一種SPON1-1蛋白片段及其在人源包蟲病中的應用的製作方法

2023-04-27 22:40:08 4

一種spon1-1蛋白片段及其在人源包蟲病中的應用
技術領域
1.本發明涉及屬於免疫醫學領域，特別涉及一種多肽即人源包蟲病新抗原spon1-1蛋白片段、重組蛋白或其突變、核酸序列及其在製備檢測或治療人源包蟲病的藥物中的應用。


背景技術：

2.包蟲病又名棘球蚴病，是一種人畜共患病，在中國中西部地區(西藏、青海、四川、新疆等地)感染尤其嚴重。人源包蟲病主要分為囊型包蟲病和泡型包蟲病。影像學檢測是最直觀最常用的包蟲病診斷方法，但是由於包蟲病的潛伏期較長，並且只有在包蟲病形成的包囊大到一定程度時才能夠通過影像學檢測到，所以血清學檢測是影像學診斷包蟲病的重要輔助手段之一。目前，可以被用來診斷包蟲病的血清學診斷抗原主要有抗原b(antigen b)和抗原5(antigen 5)以及與這兩種抗原相關的一些重組抗原。
3.從包蟲病人術後分離的包蟲囊中提取包蟲蛋白並鑑定，本身是一個技術難點。如果鑑定到的包蟲蛋白本身種類就很少，想從中選取可能作為包蟲抗原的蛋白將更加困難。
4.其次，單一抗原種類少。目前最廣泛應用的包蟲病診斷抗原是antigenb和antigen5，許多研究表明這兩種抗原在血清檢測時會產生一定的假陽性或假陰性。
5.商品化包蟲抗原是天然純化抗原，分離純化自細粒棘球蚴破碎後的可溶性抗原片段，是一種包含多種包蟲蛋白的混合物。混合的蛋白越多越容易在血清檢測時產生更多假陰性或假陽性的結果。


技術實現要素：

6.為解決現有技術中包蟲蛋白提取和鑑定困難、包蟲抗原少等技術缺陷，本發明提供了一種多肽即人源包蟲病新抗原spon1-1蛋白片段、重組蛋白或其突變、核酸序列及其在製備檢測或治療人源包蟲病的藥物中的應用。本發明通過尋找更多可以用來診斷包蟲病的抗原，擴充包蟲抗原資料庫，使這些抗原或單一或組合都有可能提升實驗室診斷包蟲病的特異性和靈敏性。
7.本發明第一方面提供了一種多肽，其中，所述多肽包含如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的胺基酸序列的一種或多種。
8.本發明第二方面提供了一種重組蛋白或其突變，其中，所述重組蛋白包含如seq id no:7所示的胺基酸序列；所述突變的胺基酸序列與所述重組蛋白的胺基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％的同一性，並維持所述重組蛋白的功能。
9.本發明第三方面提供了一種分離的核酸，其中，所述分離的核酸編碼本發明第一方面所述的多肽或本發明第二方面所述的重組蛋白或其突變。
10.在一些優選的實施方式中，編碼所述的重組蛋白的核苷酸序列如seq id no:8所示。
11.本發明第四方面提供了一種重組表達載體，其中，所述重組表達載體包含本發明第三方面所述的分離的核酸。
12.本發明第五方面提供了一種轉化體，其包含如本發明第三方面所述的分離的核酸或本發明第四方面所述的重組表達載體，其中，所述轉化體為細菌或真核細胞。
13.在一些優選的實施方式中，所述細菌為e.coli bl21。
14.在一些更優選的實施方式中，所述轉化體包含如seq id no:7所示的胺基酸序列。
15.本發明第六方面提供了一種用於檢測包蟲病的試劑盒，其中，所述試劑盒包括本發明第一方面所述的多肽或本發明第二方面所述的重組蛋白或其突變。
16.在一些優選的實施方式中，所述試劑盒為間接elisa檢測試劑盒。
17.在一些更優選的實施方式中，所述間接elisa檢測試劑盒還包括第二抗體、包被液、洗液、顯色液、終止液和稀釋液。
18.本發明第七方面提供了一種標誌物組合，其中，所述標誌物組合包括本發明第一方面所述的多肽或本發明第二方面所述的重組蛋白或其突變。
19.在一些優選的實施方式中，所述標誌物組合還包括egr、抗原b和抗原5中的一種或多種。
20.本發明第八方面提供了一種抗包蟲病的sirna或mrna疫苗，其中，所述sirna或mrna疫苗包含與編碼本發明第一方面所述的多肽或本發明第二方面所述的重組蛋白或其突變的核苷酸序列互補的rna序列。
21.本發明第九方面提供了一種生產本發明第一方面所述的多肽或本發明第二方面所述的重組蛋白或其突變的方法，其中，所述方法包括以下步驟：將本發明第五方面所述的轉化體培養於適合其發酵的條件下，使其表達所述多肽或重組蛋白或其突變。
22.本發明第十方面提供了一種本發明第一方面所述的多肽或本發明第二方面所述的重組蛋白或其突變或本發明第七方面所述的標誌物組合在製備抗包蟲病抗體或在診斷細粒棘球蚴所致疾病的診斷劑中的應用。
23.在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
24.本發明所用試劑和原料均市售可得。
25.本發明的積極進步效果在於：
26.(1)提供了一個包蟲新抗原spon1-1，其可用來製作elisa試劑盒並用於臨床檢測人源包蟲病；並可以與egr抗原作為互相補充，對包蟲病進行更靈敏的檢測。
27.(2)所述包蟲新抗原可大量純化，方便大規模篩選人源包蟲病。
附圖說明
28.圖1為五個囊液組分提取到的全蛋白的sds-page和western blotting結果展示。其中，左圖是以no.1病人血清作為一抗、五個囊液組分作為抗原的wb結果展示。中圖是以正常西藏人血清作為一抗、五個囊液組分作為抗原的wb結果展示。右圖是五個囊液組分的蛋白凝膠結果展示。
29.圖2為spon1-1重組蛋白的純化結果展示。圖中所示為spon1-1重組蛋白的梯度洗脫結果，每個泳道上樣量均為10μl。每個泳道依次分別指的是超聲後菌體全蛋白、鎳柱上樣
後的流穿、20mm咪唑至1m咪唑洗脫梯度。
30.圖3為純化後spon1-1重組蛋白的wb驗證實驗結果展示。數字1-9指9個在進行包蟲囊摘除術前取的病人血清。control指未患病的正常西藏人血清。egr_sds-page是指商品化抗原egr的蛋白凝膠結果展示,箭頭所指蛋白條帶為antigen b。
31.圖4為elisa實驗結果展示。spon1-1_od(+)和egr_od(+)指的是607例b超陽性血漿的od值，spon1-1_od(-)和egr_od(-)指的是636例正常人血漿的od值。
32.圖5為roc曲線結果展示。左圖為spon1-1的roc曲線，criterion是指spon1-1對血清檢測時，大於0.68是陽性(患包蟲病)，小於等於0.68是陰性(未患包蟲病)。右圖為egr的roc曲線，criterion是指egr對血清檢測時，大於0.99是陽性(患包蟲病)，小於等於0.99是陰性(未患包蟲病)。
具體實施方式
33.下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
34.實施例1：包蟲病人術後分離的包蟲囊鑑定到更多包蟲蛋白的過程
35.(1)首先將10個包蟲病人術後分離的包蟲囊根據其組織結構分為四部分提取蛋白，由內向外分別是原頭蚴、囊液、生發層和角皮層；又根據其是否處於活性期，將10個包蟲囊分為活性包蟲囊組和非活性包蟲囊組。
36.(2)每個包蟲囊的四個組分均進行了蛋白提取，並將提取的蛋白進行液態酶解，隨後使用qe質譜儀進行lc-ms/ms鑑定；
37.(3)qe下機的原始數據使用maxquant蛋白鑑定軟體，使用人和包蟲蛋白資料庫合集，進行包蟲蛋白質鑑定，統計鑑定結果並確定包蟲蛋白含量多的包蟲囊部分，結果如表1和表2所示；
38.(4)由表1和表2可知，有兩點基本結論：一是鑑定到包蟲蛋白更多的組織部分是囊液和原頭蚴這兩個部分；二是只有活性包蟲囊組的囊液和原頭蚴部分提取的蛋白中包含有更多的包蟲蛋白。
39.表1活性包蟲囊組的蛋白質鑑定結果
[0040][0041]
_1表示原頭蚴；_2表示囊液；_3表示生發層；_4表示角皮層。
[0042]
表2非活性包蟲囊組的蛋白質鑑定結果
[0043][0044][0045]
_1表示原頭蚴；_2表示囊液；_3表示生發層；_4表示角皮層。
[0046]
實施例2：western blot驗證、切膠酶解並質譜鑑定(gelc-ms/ms)
[0047]
(1)接下來，根據10個樣本的囊液和原頭蚴的qe鑑定結果，我們選取no.1-no.5五個活性包蟲囊組的原頭蚴和囊液組分分別進行與病人血清的wb實驗，以便驗證包蟲病人和正常西藏人血清與提取的全蛋白之間是否有免疫反應。
[0048]
(2)因部分樣本的原頭蚴組分提取到的蛋白總量很少，故主要進行了囊液組分蛋白的western blotting實驗，結果如圖1所示，以no.1病人血清為例展示，包蟲病人和正常
西藏人血清與5個囊液組分蛋白的免疫反應圖譜。其他病人血清和正常西藏人血清對5個樣本蛋白的免疫反應圖譜均與no.1病人相似。
[0049]
(3)又根據這5個囊液組分的sds-page圖譜，我們對照wb的免疫條帶對sds-page膠進行了切膠酶解，以期能夠通過切膠分離鑑定到相應分子量區段裡的更多包蟲蛋白，增加找到與血清發生免疫反應的包蟲抗原的機率。另外，這樣可以減少高豐度蛋白對鑑定的影響。
[0050]
(4)為了減少損失和減輕工作量，我們統一將5個囊液組分蛋白根據wb免疫條帶分成了10個組分，隨後各組分分別進行了膠內酶解。
[0051]
(5)經過qe-hf-x質譜儀的lc-ms/ms分析後，maxquant軟體使用與2.2.1中相同的資料庫進行了蛋白搜庫鑑定。結果如表3所示。
[0052]
(6)通過數據分析可知，1_2、2_2和5_2這三個樣本切膠分離所鑑定到的包蟲蛋白包含了其餘四個樣本所鑑定到的包蟲蛋白，所以，後續包蟲抗原的候選從這三個樣本各組分共同鑑定到的包蟲蛋白中尋找。
[0053]
表3五個囊液組分切膠酶解的蛋白質鑑定結果
[0054][0055]
括號中的數字表示總鑑定出的蛋白質，而括號外的數字表示每個組分中的包蟲蛋白。_2表示囊液。
[0056]
實施例3：篩選作為候選抗原的包蟲蛋白
[0057]
(1)同一組分在三個樣本中鑑定到的共同蛋白作為候選抗原庫，最終10個組分一共產生了93個唯一蛋白。
[0058]
(2)這93個蛋白首先與人的蛋白資料庫進行同源比對，刪除同源性特別高的蛋白和已經被選為包蟲抗原的那些蛋白後，剩餘的蛋白進行b細胞抗原表位的預測。
[0059]
實施例4：抗原表位預測以及重組質粒構建
[0060]
(1)抗原表位預測使用了一個在線預測工具http://tools.iedb.org/bcell/，將蛋白質序列導入，選擇bepipred linear epitope prediction 2.0預測方法，即可得到關於此蛋白可能成為抗原表位的序列列表。
[0061]
(2)我們根據每一個候選蛋白的抗原表位列表，選取包含一個或多個表位的序列片段組成重組蛋白的序列，並且將此序列導入比對工具中與人的蛋白質資料庫進行比對，只有與人的蛋白相似度《＝20％的序列片段才被選為構建重組蛋白。
[0062]
(3)最終14個蛋白序列片段通過分子克隆技術插入到pet-30a(+)質粒中構建重組質粒，並通過測序確認片段已被插入。
[0063]
實施例5：重組蛋白的表達與純化
[0064]
(1)重組質粒轉入bl21(de3)中進行小量試表達，確認蛋白可以表達且分子量正確後，再進行擴培。
[0065]
(2)收集的菌液經過超聲提取蛋白後，再通過質粒攜帶的his-tag進行鎳柱純化，圖2展示了本發明spon1-1片段構建的重組蛋白的純化結果。
[0066]
實施例6：spon1-1重組蛋白的western blotting驗證
[0067]
(1)14個重組蛋白中有8個表達成功，因此純化後的8種重組蛋白均分別與9個術後病人血清進行了western blotting實驗，結果顯示只有4個重組蛋白與病人血清免疫反應較大，其中包含spon1-1重組蛋白，後續使用spon1-1重組蛋白作為包蟲抗原候選進行更多病人血清的elisa驗證試驗。
[0068]
(2)圖1實驗證明，囊液全蛋白對病人血清存在強烈的免疫反應，而對正常西藏人血清基本無反應，且絕大部分引起免疫反應的蛋白條帶不是高豐度蛋白條帶；圖3展示了spon1-1重組蛋白和商品化抗原egr與9個病人血清的wb實驗結果，spon1-1重組蛋白的免疫反應率為78％，商品化抗原的免疫反應率為67％(只統計43kd和34kd之間有明顯條帶的樣本)。表4展示了這種重組蛋白的b細胞抗原表位、核苷酸序列和胺基酸序列。
[0069]
表4 spon1-1重組蛋白的b細胞抗原表位、核苷酸序列和胺基酸序列
[0070][0071][0072]
實施例7：重組抗原spon1-1重組蛋白的elisa實驗
[0073]
所檢測的對象為607例b超陽性血漿(含疑似)和636例正常人血漿(確定為陰性)，
按照間接elisa的標準操作步驟進行實施，結果顯示spon1-1重組蛋白陽性檢出率為84％，陰性檢出率為89％；而用商品化抗原egr(產品名稱：包蟲純化抗原echinococcus granulosus，貨號：ym-vi08，供應商：杭州億米諾生物科技有限公司)檢測相同的血漿時陽性檢出率為86％，陰性檢出率為92％。
[0074]
1、elisa實驗具體操作步驟
[0075]
(1)抗原定量：每種抗原在包被前均使用移液槍吹勻，並使用微量紫外分光光度計給抗原定量，以確保蛋白未降解。在a280處無吸收峰，則說明抗原量很低不宜用於包被；若蛋白析出或有不溶，則滴加8m尿素後吹勻，離心取上清測濃度。
[0076]
(2)包被：對比抗原管壁濃度及測量值，就低取值；包被量為2μg/ml、10ml/板，按照實際使用量配製包被抗原量；包被的elisa板上標記：抗原編號、名稱、標籤、包被日期及板子編號等，若包被濃度不是2μg/ml則需要標明包被濃度。標記完elisa板後，加入包被抗原，100μl/孔，4℃包被過夜或37℃包被2h。
[0077]
(3)洗板：包被完的板子，用洗板機洗板1次，於吸水紙上拍幹。50x洗液配方為：tris 154.4g，nacl 149.0g，tween 20 24.0ml，純水800ml，約45ml濃鹽酸調ph7.2，純水定容到1000ml。4℃保存。
[0078]
(4)封閉：2％脫脂奶粉作為封閉液進行封閉，200μl/孔，4℃封閉過夜或37℃封閉2h。
[0079]
(5)洗板：封閉完的板子，用洗板機洗板1次，於吸水紙上拍幹。
[0080]
(6)加一抗：加入相應一抗，使用pbs按照比例1：500稀釋血漿，37℃孵育1h。
[0081]
(7)洗板：用洗板機洗板3次以上，於吸水紙上拍幹。
[0082]
(8)加二抗(廠商：碧雲天；貨號：a0201)：因一抗來源為人的血漿，故二抗使用山羊抗人1：500加入，37℃孵育1h。
[0083]
(9)洗板：用洗板機洗板3次以上，於吸水紙上拍幹。洗板同時，配製好顯色液(tmb)。
[0084]
(10)顯色：準備好終止液後，加入顯色液100μl/孔，可以晃動板子加速顯色過程並注意密切觀察。
[0085]
(11)tmb顯色：顯色到一定程度時(一般不能讓空白和陰性顯色太高)，加入50μl/孔終止液，加入終止液後需要靜置10min以上，使終止徹底、顏色均一(可以晃動板子加速終止過程)，終止後讀數
[0086]
(12)讀數：酶標儀必須預熱30min以上；tmb顯色檢測波長為：450nm。打開相應的酶標儀測量軟體,讀數。將數據存儲到指定位置並完善數據。
[0087]
(13)注意事項：
[0088]
96孔板用槍加樣時，注意避免產生氣泡，並且避免所加樣品掛壁。
[0089]
加完樣，整板觀察，要求孔底無氣泡；發現氣泡時，震蕩板子或用槍頭去除氣泡。
[0090]
洗板時需密切關注，確保洗板完全、徹底。
[0091]
顯色時需密切關注，結合陰性、空白、陽性對照的顯色情況，及時終止。
[0092]
(14)各種試劑配方
[0093]
包被液：碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液，ph9.6：na2co
3 1.59g，nahco
3 2.93g，純水定容至1000ml；最後用ph試紙檢測ph值。4℃保存。
[0094]
2、elisa結果分析
[0095]
(1)陰陽性判斷標準：選取陰性血清樣本的平均值(x)，標準差(sd),其置信區間上限cut-off值為x+2sd。待測樣本在450nm處的od值大於等於x+2sd可判為陽性，小於x+2sd可判為陰性。
[0096]
(2)roc曲線：使用medcalc軟體(版本19.4.0)繪製roc曲線(receiver operating characteristic curve)評估抗原的最優檢測效力。
[0097]
(3)通過計算，使用本發明的包蟲抗原免疫607例b超陽性血漿(含疑似)和636例正常人血漿(確定為陰性)，其敏感性為84％，特異性為89％；而用商品化抗原egr(以下簡稱商品化抗原或egr)檢測相同的血漿時敏感性為86％，特異性為92％。圖4展示了spon1-1重組蛋白和egr的roc曲線以及檢測od值的箱型圖。
[0098]
(4)雖然spon1-1重組蛋白的特異性略低於商品化抗原的特異性，但是spon1-1重組蛋白敏感性與商品化抗原基本持平，且經過medcalc軟體分析可以得到spon1-1重組抗原和egr的雙特徵roc曲線，由圖可知，兩種抗原一起的檢測效力非常好。說明spon1-1重組抗原很可能可以作為商品化抗原的補充檢測對未被商品化抗原檢測出陽性的樣本進行再檢測，所以spon1-1重組蛋白可以作為包蟲新抗原候選。