產生非結構蛋白抗體，作為疫苗評價的一項指標(Manual of diagnostic tests and vaccines forterrestrial animals, http\\www. oie. int)。ロ蹄疫滅活疫苗的製造要動用活病毒，考慮到嚴格的生物安全，已開始了 ロ蹄疫基因工程疫苗的研製和使用。但ー些基因工程疫苗也使用了 ロ蹄疫病毒的ー些非結構蛋白
因(Abrams C C,King A M Q,Belsham G J. Assembly of foot-and-mouth disease virusempty capsids synthesized by a vaccinia virus expression system. J Gen Virol,1995,76 :3089-3098.),在疫苗中存有這些非結構蛋白，多次免疫動物後也能產生相應的抗體，同樣給區分感染動物和免疫動物帶來了障礙。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供ー種O型ロ蹄疫分子標記疫苗及其製備方法。本發明的技術方案如下ー種O型ロ蹄疫分子標記疫苗，標記疫苗種毒為rV-0/3Ad病毒，rV_0/3Ad的基因組序列為SEQ ID NO :2，所述rV-0/3Ad病毒含3A91 114位胺基酸的缺失，並且含有緬甸98VP1胺基酸 序列。所述的O型ロ蹄疫分子標記疫苗的製備方法，包括以下步驟:A1、O型ロ蹄疫病毒基因組RNA全長cDNA重組質粒構建；A2、置換VPl基因和缺失3A蛋白91 114胺基酸編碼區的O型ロ蹄疫病毒基因組全長CDNA重組質粒構建；A3、拯救缺失3A蛋白91 114位胺基酸編碼區的基因工程病毒，作為標記疫苗種毒。A4、利用針對3A蛋白91 114胺基酸的單克隆抗體建立的競爭ELISA方法可以鑑別該疫苗毒株免疫動物與ロ蹄疫病毒自然感染動物。用本發明方法得到的疫苗免疫動物5次後，動物血清中檢測不到缺失3A 91 114位優勢表位的抗體。因此，用本發明方法得到的疫苗免疫動物，能準確區分感染動物和免疫動物


圖I為FMDV 0ZK/93-08株全長cDNA分子克隆的構建策略，圖中文字中間刪除線表示改變了原序列中限制性內切酶位點；圖2為重組質粒p0MQ-Z123的EcoR I酶切鑑定.1，重組質粒酶切後電泳條帶；M，DNA分子質量標準電泳條帶；圖3為重組質粒pSK-Z4D NotI和BglII酶切鑑定.1，重組質粒酶切後電泳條帶；M, DNA分子質量標準電泳條帶；圖4為重組質粒p0MQ-Z1234D EcoR I酶切鑑定.1，重組質粒酶切後電泳條帶；M，DNA分子質量標準電泳條帶；圖5為含嵌合緬甸98vpl並含3A胺基酸缺失的ozk/93全長克隆的構建示意圖；圖6為病毒rV-0/3Ad感染BHK-21細胞後引起的CPE. A，正常BHK-21細胞；B，出現CPE的細胞；圖7為拯救病毒rV_0/3Ad與0ZK/933A蛋白胺基酸的比對；圖8為拯救病毒rV_0/3Ad與0ZK/93VP1蛋白胺基酸的比對；圖9為間接免疫螢光檢測拯救病毒在BHK上的複製 ふ，接種rV_0/3Ad病毒的BHK-21細胞；B，未接種病毒的BHK-21細胞；圖10為電鏡下rV_0/3Ad拯救病毒粒子；
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。一、O型ロ蹄疫病毒基因組RNA全長cDNA重組質粒構建設計合成下列寡核苷酸引物，按圖I策略構建O型ロ蹄疫病毒0ZK/93-08株基因組RNA全長cDNA重組質粒。Zl agactagttaatacgactcactatagggttgaaagggggcgctagggt(SEQ ID NO 4)Zl-2 tggttggggggggggggggggtgaa(SEQ ID NO 5)Z2 ttcaccccccccccccccccaacca(SEQ ID NO :6)Z2-2 agcgtggagtcgagcacagtac(SEQ ID NO :7)Z3 ggtctaagcaggtttccacaactg(SEQ ID NO :8)Z3-2 aactgcagtgcttcgtgctgccctttctcaatg(SEQ ID NO :9)TA gctaagcttggaactccacgaaaaggtgtcga(SEQ ID NO :10)
Z4-2 ttggcgcgccgcggccgcttttttttttttttttttttt(SEQ ID NO :11)Tl gaaaacgcctgaggccgccgcacactgcatt(SEQ ID NO :12)Tl-2 aatgcagtgtgcggcggcctcaggcgttttc(SEQ ID NO :13)T2 gtgaagaagatatctgactcgctctccagt (SEQ ID NO :14)
T2-2 actggagagcgagtcagatatcttcttcac(SEQ ID NO :15)提取ロ蹄疫病毒0ZK/93-08株(購買自國家農業部指定的ロ蹄疫病毒保藏機構國家ロ蹄疫參考實驗室)的總RNA，分別用Z2-2、Z3-2和Z4-2引物，合成第一鏈cDNA。以第ー鏈cDNA為模板，用4對引物Zl/Zl-2、Z2/Z2-2、Z3/Z3-2和Z4/Z4-2，擴增獲得4個相互重疊的cDNA雙鏈片段，分別命名為ZlcDNA、Z2cDNA、Z3cDNA和Z4cDNA片段。Z3cDNA和pBluescript II SK-質粒載體(Invitrogen公司)分別用XbaI和BglII消化後連接，得到重組質粒PSK-Z3。Z4cDNA和pBluescript II SK-質粒載體分別用Bglll/Notl消化後連接，得到重組質粒PSK-Z4。利用QuikChangeOLightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司)定點突變試劑盒，以引物對T1/T1-2和T2/T2-2進行定點突變引入分子標籤。分別依次突變了重組質粒PSK-Z3中2985位的NotI位點和4238位的BglII位點，得到陽性重組質粒 p0ZKF-Z3。ZlcDNA和Z2cDNA混合作模板，用一對引物Z1/Z2-2進行融合PCR，得Z12cDNA。Z12cDNA與pMD20-T質粒(大連寶生物公司)連接，得到重組質粒pMD_Z12。pMD_Z12和pBluescript II SKhdv質粒載體(Invitrogen公司)分別用KpnI/Xbal雙酶切消化後，純化回收相應的目的片段，連接得到重組質粒P0ZKF-Z12。用Bglll/Xbal分別雙酶切消化重組質粒P0ZKF-Z12和p0ZKF-Z3，純化回收相應的目的片段，連接得到重組質粒p0ZKF_Z123。最後用Bglll/Notl消化重組質粒p0ZKF-Z123和Z4cDNA片段，純化回收，連接得到含ロ蹄疫病毒0ZK/93-08株全基因組cDNA克隆的重組質粒p0ZKF_Z1234。測得p0ZKF_Z1234的核酸序列見SEQ ID NO :1，即ロ蹄疫病毒0ZK/93-08株全基因組序列(SEQ ID N0:1;結構蛋白VPl基因序列位於3228-3867，3A蛋白基因序列位於5332-5760，3A的91 114位胺基酸編碼序列位於5602-5643 )。ニ、置換VPl基因和缺失3A蛋白91 114胺基酸編碼區的O型ロ蹄疫病毒基因組全長cDNA重組質粒構建考慮到近年的ロ蹄疫優勢流行毒為緬甸98系，為增強本發明的適用性，將P0ZKF-Z1234中ロ蹄疫病毒的主要抗原表位區VPl基因置換，並缺失3A蛋白91 114胺基酸編碼區。設計合成下列寡核苷酸引物(用於構建嵌合緬甸98病毒VPl序列所用的引物)並由上海桑尼有限公司合成E2888 (+) CAACCTACACTTCATGTTCACAGG(SEQ ID NO 16)MQVPl(-) CTCGCCTGTCGAAGTGGTCTGCGTGCGGGCGTCAAC(SEQ ID NO 17)MQVP1(+) GTTGACGCCCGCACGCAGACCACTTCGACAGGCGAG(SEQ ID NO :18)MQVP2(-) CTTGAGGAGGTCGAAGTTCAGAAGCTGTTTTGCGGG(SEQ ID NO :19)MQVP2(+) CCCGCAAAACAGCTTCTGAACTTCGACCTCCTCAAG(SEQ ID NO :20)
E4183(-) ACCGGTGTCAGCTAGCATGA(SEQ ID NO :21)0Z5269 (+) CAAGAAGTGATTGAGCGGGT(SEQ ID NO :22)0ZD91(-) GCGCTGGCGCCACTCGCCTCCAGTGAGTCATCCACTGACT(SEQ ID NO :23)0ZD91(+) AGTCAGTGGATGACTCACTGGAGGCGAGTGGCGCCAGCGC(SEQ ID NO :24)0Z681K-) TTTGTCCTCTTCAGACATCT (SEQ ID NO :25)I)根據樣品量，按下表列量混合試劑進行反轉錄；
權利要求
1.一種O型口蹄疫分子標記疫苗，其特徵在於，標記疫苗種毒為rV-0/3Ad病毒，rV-0/3Ad的基因組序列為SEQ ID NO :2，所述rV_0/3Ad病毒含3A 91 114位胺基酸的缺失，並且含有緬甸98 VPl胺基酸序列。
2.根據權利要求I所述的O型口蹄疫分子標記疫苗的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟A1、0型口蹄疫病毒基因組RNA全長cDNA重組質粒構建；A2、置換VPl基因和缺失3A蛋白91 114胺基酸編碼區的O型口蹄疫病毒基因組全長cDNA重組質粒構建；A3、拯救缺失3A蛋白91 114位胺基酸編碼區的基因工程病毒，作為標記疫苗種毒；A4、利用針對3A蛋白91 114胺基酸的單克隆抗體建立的競爭ELISA方法可以鑑別該疫苗毒株免疫動物與口蹄疫病毒自然感染動物。
全文摘要
本發明公開了一種O型口蹄疫分子標記疫苗，標記疫苗種毒為rV-O/3Ad病毒，rV-O/3Ad的基因組序列為SEQ ID NO2，所述rV-O/3Ad病毒含3A 91～114位胺基酸的缺失，並且含有緬甸98 VP1胺基酸序列。用本發明方法得到的疫苗免疫動物5次後，動物血清中檢測不到缺失3A 91～114位優勢表位的抗體。因此，用本發明方法得到的疫苗免疫動物，能準確區分感染動物和免疫動物。
文檔編號A61P31/14GK102614507SQ20121003598
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月17日 優先權日2012年2月17日
發明者付元芳, 劉在新, 包慧芳, 盧曾軍, 孫普, 曹軼梅, 李冬, 李平花, 殷宏, 白興文, 謝寶霞, 陳應理 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所