一種離子液體體系中酶法合成單甘酯的方法與流程

2023-04-27 21:32:06 1

本發明屬於結構甘油酯的合成技術領域，具體涉及一種離子液體體系中酶法合成單甘酯的方法。

背景技術：

脂肪酸甘油酯(mag)是一種多元醇型非離子表面活性劑。脂肪酸碳數不同使其具有不同的親水親油平衡值(hlb)，在工業中具有不同的用途。近年來在各行業中越來越傾向於使用高純mag，使用量亦呈逐年增加的趨勢。按照組成脂肪酸的名稱，mag可以分為單硬脂酸甘油酯，單棕櫚酸甘油酯，單月矽酸甘油酯，單油酸甘油酯等，其中產量最大應用最多的是單硬脂酸甘油酯。mag的合成方法包括化學催化和酶催化法。化學催化法常需要在高溫下操作，造成富含不飽和脂肪酸的油脂顏色加深、脂肪酸異構化等嚴重問題，同時能耗高、副產物多、環境汙染。而酶催化法條件溫和，能耗低，對環境友好，同時由於酶的高度選擇性，使得反應更有效，副反應少，產品純度高。因此，酶法合成甘油酯中的是研究熱點。酶催化合成mag分為tag的水解、醇解、甘油解和脂肪酸與甘油的酯化法。目前報導較多的是採用食用油的甘油解來製備mag。甘油解雖然有較高的得率，但是難以得到高純度的單一脂肪酸甘油酯，這種產品只有通過脂肪酸與甘油酯化的。另外，不論是酯化還是甘油解反應都是多步反應，反應最終在生成mag的同時，還有dag以及tag作為副產物產生，選擇性富集mag是很困難的。已有文獻報導，在有機溶劑中，通過溶劑工程增加溶劑的極性，可以調節反應平衡，使得反應向富集mag方向進行。

近年來，由於酶催化法具有條件溫和、能耗低、高度選擇性、使得反應更有效、副反應少，產品純度高等優點，酶催化法是酯類合成中的研究熱點。目前脂肪酶催化反應中，有機溶劑作為反應介質雖然具有提高反應速率、緩和反應條件以及提高酶穩定性等優勢，但存在副反應多、反應選擇性低以及易產生有毒氣易對人體造成傷害和汙染環境等缺點。因此，酶促酯類合成亟需尋求更優異的反應介質。

技術實現要素：

本部分的目的在於概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用於限制本發明的範圍。

鑑於上述和/或現有合成mag中存在的問題，提出了本發明。

因此，本發明的目的是解決現有技術化學法合成和有機溶劑中合成mag的不足，存在環境以及安全問題，提供一種在離子液體中mag方法。

為解決上述技術問題，本發明提供了如下技術方案：

作為本發明所述離子液體體系中酶法合成單甘酯的方法的一種優選方案，其中：

本發明所具有的有益效果：

1、本發明所提供的離子液體體系中酶法合成單甘酯的方法中，相對於有機溶劑對人體和環境造成的危害，離子液體的液程廣，無蒸汽壓，是一種真正清潔、無汙染的綠色溶劑，在有機合成領域越來越受到重視。

2、本發明所提供的離子液體體系中酶法合成單甘酯的方法中，離子液體可以提高脂肪酶的活性、穩定性，並且可以回收重複利用，一定程度降低成本。

3、本發明所提供的離子液體體系中酶法合成單甘酯的方中，離子液體作為一種「可設計性」的溶劑，通過改變離子液體陰陽離子的種類，從而可以改變其極性、疏水性、氫鍵性質以及粘度等。一方面增加脂肪酸和甘油的接觸面積，改善傳質，同時離子液體能保留適當含量的水分保持酶的活力，提高酯化反應速率。另一方面，在極性以及氫鍵性質的作用下離子液體可以調節反應平衡，選擇性的富集了mag，使其在反應產物中的含量達到60.1％。

4、通常傳統方法mag合成過程中，需要加入過多過量的甘油。本發明中選擇極性較高的離子液體的對反應的調節作用，在生成更多mag的同時，最優甘油/油酸摩爾比僅為3/1，有效的節約了原料甘油的加入量。

5、反應結束後，通過簡單的離心即可實現產物與離子液體的分離，易於規模化生產。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案,下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹,顯而易見地,下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例,對於本領域普通技術人員來講,在不付出創造性勞動性的前提下,還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。其中：

圖1-5為離子液體性質對mag選擇性及脂肪酸轉化率的影響。反應條件為：將1.049g油酸(5mmol)和0.460g甘油(5mmol)混合，加入佔底物總質量30％的離子液體(0.5608g)作為反應介質，攪拌後，加入佔底物總質量4％的固定化脂肪酶novozyme435，磁力攪拌在60℃的溫度下反應8h。

圖1為極性對mag選擇性和脂肪酸轉化率的影響。圖2為氫鍵鹼性對mag選擇性和脂肪酸轉化率的影響。圖3為離子液體與mag形成氫鍵作用機理。圖4為logp對mag選擇性和脂肪酸轉化率的影響。圖5粘度對mag選擇性和脂肪酸轉化率的影響

圖6脂肪酶種類對mag合成的影響。反應條件為：溫度60℃、底物摩爾比(甘油:油酸)為1:1、酶添加量4％和離子液體添加量30％以及反應時間為8h，選擇了novozymes435、lipozymermim以及lipozymetlim進行反應。

圖7反應時間對mag合成的影響。反應條件為：在反應溫度50℃、底物摩爾比(甘油:油酸)為3:1、酶添加量4％和離子液體添加量30％，選擇1-12h進行反應。

圖8脂肪酶添加量對mag合成的影響。反應條件為：在反應時間8h、反應溫度50℃、底物摩爾比(甘油:油酸)為3:1和離子液體添加量30％，選擇2％-10％進行反應。

圖9溫度對mag合成的影響。反應條件為：在反應時間8h、脂肪酶添加量為4％、底物摩爾比(甘油:油酸)為3:1和離子液體添加量30％，選擇30-70℃進行反應

圖10離子液體添加量對mag合成的影響。反應條件為：在反應時間8h、脂肪酶添加量為4％、底物摩爾比(甘油:油酸)為3:1和溫度50℃，選擇20％-60％進行反應

圖11底物摩爾比對mag合成的影響。反應條件為：在反應時間8h、脂肪酶添加量為4％、離子液體添加量30％和溫度50℃，選擇甘油，其與脂肪酸的摩爾比為1：0.2～1進行反應。

具體實施方式

為使本發明的上述目的、特徵和優點能夠更加明顯易懂，下面結合具體實施例對本發明的具體實施方式做詳細的說明。

在下面的描述中闡述了很多具體細節以便於充分理解本發明，但是本發明還可以採用其他不同於在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似推廣，因此本發明不受下面公開的具體實施例的限制。

其次，此處所稱的「一個實施例」或「實施例」是指可包含於本發明至少一個實現方式中的特定特徵、結構或特性。在本說明書中不同地方出現的「在一個實施例中」並非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。

本發明的反應體系為混合反應體系,篩選出有利於mag合成的離子液體，並對脂肪酶酶種類、反應溫度、時間、酶添加量、離子液體添加量和地物摩爾比等因素的優化,確定該混合反應體系的最佳合成工藝。

實施例1

1.1離子液體的篩選

將1.049g油酸(5mmol)和0.460g甘油(5mmol)混合，加入佔底物總質量30％的離子液體(0.5608g)作為反應介質，攪拌後，加入佔底物總質量4％的固定化脂肪酶novozyme435，磁力攪拌在60℃的溫度下反應8h後，離心去除離子液體(含甘油)和脂肪酶，得到含有單甘酯的產物。採用正相高效液相色譜蒸發光檢測器(np-hplc-elsd)檢測反應後體系中mag的含量並用外標法定量，酸鹼滴定法檢測其中脂肪酸含量變化。酯化率＝(1-反應後脂肪酸摩爾量/反應前脂肪酸摩爾量)×100％

np-hplc-elsd分析mag含量

一定的時間間隔中每次取出20ul反應混合物，溶入b相溶劑中，取5ul進樣，正相高效液相色譜蒸發光檢測器(np-hplc-elsd)檢測反應體系中甘油脂的含量。色譜條件：luna矽膠柱silicacolumns(4.6mm×250mm×5μm，美國phenomenex公司)，柱溫30℃；elsd條件：漂移管溫度55℃，增益1，氣體流速1.8ml/min；樣品濃度0.5mg/ml，進樣量5μl；二元梯度洗脫系統：(a相)正己烷/異丙醇＝98/2(v/v)，(b相)正己烷/異丙醇/冰乙酸＝1/1/0.01(v/v/v)，流速1.0ml/min，梯度洗脫程序見表2所示。

表1-hplc-elsd法測定甘油酯含量二元梯度洗脫程序

甘油酯選擇性的測定：分別建立甘一酯、甘二酯、甘三酯的標準曲線，利用外標法測出甘一酯、甘二酯、甘三酯的在反應體系中的絕對含量。選擇性可表示為：

表2所示了不同離子液體中mag選擇性以及脂肪酸轉化率的結果，通過與離子液體不同溶劑性質進行相關性研究，從而篩選出適合選擇性合成mag的離子液體。

表2-mag選擇性、脂肪酸轉化率以及離子液體的性質

(1)極性對mag選擇性的影響，

對於大多數離子液體而言單甘酯的選擇性隨著極性的增加而增加，脂肪酸轉化率有所下降，其中[ho(ch2)2mim]ntf2取得了最高的單甘酯選擇性(50.47％)。這一規律在[tf2n]-類離子液體中的提現更為顯著。通過曲線擬合我們可以得到[tf2n]-類離子液體中單甘酯選擇性，脂肪酸轉化率與極性ent值的相關性曲線分別為：y＝-593.231+2730.38x-3932.44x2+1872.421x3r2＝0.89012，y＝199.80+571.198x-946.6537x2+572.427x3r2＝0.89012。可見極性與單甘酯選擇性具有很強的正相關性。發明人經研究發現，隨著溶劑極性的增強，導致反應體系中疏水性極性強的mag的熱力學活度降低，疏水性高的dag和tag的活度增加，導致反應平衡向生成更多的mag方向移動。然而，[bmim]n(cn)2離子液體相對於[ho(ch2)2mim]ntf2而言極性並不高，但卻有很高的mag選擇性(57.31％)。[pf6]-和[bf4]-類離子液體卻表現出與極性規律相反的趨勢。

(2)氫鍵性質對mag選擇性的影響

目前表示離子液體氫鍵的相關參數可以用kamlet–taft參數(α、β、π*)來表示。α是氫鍵酸度表示氫鍵供體能力,β表示氫鍵鹼度表示氫鍵受體能力，π*表示偶極性與極化率的比值。由表2可以看出，α同極性ent值具有相同的趨勢，因而對mag選擇性以及ffa轉化率的影響趨勢也相近。[ho(ch2)2mim]ntf2具有很高的α值(1.17)可能是由於陽離子上帶有羥基，是一種很強的氫鍵供體，如圖3a所示離子液體與mag上的羥基形成氫鍵，從而使mag的活度降低，選擇性增加。事實上，由於α的計算公式與ent具有一定的關係如下所示，

α＝0.0649et(30)-2.03-0.27π*

對於大部分離子液體而言π*值變化不大，因此α和ent呈現正相關。這又從另一個側面解釋極性對單甘酯選擇性的影響。

β值與mag選擇性成明顯的正相關趨勢。特別的，[bmim]n(cn)2具有最高的β值(0.71)，雖然其α值(0.54)並不高，但是卻具有很高的單甘酯選擇性(57.31％)。如圖3b所示，這可能是由於[bmim]n(cn)2具有一種電負性很強的陰離子[n(cn)2]-，這種陰離子是一種很強的氫鍵受體，易於單甘酯形成氫鍵從而使單甘酯的選擇性增加。然而，[bmim]n(cn)2的脂肪酸轉化率卻很低。通常具有高的β值的離子液體大多是親水的，使得酶與溶劑之間產生一種強的相互作用，這種作用能夠破壞酶的蛋白質結構，從而使酶的活性降低，導致轉化率降低。

(3)疏水性logp對mag選擇性的影響

離子液體的疏水性用logp(辛醇-水分配係數)表徵，即離子液體在辛醇和水相的濃度比的對數值。酶在一般含[pf6]-、[tf2n]-疏水性陰離子的離子液體中具有活性，而在親水性陰離子的液體中活性很低。脂肪酸轉化率與logp呈明顯的正相關關係。[pf6]-、[tf2n]-類離子液體的脂肪酸轉化率明顯高於[bf4]-和[n(cn)2]-類離子液體，這與酶在離子液體中的活性與疏水性的關係是一致的。另外mag的選擇性與logp並沒有明顯的相關性，相比較而言，疏水性大的離子液體單甘酯選擇性相對較低。

(4)粘度對mag選擇性的影響

整體而言粘度與mag選擇性以及脂肪酸轉化率並沒有明顯的相關性。然而，不同種類的離子液體中粘度卻呈現出不同的趨勢。對於[tf2n]-而言，粘度隨著陽離子醯基鏈長的增加而增加，脂肪酸轉化率增加，單甘酯選擇性有所降低。然而，[pf6]-類離子液體卻呈現出相反的趨勢，隨著陽離子醯基鏈長的增加，脂肪酸轉化率降低，單甘酯選擇性有所提高。由表2可以看出，不同陰離子得離子液體粘度呈現很大的差異，[pf6]-和[bf4]-類離子液體(100-700cp)的粘度遠遠高於相同類型的[tf2n]-和[n(cn)2]-類的離子液體(20-100cp)。並且，[pf6]-類離子液體中，粘度隨著醯基鏈長的增加顯著增加。由於甘油和脂肪酸發生的酯化反應是一個多步反應，先生成單甘酯，mag再結合脂肪酸生成甘二酯dag、tag。高粘度的溶劑導致了較高的傳質阻力，使得反應的轉化率有所降低，同時更多的底物生成的了dag，很難再轉化為dag和tag，從而表現為mag的選擇性高。[pf6]-類離子液體正是由於這一原因才表現出與上文提到的極性規律相反的趨勢。

綜上所述，極性以及氫鍵性質是影響離子液體中甘油酯選擇性的主要性質，高極性以及具有一些功能基團的離子液體，有利於mag的富集。logp以及β值主要影響脂肪酸的轉化率，具有高logp，低β值的離子液體(ntf2-、pf6-類)具有高ffa轉化率。具有較低的極性，較高的logp值長碳鏈陽離子的離子液體中,具有很高的dag及tag選擇性。在粘度較大的離子液體(pf6-類)中，高粘度降低反應速率，從而影響反應的轉化率與產物選擇性。因此，可優選出[tf2n]-類離子液體中陽離子取代基為4～6個碳的碳鏈的單取代或多取代離子液體包括[bmim][tf2n]、[hmim][tf2n]、[bmmim][tf2n]或[b3men]ntf2中的一種或幾種；陽離子取代基上含有羥基、醚基功能性基團的單取代或多取代離子液體包括[ho(ch2)2mim][tf2n]或[meo(ch2)2mim][ntf2]。[pf6]-類離子液體中陽離子取代基為8～10個碳的碳鏈的單取代離子液體包括[omim][pf6]或[c10mim][pf6]。[n(cn)2]-類離子液體包括[bmim][tf2n]。

1.2工藝條件優化

另外[ho(ch2)2mim]ntf2具有很高的mag選擇性，較高的轉化率，並且產物容易分離因此我們選擇[ho(ch2)2mim]ntf2作為溶劑，對mag合成進行簡單優化。

得到最優條件為：將油酸和甘油以1:4的摩爾比加入反應釜中，加入佔底物總質量30％的離子液體[ho(ch2)2mim]ntf2，放入攪拌子，在溫度為50℃的恆溫水浴鍋中預熱，打開磁力攪拌器，以450rpm的轉速攪拌，加入佔底物總質量4％的脂肪酶novozyme435，4％的4a分子篩，開始反應，反應8h後，取出產物，10000prm離心10min去除離子液體和脂肪酶，經液相分析，產物中單甘酯的含量為60.1％。

實施例2：

將月桂酸和甘油以1:1的摩爾比加入反應釜中，加入佔底物總質量30％的離子液體[ho(ch2)2mim]ntf2，放入攪拌子，在溫度為60℃的恆溫水浴鍋中預熱，打開磁力攪拌器，以450rpm的轉速攪拌，加入佔底物總質量4％的脂肪酶novozyme435，4％的4a分子篩，開始反應，反應8h後，取出產物，10000prm離心10min去除離子液體和脂肪酶，經液相分析，產物中單甘酯的含量為52.5％。

實施例3：

將辛酸和甘油以1:1的摩爾比加入反應釜中，加入佔底物總質量30％的離子液體[meo(ch2)2mim]ntf2，放入攪拌子，在溫度為60℃的恆溫水浴鍋中預熱，打開磁力攪拌器，以450rpm的轉速攪拌，加入佔底物總質量4％的脂肪酶novozyme435，4％的4a分子篩，開始反應，反應8h後，取出產物，10000prm離心10min去除離子液體和脂肪酶，經液相分析，產物中單甘酯的含量為51.0％。

實施例4：

將月桂酸和甘油以1:1的摩爾比加入反應釜中，加入佔底物總質量30％的離子液體[b3men]ntf2，放入攪拌子，在溫度為60℃的恆溫水浴鍋中預熱，打開磁力攪拌器，以450rpm的轉速攪拌，加入佔底物總質量4％的脂肪酶novozyme435，4％的4a分子篩，開始反應，反應8h後，取出產物，10000prm離心10min去除離子液體和脂肪酶，經液相分析，產物中單甘酯的含量為59.70％。

實施例5

將亞油酸和甘油以1:4的摩爾比加入反應釜中，加入佔底物總質量30％的離子液體[ho(ch2)2mim]ntf2，放入攪拌子，在溫度為50℃的恆溫水浴鍋中預熱，打開磁力攪拌器，以450rpm的轉速攪拌，加入佔底物總質量4％的脂肪酶novozyme435，4％的4a分子篩，開始反應，反應8h後，取出產物，10000prm離心10min去除離子液體和脂肪酶，經液相分析，產物中單甘酯的含量為55.3％。

由此可見，本發明所提供的離子液體中酶法合成單甘酯的方法，利用離子液體可調節的溶劑性質，選擇不同離子液體作為反應介質。一方面增加脂肪酸和甘油的接觸面積，改善傳質，同時離子液體能保留適當含量的水分保持酶的活力，提高酯化反應速率。另一方面，在極性以及氫鍵性質的作用下離子液體可以調節反應平衡，選擇性的富集了mag，使其在反應產物中的含量達到60.1％。既提高了產量，有效的避免了有機溶劑易揮發，有毒氣易對人體造成傷害和汙染環境等缺點。

應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。