人細胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人細胞膜抗原的製作方法
2023-04-27 16:32:16 2
專利名稱：人細胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人細胞膜抗原的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別是涉及細胞膜的保存方法。
背景技術：
對人體細胞膜抗原及其特異性抗體的研究和檢測是生物科學、免疫學實驗研究和臨床檢測的最基本內容之一。如對人體細胞膜HLA抗原、CD標記物的研究是人類免疫學最基本的基礎和應用研究之一，對人ABO和Rh血型抗原和抗體檢測是臨床常規檢測項目。一些人體細胞膜抗原的生物特徵，如抗原性依賴於細胞的活性，往往細胞死亡，溶解，抗原性即消失，如紅細胞死亡，Rh血型抗原抗原性消失，人體內也不存在可溶性Rh血型抗原。Rh血型抗原也不能被提純，因為它們是紅細胞膜結構蛋白，脫離了細胞膜其抗原性也消失。因此，對Rh血型抗體的檢測，必須應用有活力的紅細胞。對人ABO血型抗體的檢測，也稱之為ABO血型反定型，在全世界各國至今都是應用新鮮紅細胞作為標準抗原，而新鮮紅細胞保存期很短，最長保存期3至6個月，而且在此期間，抗原性也遞減。保存紅細胞活性，即保持其抗原性，長期以來是生命科學、免疫學未能很好解決的問題，至今一些保存紅細胞方法，如低溫冷凍(在低溫冰箱和液氮中)，很難大量凍存，只能由此類方法保存的少量標本，如對稀有紅細胞血型的紅細胞保存。細胞凍存時間愈長，其抗原性愈弱，愈易消失。凍幹紅細胞與紅細胞液態低溫保存比較，理論上應該是凍幹紅細胞抗原性保持時間要長，即使有少數研究紅細胞凍幹的報告文章，但至今還未能夠得到實際應用。
由上所述，人體細胞膜抗原的抗原性長期保持的問題，以及對其有效應用至今都未能解決。而這些問題表現為細胞膜抗原的抗原性依賴於細胞本身的活性，即存活的細胞有抗原性，死亡的細胞，細胞膜抗原性消失。至今最為常用的是低溫(冰箱和液氮)保存方式，也只是在一定時期內，維持細胞膜的抗原性，僅適用於對少量特別珍貴的細胞標本的保存。
技術內容
本發明提供一種使細胞膜抗原在不依賴細胞的活性條件下，完整地保持其抗原性的人細胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人細胞膜抗原。
本發明的具體過程是
一、紅細胞抗原的製備
①取新鮮紅細胞，離心去上清。取壓積紅細胞進入下一步處理；
②在壓積紅細胞中加入SDS置於室溫狀態；
③然後進行離心去上清，留沉澱物加入蒸餾水；
二、磁性粒子的製備
①金屬鹽的溶解，將FeCL2及FeCL3加入蒸餾水中進行溶解；
②金屬鹽的水解，在劇烈攪拌的狀態下，將氫氧化鈉加入到上述金屬鹽溶液中，使其水解為金屬複合氧化物，也就是鐵顆粒溶液；
三、細胞膜抗原包被磁性粒子
將步驟一獲得的紅細胞膜抗原加入到步驟二獲得的鐵顆粒溶液中，再加入聚乙二醇，進行孵育，離心後棄上清，留沉澱，再在沉澱物中加入低滲磷酸緩衝液，即得包被了磁性粒子的細胞膜抗原。
本發明由上述保存方法所獲得的包被了磁性粒子的細胞膜抗原。
本發明是使細胞膜抗原在不依賴細胞的活性條件下，完整地保持其抗原性，本發明採用的技術方案是即應用四氧化三鐵顆粒取代人體細胞膜內容物，而保持細胞膜抗原的抗原性。包被細胞膜抗原的四氧化三鐵顆粒具有磁性，在磁場作用下，在反應介質中與相應抗體發生了特異性免疫反應的細胞膜抗原抗體複合物被分離出來，進而可以通過免疫凝集反應技術，或者通過免疫標記檢測技術(包括酶聯免疫分析技術、免疫螢光分析技術、同位素免疫分析技術、免疫發光技術等)，用肉眼或儀器設備進行分析判斷細胞膜抗原和抗體免疫反應。
本發明以磁性粒子改造活的人體細胞為無活性細胞，但保持了細胞膜抗原的抗原性。無限期保存的該磁性粒子具有原人體細胞膜抗原的抗原性，包括紅細胞、血小板、白細胞等人體細胞膜抗原。同時對於分離和分析液體介質中顆粒性抗原抗體反應比常規離心技術要簡單，易於操作和觀察結果，更有效率。
具體實施例方式
本發明具體過程是
一、紅細胞抗原的製備
①取新鮮紅細胞，離心去上清。取壓積紅細胞進入下一步處理；
②在壓積紅細胞中加入SDS置於室溫狀態；
③然後進行離心去上清，留沉澱物加入蒸餾水；
二、磁性粒子的製備
①金屬鹽的溶解，將FeCL2及FeCL3加入蒸餾水中進行溶解；
②金屬鹽的水解，在劇烈攪拌的狀態下，將氫氧化鈉加入到上述金屬鹽溶液中，使其水解為金屬複合氧化物，也就是鐵顆粒溶液；
三、細胞膜抗原包被磁性粒子
將步驟一獲得的紅細胞膜抗原加入到步驟二獲得的鐵顆粒溶液中，再加入聚乙二醇，進行孵育，離心後棄上清，留沉澱，再在沉澱物中加入低滲磷酸緩衝液，即得包被了磁性粒子的細胞膜抗原。
由上述保存方法所獲得的包被了磁性粒子的細胞膜抗原。
1.包被磁性粒子保存完整性紅細胞膜血型抗原
1.1.紅細胞膜抗原的製備
(1)取3人份人新鮮紅細胞，每人3ml，共9ml，離心3000轉/分鐘，去上清，取壓積紅細胞5ml，留樣0.5ml，將4.5ml進入下步處理。
(2)壓積紅細胞中加入1％SDS40ml，置室溫30分鐘。
(3)離心，2000轉/分鐘，10分鐘，去上清，留沉澱，加入10ml蒸餾水。
1.2.磁性粒子的製備
1.2.1金屬鹽的溶解
將適量的FeCL2及FeCL3加入上述蒸餾水中，溶解。
1.2.2.金屬鹽的水解
劇烈攪拌下，向上述金屬鹽溶液中加入適量的氫氧化鈉，使上述金屬鹽溶解水解為金屬複合氧化物。
1.3.細胞膜抗原包被磁性粒子
(1)將步驟1製備的紅細胞膜10ml中加入鐵顆粒溶液3ml。
(2)加入聚乙二醇(分子量4000，濃度50％)1ml。
(3)56℃孵育1小時。
(4)離心3000轉/分鐘，棄上清，留沉澱。
(5)沉澱中加入低滲磷酸緩衝液10ml，(PB PH7.4)。
(6)分裝上述溶液。
(7)凍幹細胞膜包被的鐵顆粒。凍幹後置4℃保存。
1.4.檢測包被磁性顆粒後保存紅細胞膜血型抗原的完整性。
材料1抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e單克隆血型抗體試劑。
材料21.1(1)步留下的新鮮紅細胞，做為對照。
材料3凍幹的紅細胞膜包被的鐵顆粒。
材料4磷酸鹽緩衝液(0.15M，PH7.4)。
方法試管血凝試驗
①應用磷酸鹽緩衝液3ml將凍幹的磁性顆粒紅細胞膜溶解。
②應用磷酸鹽緩衝液將新鮮紅細胞配成2％濃度懸液。
③取抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e單克隆血型抗體試劑。
④以2％新鮮紅細胞懸液與抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e單克隆抗體反應，作為對照。
⑤將磁性顆粒0.10ml分別與不同稀釋倍數的抗A、抗B、抗D、抗C、抗c、抗E、抗e單克隆抗體0.05ml滴入試管中。
⑥置室溫20分鐘，離心1000rpm/轉，觀察結果。
合格標準見下表
2.應用
2.1、以96孔U型板凝集試驗ABO血型為反定型為例說明其對完全抗體的檢測。。
(1)液體試劑直接使用；凍幹試劑需復甦1ml蒸餾水加入凍幹磁性粒子粉劑中。
(2)取96孔U型板，每孔滴入50ul被檢血清(漿)。
(3)每孔加入相應的磁性粒子各50ul。
(4)置磁力分離器上分離10-20秒。
(5)置震蕩器上震蕩1分鐘。
(6)肉眼觀察凝集，出現凝集孔為血清中含有磁珠上包被的細胞膜抗原相應特異性抗體，為陽性反應。未出現凝集的孔為血清中不含有相應特異性抗體，為陰性反應。
2.2、對血清(漿)標本中不完全抗體的檢測，以檢測RhD血型抗-D抗體為例
(1)(2)(3)(4)(5)步同2.1。
(6)加入完全抗體性質的抗-D(單克隆抗體)。
(7)震蕩出現凝集反應為陰性反應。未出現凝集反應為陽性反應。
試驗記錄
分別取100微升A.Bcell+100微升3％磁粒混合 多數細胞未磁化，有完整細胞
分別取100微升A.Bcell+200微升3％磁粒混合 多數細胞磁化，有完整細胞
分別取100微升A.Bcell+300微升3％磁粒混合 多數細胞磁化，有完整細胞
將未磁化的細胞取出+100微升3％磁粒——細胞全部溶血。
將A、B磁化細胞分別合併，用鹽水洗滌1次，檢測。
檢測
1、A細胞倍化稀釋16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍
2、B細胞倍化稀釋16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍
注磁化的A、B細胞本身有凝集。
分別取譜細胞1、2、3、4、5、6、7、8種，各100毫升，分別加入300毫升3％磁粒，用生理鹽水洗2次。
用完全抗體檢測抗原特異性
lewis抗原性較弱，正常及磁化細胞未檢出。
反定型試劑的穩定性
分別提取支A、B反定型試劑，於沸水浴中煮0.5h、1h、2h、2.5h後檢測其抗原性
檢測結果煮沸1h，A、B磁化細胞為正常磁化細胞抗原性無明顯差別，2h抗原性下降。
權利要求
1、一種磁性粒子包被人細胞膜抗原的保存方法，其具體過程是
一、紅細胞抗原的製備
①取新鮮紅細胞，離心去上清。取壓積紅細胞進入下一步處理；
②在壓積紅細胞中加入SDS置於室溫狀態；
③然後進行離心去上清，留沉澱物加入蒸餾水；
二、磁性粒子的製備
①金屬鹽的溶解，將FeCL2及FeCL3加入蒸餾水中進行溶解；
②金屬鹽的水解，在劇烈攪拌的狀態下，將氫氧化鈉加入到上述金屬鹽溶液中，使其水解為金屬複合氧化物，也就是鐵顆粒溶液；
三、細胞膜抗原包被磁性粒子
將步驟一獲得的紅細胞膜抗原加入到步驟二獲得的鐵顆粒溶液中，再加入聚乙二醇，進行孵育，離心後棄上清，留沉澱，再在沉澱物中加入低滲磷酸緩衝液，即得包被了磁性粒子的細胞膜抗原。
2、由權利要求1的保存方法所獲得的包被了磁性粒子的細胞膜抗原。
全文摘要
一種人細胞膜抗原的保存方法及磁性粒子包被人細胞膜抗原，屬於生物技術領域，特別是涉及細胞膜的保存方法。本發明提供一種使細胞膜抗原在不依賴細胞的活性條件下，完整地保持其抗原性的磁性粒子包被人細胞膜抗原及其保存方法。首先製備紅細胞抗原，再製備磁性粒子，最後將細胞膜抗原包被磁性粒子。本發明是使細胞膜抗原在不依賴細胞的活性條件下，完整地保持其抗原性。本發明以磁性粒子改造活的人體細胞為無活性細胞，但保持了細胞膜抗原的抗原性。無限期保存的該磁性粒子具有原人體細胞膜抗原的抗原性，包括紅細胞、血小板、白細胞等人體細胞膜抗原。同時對於分離和分析液體介質中顆粒性抗原抗體反應比常規離心技術要簡單，易於操作和觀察結果，更有效率。
文檔編號C12N5/08GK1763102SQ20051001711
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月9日 優先權日2005年9月9日
發明者李勇, 陳亞光, 童軍, 楊文衝, 劉慶海, 馬學嚴, 林宏傑, 陳維佳, 孫育昌, 高大松, 蔡紅霞, 顧殿茹, 欒玉璽, 李劍波, 王文學 申請人:李勇