從植物中分離提取和純化奇壬醇的方法及其應用的製作方法

2023-04-27 05:47:31 7

專利名稱：從植物中分離提取和純化奇壬醇的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從植物中分離提取和純化化合物奇壬醇(kirenol)的方法，特別是從藥用植物豨薟革中分離提取和純化奇壬醇的方法，本發明還涉及奇壬醇的應用，特別是在抗類風溼性關節炎、鎮痛等藥物中應用。
根據「中華人民共和國藥典」(中華人民共和國衛生部藥典委員會編，化學工業出版社，1995年版一部P325)記載，豨薟草為菊科植物東方豨薟、腺梗豨薟或毛梗豨薟的乾燥地上部分。性味辛、苦、寒、歸肝、腎經。主要功能與主治為祛風溼、利關節、解毒。用於風溼痺痛、筋骨無力、腰膝酸軟、四隻麻痺、半身不遂、風疹溼瘡。
類風溼性關節炎(UA)是一種不明原因的慢性全身性免疫反應性炎症性疾病，免疫反應多發生於關節滑膜，為最常見的結締組織疾病。
目前類風溼性關節炎的藥物治療方法主要是1.消炎鎮痛類①乙醯水楊酸 有消炎鎮痛作用，對關節蒸裝有明顯效果。
②消炎痛 作用較阿司匹林強，但消化道潰瘍及肝腎功能不全者忌用。
③保泰松 1周內可顯效，但可引起粒細胞和血小板減少。
④氯滅酸 該藥抗炎作用強，副作用小，偶爾有頭痛、頭暈。
2.糖皮質激素 因激素副作用大，停用後易復發，故一般在其它要無效時才使用。
3.金製劑 硫代蘋果酸金鈉合金硫葡萄糖，深部肌肉注射，該藥可誘發皮炎，如有腎功能損害應慎用。
4.免疫抑制劑 如果用上述藥物不理想，可加用免疫抑制劑。如環磷醯胺。
5.氯喹 用藥1-3個月可顯效，應用時應注意視網膜病。
目前主要使用的西藥皆有不同程度的毒副作用或其它副作用，本發明克服了現有技術中直接使用中藥治療疾病的不方便之處，提供從傳統中藥中獲得藥效成分奇壬醇的方法，並以奇壬醇作為先導化合物，為抗類風溼性關節炎、鎮痛、抗菌、抗瘧、降壓、舒張血管等疾病的治療，提供毒性低、藥效明顯之良藥。
2.用溶媒回流提取或浸泡滲漉提取步驟1中得到的濾渣。溶媒可以是30-95％乙醇水溶液、氯仿、二氯甲烷、己酸己酯、丙酮、甲醇或含有丙酮40-80％的水液；溶媒的加入量按照步驟1中加入的原料加入量計算，每次加入溶媒的體積升數∶最初加入幹品重量公斤數＝6-12∶1，或溶媒的體積升數∶新鮮藥材重量公斤數＝4-8∶1；回流提取的方法是向濾渣中按比例加入溶媒，反覆回流提取2-5次，每次回流時間為1-4小時；浸泡滲漉的方法是直接用上述溶媒、按上述比例在常溫下對濾渣進行1-4次滲漉提取，每次滲漉4-6天，將得到的提取液過濾，收集濾液；在低於80℃溫度下，對濾液進行減壓濃縮，除去溶媒，得比重為1.1-1.4的浸膏狀提取物A。
3.對步驟2中得到的提取物A，先加入水混懸溶解，提取物A的重量公斤數∶水的體積升數＝1∶3-6，然後以溶媒I萃取1-4次，溶媒I是石油醚或包括己烷、環己烷、正己烷在內的C6-C7烷烴，每次水相與溶媒相的體積比＝1∶0.2-2，分離出溶媒層，水層再用溶媒II萃取1-4次，溶媒II是乙酸乙酯或包括二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳在內的滷化烴或包括乙醚在內的醚或包括乙酸丁酯、乙酸戊酯在內的有機酸酯類或C3-C5的脂肪醇，每次水相與溶媒相的體積比例為1∶0.2-3；合併各次萃取後的溶媒II液，得溶媒液B，其中主含奇壬醇。
4.對步驟3中收集到的溶媒液B，在低於80℃條件下進行減壓濃縮，得到提取固體濃縮物B1。
5.對步驟4中得到的提取固體濃縮物B1，用色譜法進行一次或多次同種或不同種的層析法純化，或對層析法的產品再進行重結晶純化，就得到奇壬醇純品。色譜法層析純化的具體步驟為取層析柱，用填料裝柱，用洗脫液洗脫，收集含奇壬醇的部位，得到本發明所說的純化有效化合物奇壬醇；對於色譜法中使用的不同填料，採取不同的條件，具體為1)矽膠層析柱取常壓玻璃層析柱，以60-400目矽膠為填料，提取固體濃縮物B1與矽膠重量份數比在1∶10-1∶300之間，以體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為洗脫液，或用體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和丙酮的混合溶劑為洗脫液，將收集到的含奇壬醇的洗脫液，再在低於50℃溫度下減壓濃縮成固體；2)D101大孔樹脂層析柱取常壓玻璃層析柱，以D101大孔樹脂為填料，提取固體濃縮物B1與填料的重量份數比在1∶20-1∶200之間，用水洗脫至洗脫流出液無色，然後再依次用體積百分比為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的乙醇水溶液進行梯度洗脫，每次洗脫至洗脫流出液無色再增加梯度，收集60％-80％的洗脫流出液，其中主含奇壬醇，再在低於60℃溫度下將洗脫流出液減壓濃縮成固體；3)中性氧化鋁層析柱取常壓或真空玻璃層析柱，以60-300目中性氧化鋁為填料，提取固體濃縮物B1與中性氧化鋁的重量份數比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為梯度洗脫液，或以體積比在1∶0.5-5之間的石油醚和丙酮的混合溶劑為梯度洗脫液，即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的極性梯度增加，進行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液，控制溫度低於60℃，將洗脫流出液減壓濃縮成固體；4)聚醯胺層析柱取常壓玻璃層析柱，以60-300目聚醯胺為填料，提取濃縮物B1與聚醯胺的重量份數比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶1-1∶10之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為梯度洗脫液即依次以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10為梯度洗脫液，或以體積比在1∶0.5-10之間的石油醚和丙酮的混合溶劑為梯度洗脫液即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合液為梯度洗脫液，進行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液，控制溫度低於60℃，將洗脫流出液減壓濃縮成固體；5)反相矽膠層析柱取常壓柱或包括Lobar柱在內的製備型加壓柱，以100-300目反相矽膠C-18或C-8為填料，提取固體濃縮物B1與反相矽膠C-18或C-8的重量份數比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶9-4∶1之間的甲醇和水的混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇的洗脫液，或以體積比在0∶1-1∶0之間的甲醇-水混合液為梯度洗脫液，即依次以0∶1、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶1、8∶2、9∶1、1∶0為梯度洗脫液，進行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液；然後控制溫度低於60℃、將收集到的洗脫流出液減壓濃縮成固體；
所述的重結晶，就是將色譜法層析純化後得到的固體，在分析純級的有機溶媒乙酸乙酯或丙酮或包括乙醇在內的C1-C4醇或水中進行重結晶1-4次，得到奇壬醇結晶純品。
依照上述方法分離提取到的奇壬醇，其純度不低於95％。
奇壬醇的分子結構式為 根據上述方法和步驟得到的化合物奇壬醇，其在甲醇中的理化特徵和性質為無色透明方晶，可溶解於己酸己酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲醇、正丁醇，部分溶解於水。分子組成為C20H34O4，mp.201℃～202℃，元素分析結果為C 71.012％；H 10.061％；紅外波譜IR(KBr)max cm-13314，2914，1650，1450，1397，1059，1033，857；核磁共振碳譜13CNMR(C5D5N)ppm49.2(C-1)，63.8(C-2)，45.6(C-3)，40.9(C-4)，55.4(C-5)，22.6(C-6)，36.7(C-7)，138.0(C-8)，51.3(C-9)，39.7(C-10)，19.1(C-11)，32.7(C-12)，37.9(C-13)，129.7(C-14)，76.6(C-15)，63.8(C-16)，23.3(C-17)，28.2(C-18)，64.8(C-19)，16.9(C-20)；核磁共振氫譜 1HNMR(C5D5N)ppm5.50(1H，br，s，14-H)，4.14(1H，d，J＝11.8Hz，19-Ha)，3.64(1H，d，J＝11.8Hz，19-Hb)，δ4.01(1H，t，J＝11.7Hz，16-CH)，3.42(d，J＝11.7Hz，2H，H-17)，4.19(1H，m，1H)，2.85(1H，br，d)，1.26(3H，s，18-CH3)，1.15(3H，s，15-CH4)，0.81(3H，s，C20-CH3)；質譜EIMSm/z277[M-CH(OH)-CH2OH]+，259，241，151，121，109，81，43.FABMSm/z339(M+1)+。
對上述方法和步驟得到的奇任醇進行純度檢查，tR＝4.08min，215nm檢測，純度98.28％。
峰面積百分比峰號 保留時間 峰寬 峰高 峰面積百分比1 1.350 0.0530 187.32345 1.68372 4.057 0.1545 1364.72534 98.21383. 1.210 0.0324 152.34754 0.10243注2為溶劑殘留峰，2為奇任醇峰矽膠TLC檢測測定結果為點樣量100μl，未見明顯雜質斑。
展距9cm
顯色劑10％硫酸液，加熱110℃，5min.Rf值0.46本發明還提供奇壬醇在抗類風溼性關節炎藥物中的應用。藥物的劑型根據臨床應用方式而定，可以是片劑、丸劑、膠囊劑、衝劑、噴霧劑、口服液、混懸劑、外用擦劑、透皮吸收製劑或注射劑。
本發明從植物、特別是從藥用植物豨薟草中分離提取和純化出奇壬醇，奇壬醇具有抗菌、抗炎作用，降壓及舒張血的作用，免疫抑制作用，抗瘧作用，抗生育作用等。以奇壬醇為有效成分製成的藥品，對類風溼性關節炎具有明顯作用。
實施例1通過下列方法和步驟分離提取和純化奇壬醇1.取原料藥材豨薟草腺梗豨薟的自然乾燥地上部分1公斤，經粉碎，加入加熱回流瓶中，再加石油醚8升，升溫至回流，第一次回流時間為2小時；冷卻，倒於布氏漏鬥減壓過濾去除回流液。在濾渣中再加入石油醚6升，重複上述回流1次，減壓過濾去除回流液。
2.將步驟1中得到的濾渣在回流瓶中加95％乙醇6升，升溫至回流2小時，冷卻，減壓過濾去回流液，濾渣再重複上述回流過程2次，合併濾液。濾液在旋轉蒸發儀上控制溫度45℃，經減壓濃縮除去醇，得比重為1.3的浸膏狀提取物A 120克。
3.將步驟2中得到的提取物A120克混懸溶解於360毫升水中，用石油醚100毫升於分液漏鬥中萃取1次，接收水層，再重複上述萃取過程1次，接收水層，水層再用乙酸乙酯重複萃取3次，每次用100毫升乙酸乙酯，合併各次萃取後的乙酸乙酯提取液B，其中主含奇壬醇。
4.對步驟3中收集到的溶媒乙酸乙酯提取液B，在40℃溫度下進行減壓濃縮，得提取固體濃縮物B1約40克。
5.對步驟4中得到的提取濃縮物B140克，用10克100目矽膠拌樣，涼幹待用；在5×60cm玻璃柱中幹法裝200-300目矽膠400克，再將拌樣矽膠裝於柱內，上面再加2克矽膠，以體積比為1∶1的石油醚和乙酸乙酯混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇部位，於旋轉蒸發儀上控制溫度40℃，得到奇壬醇粗結晶約3.5克。將得到的奇壬醇粗結晶溶解在乙酸乙酯中，重結晶2次，得到奇壬醇結晶純品約2克。
上述方法和步驟得到的奇壬醇純度，用HPLC檢測為98％。
實施例2通過下列方法和步驟分離提取和純化奇壬醇1.取原料藥材豨薟草腺梗豨薟的自然乾燥地上部分1公斤，經粉碎，加入加熱回流瓶中，再加環己烷8升，升溫至回流，第一次回流時間為2小時；冷卻，倒於布氏漏鬥減壓過濾去除回流液。在濾渣中再加入環己烷6升，重複上述回流1次，減壓過濾去除回流液。
2.將步驟1中得到的濾渣在回流瓶中加溶媒丙酮6升，升溫至回流2小時，冷卻，減壓過濾去回流液，濾渣再重複上述回流過程2次，合併濾液。濾液在旋轉蒸發儀上控制溫度40℃，經減壓濃縮除去丙酮，得比重為1.6的浸膏狀提取物A約100克。
3.將步驟2中得到的提取物A100克混懸溶解於300毫升水中，用環己烷100毫升於分液漏鬥中萃取1次，接收水層，再重複上述萃取過程1次，接收水層，水層再用乙酸乙酯重複萃取3次，每次用100毫升乙酸乙酯，合併各次萃取後的乙酸乙酯液提取B，其中主含奇壬醇。
4.對步驟3中收集到的溶媒乙酸乙酯提取液B，在40℃溫度下進行減壓濃縮，得提取固體濃縮物B1約35克。
5.對步驟4中得到的提取濃縮物B1 35克，用10克100目矽膠拌樣，涼幹待用；在5×60cm玻璃柱中幹法裝200-300目矽膠350克，再將拌樣矽膠裝於柱內，上面再加2克矽膠，以體積比為2∶1的石油醚和丙酮混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇部位，於旋轉蒸發儀上控制溫度40℃，得到奇壬醇粗結晶約3.5克。將得到的奇壬醇粗結晶溶解在無水丙酮中，重結晶2次，得到奇壬醇結晶純品約2克。
上述方法和步驟得到的奇壬醇純度，用HPLC檢測為98％。
實施例3通過下列方法和步驟分離提取和純化奇壬醇1.取原料藥材豨薟草腺梗豨薟的自然乾燥地上部分1公斤，經粉碎，加入加熱回流瓶中，再加環己烷8升，升溫至回流，第一次回流時間為2小時；冷卻，倒於布氏漏鬥減壓過濾去除回流液。在濾渣中再加入環己烷6升，重複上述回流1次，減壓過濾去除回流液。
2.將步驟1中得到的濾渣在回流瓶中加甲醇6升，升溫至回流2小時，冷卻，減壓過濾去回流液，濾渣再重複上述回流過程2次，合併回流液。濾液在旋轉蒸發儀上控制溫度45℃，經減壓濃縮除去甲醇，得比重為1.8的浸膏狀提取物A約110克。
3.將步驟2中得到的提取物A約110克混懸溶解於350毫升水中，用環己烷100毫升於分液漏鬥中萃取1次，接收水層，再重複上述萃取過程1次，接收水層，水層再用二氯甲烷重複萃取3次，每次用100毫升二氯甲烷，合併各次萃取後的二氯甲烷提取液B，其中主含奇壬醇。
4.對步驟3中收集到的二氯甲烷提取液B，在40℃溫度下進行減壓濃縮，得提取固體濃縮物B1約40克。
5.對步驟4中得到的固體提取濃縮物B1 40克，溶解於60毫升的20％(體積比)乙醇-水中，濾去不溶物，用以60-300目聚醯胺為填料，在30×200釐米的玻璃層析柱上，加入經預處理後的D101聚醯胺1000克，以水飽和之界面，加入B1的60毫升的20％乙醇-水，靜置3小時後，用水洗脫至無色；再分別用10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％(體積比)的乙醇-水梯度極性洗脫，每極性度的洗脫量視洗脫液至無色後再增加極性梯度，收集含奇壬醇的洗脫液，然後控制溫度在45℃，對收集到的洗脫液進行減壓濃縮成固體B2；對得到的濃縮固體物B2 5克，用10克100目矽膠拌樣，涼幹待用；在5×60cm玻璃柱中幹法裝200-300目矽膠250克，再將拌樣矽膠裝於柱內，上再加2克矽膠，以體積比為2∶1的溶媒石油醚和丙酮混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇部位，於旋轉蒸發儀上控制溫度40℃，得到奇壬醇粗結晶約3.0克。將奇壬醇粗結晶溶解於10毫升無水乙醇中，於冰箱中低溫靜置，進行重結晶1-4次，得到奇壬醇結晶純品約2克。
上述方法和步驟得到的奇壬醇純度，用HPLC檢測為98％。
實施例4本實施例為應用實施例。
用實施例1中得到的奇壬醇純品，進行抗風溼性關節炎和鎮痛的藥效研究，試驗方法和結果如下材料和方法1.藥品與試劑福氏完全佐劑(Freund’s Adjuvant complete)，RPMI-1640粉為美國Gibco公司產品，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，刀豆蛋白(Con A)，脂多糖(LPS)均為Sigma公司產品。
2.動物分組SD大鼠雌雄各半，2-3月齡，體重(250±30)克，C57BL/6小鼠，雌雄兼用，6周齡，體重(20±3)克，均由北京大學醫學部實驗動物部提供。將大鼠隨機分為3組，每組10隻，正常組每日每隻灌服4ml水，於給水第1日給大鼠左後足蹠皮內注射0.1ml生理鹽水，模型組每日每隻灌服4ml(0.24g/ml)奇壬醇，模型組與給藥組於給水，給藥第1日分別在左後足蹠皮內注射0.1ml福氏完全佐劑，第18日將動物全部處死，取脾和腹腔巨噬細胞備用。
測定結果①奇壬醇對佐劑型關節炎大鼠淋巴細胞增值有促進作用，大鼠佐劑性關節炎大鼠淋巴細胞增值功能低下，與正常組比較下降28％，奇壬醇對AA大鼠模型淋巴細胞增值有促進作用增加20％。具體數據如表1所示。表1、奇王醇對佐劑性關節炎大鼠淋巴細胞增殖的影響(X±S)OD值(570nmmGroup Animal 5×106 splenGontrol 71.623±0.42AA 71.164±0.09## P＜0.05AA+奇王醇 71.400±0.15**P＜0.05＜##與正常組比較；**與AA組比較。
②奇壬醇可促進AA大鼠脾淋巴細胞IL-2的產生。佐劑性關節炎大鼠淋巴細胞產生IL-2功能低下，與正常組比較下降28％，給藥後奇壬醇對AA大鼠模型淋巴細胞產生的IL-2在1∶2；1∶4；1∶8均有促進作用，與模型組比較，分別增加50％；52％；65％(P＜0.05)，並能恢復至正常大鼠水平。具體數據如表2所示。表2、奇王醇對AA大鼠脾淋巴細胞IL-2的影響-(X±S)IL-2 OD值570(nm)Group Animal1∶21∶41∶8Control 7 0.241±0.023 0.175±0.0230.143±0.012AA 7 0.174±0.017 0.122±0.0110.077±0.016AA+XXC 7 0.261±0.009 0.186±0.0240.127±0.021##與正常組比較＜0.05；**與AA組比較P＜0.05。
③奇壬醇可抑制LPS誘導的AA大鼠腹腔巨噬細胞IL-1的產生。
佐劑性關節炎大鼠腹腔細胞產生IL-1功能亢進，與正常組比較上升34％，給藥後奇壬醇對AA大鼠模型腹腔巨噬細胞產生的IL-1在1∶10；1∶20；1∶40稀釋毒均有抑制作用，與模型組比較，分別下降23％；33％；57％(P＜0.05)，並能恢復至正常大鼠水平。具體數據如表3所示。表3、奇王醇對AA大鼠腹腔巨噬細胞IL-1的影響(X±S)IL-1 OD 值570(nm)Group Animal 1∶10 1∶20 1∶40Control 7 0.164±0.013 0.097±0.015 0.055±0.014AA 7 0.219±0.016##0.141±0.040##0.106±0.063##AA+奇王醇7 0.168±0.020**0.108±0.023**0.046±0.009**##與正常組比較P＜0.05；**與AA組比較P＜0.05。
④奇壬醇對AA大屬踝關節局部組織有恢復作用。AA大鼠踝關節切片局部滑囊細胞增生，纖維滲出，炎症細胞侵潤。灌服奇壬醇後，充血減輕，炎症細胞滲出減少。
結論使用福氏完全佐劑製備的大鼠佐劑性關節炎，是免疫性炎症模型，常用的類風溼性關節炎試驗模型之一。類風溼性關節炎是一種自身免疫性疾病，引起關節和全身的病變，與體液與細胞免致均有關，而T細胞直接參與這一病變。為此本試驗採用上述免疫性炎症模型，探討奇王醇抗風溼的作用機理。致炎後大鼠ConA誘導的脾淋巴細胞增殖功能低下，脾淋巴細胞產生的白細胞介素-2活性下降，LPS誘導的大鼠腹腔巨噬細胞產生的白細胞介素-1活性亢進，表明佐劑性關節炎大鼠細胞免疫功能下降，這與文獻報導是一致的。給予奇王醇後，奇王醇可促進脾淋巴細胞增殖功能，並能使其產生的白細胞介素-2恢復至正常水平，見表2。提示奇王醇可通過增強T細胞的功能進而調整大鼠的機體免疫功能，從而改善機體的免疫狀態。文獻報導大鼠佐劑性關節炎的發生與巨噬細胞的異常活化有關，巨噬細胞的異常活化可產生過量的白細胞介素-1，而白細胞介素-1在佐劑性關節炎及人類風溼性關節炎的關節軟骨和骨質的進行性破壞中起重要的作用。使新生正常軟骨蛋白多糖損失，刺激滑膜細胞增殖，從而使軟骨和骨質破壞。
本試驗也證實佐劑性關節炎大鼠白細胞介素-1的產生亢進，同時表明奇王醇可抑制佐劑性關節炎大鼠產生的白細胞介素-1，見表3，從而可阻止白細胞介素-1對大鼠關節軟骨及骨質的破壞進程，減輕全身及局部的病變進程。
佐劑性關節炎大鼠踝關節腫脹，活動受限。病理組織學檢查表明踝關節滑囊細胞增生、炎症細胞侵潤、纖維素滲出。灌服奇王醇的AA大鼠踝關節切片表明纖維素滲出減少，充血減輕。上述試驗初步表明烯薟草可調整佐劑性關節炎大鼠的免疫功能，抑制局部組織炎症細胞滲出，減輕局部病理反映，使佐劑性關節炎得以恢復。
奇王醇鎮痛作用藥效研究奇王醇可明顯減少疼痛模型小鼠的扭體次數，見表4。小鼠灌服奇王醇後可減輕醋酸的疼痛刺激，與模型組比較有顯著的差異，鎮痛率為65％，表明奇王醇有較好的鎮痛作用。表4奇王醇對疼痛小鼠模型的鎮痛作用動物數 劑量 扭體反應鎮痛率組別 (n) (g/kg) (次數/只)(％)生理鹽水模型 2010ml 29 0鹽酸嗎啡 200.01 0 100奇王醇 201.5 10 65注與生理鹽水組比較，*P＜0.001
表5.東方烯薟和腺梗烯薟的鎮痛作用組別 動物數 濃度 出現第一次扭體 扭體次數鎮痛率 (只)(g/生藥kg) 時間(min)(a±SD)(％)對照組 10 0 4.3 20.4±8.4東方烯薟10 28.39 3.2 12.1±6.9*40.710 9.46 4.4 15.4±12.724.5腺梗烯薟10 41.73 4.6 13.2±6.2*35.310 13.91 4.6 15.0±7.426.5注*P＜0.05從表5結果可以看出，東方烯薟和腺梗烯薟對冰醋酸誘發的腹痛均有鎮痛作用，東方烯薟的作用強於腺梗烯薟。毒性結果根據中醫臨床應用，本發明對奇壬醇進行了最大耐受量的測定試驗，實驗動物為昆明小鼠。
最大耐受量實驗結果表明，昆明小鼠對奇壬醇的最大耐受量分別為880.7mg/kg，結果提示奇壬醇的毒性極小，在推薦給藥劑量範圍內使用比較安全。
實施例5本實施例為應用實施例。
用實施例1得到的奇壬醇，製成藥劑，建議臨床推薦用量為15mg/日。片劑製備方法為取奇壬醇150克，粉碎成粉末，過400目篩，加1％硬脂酸鎂，混合均勻，在壓片機上壓制10000粒，使每粒片劑中含15mg奇壬醇，患者每日服用1粒。主要功效為祛風溼，利關節，鎮痛，解毒。用於風溼痺痛，筋骨無力，腰膝酸軟，四肢麻痺，半身不遂，風疹溼瘡。
權利要求
1.一種從藥用植物豨薟草中分離提取和純化化合物奇壬醇的方法，其特徵在於該方法和步驟為(1)取原料藥材豨薟草東方豨薟、腺梗豨薟或毛梗豨薟中的一種或兩種或三種，將生藥幹品或新鮮藥材粉碎後，稱取幹品或新鮮生藥，向其中加入石油醚或環己烷，回流提取2-3次，每次回流時間為1-4小時，每次石油醚或環己烷的加入體積升數與生藥幹品重量公斤數之比＝6-12∶1，或石油醚或環己烷的加入體積升數與新鮮藥材重量公斤數之比＝4-8∶1，每次回流後都進行過濾處理，去除回流液，再對濾渣進行下一次回流，最後一次的濾渣待用；(2)用溶媒回流提取或浸泡滲漉提取步驟(1)中得到的濾渣，溶媒可以是30-95％(體積比)乙醇水溶液、氯仿、二氯甲烷、己酸己酯、丙酮、甲醇或含有丙酮40-80％(體積比)的水液；溶媒的加入量按照步驟(1)中加入的原料加入量計算，每次加入溶媒的體積升數∶最初加入幹品重量公斤數＝6-12∶1，或溶媒的體積升數∶新鮮藥材重量公斤數＝4-8∶1；回流提取的方法是向濾渣中按比例加入溶媒，反覆回流提取2-5次，每次回流時間為1-4小時；浸泡滲漉的方法是直接用上述溶媒、按上述比例在常溫下對濾渣進行1-4次滲漉提取，每次滲漉4-6天；將上述操作得到的提取液過濾，收集濾液；在低於80℃溫度下，對濾液進行減壓濃縮，除去溶媒，得比重為1.1-1.4的浸膏狀提取物A；(3)對步驟(2)中得到的提取物A，先加入水混懸溶解，提取物A的重量公斤數∶水的體積升數＝1∶3-6，然後以溶媒I萃取1-4次，溶媒I是石油醚或包括己烷、環己烷、正己烷在內的C6-C7烷烴，每次水相與溶媒相的體積比＝1∶0.2-2，分離出溶媒層，水層再用溶媒II萃取1-4次，溶媒II是乙酸乙酯或包括二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳在內的滷化烴或包括乙醚在內的醚或包括乙酸丁酯、乙酸戊酯在內的有機酸酯類或C3-C5的脂肪醇，每次水相與溶媒相的體積比例為1∶0.2-3；合併各次萃取後的溶媒II液，得溶媒液B，其中主含奇壬醇；(4)對步驟(3)中收集到的溶媒液B，在低於80℃條件下進行減壓濃縮，得到提取固體濃縮物B1；(5)對步驟(4)中得到的提取固體濃縮物B1，用色譜法進行一次或多次的同種或不同種的層析法純化，或對層析法的產品再進行重結晶純化，得到奇壬醇純品；色譜法層析純化的具體步驟為取層析柱，用填料裝柱，用洗脫液洗脫，收集含奇壬醇的部位，得到純化了的奇壬醇；對於色譜法中使用的不同填料，採取不同的條件，具體為1)矽膠層析柱取常壓玻璃層析柱，以60-400目矽膠為填料，提取固體濃縮物B1與矽膠重量份數比在1∶10-1∶300之間，以體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑或石油醚和丙酮的混合溶劑為洗脫液，將收集到的含奇壬醇的洗脫液，在低於50℃溫度下減壓濃縮成固體；2)D101大孔樹脂層析柱取常壓玻璃層析柱，以D101大孔樹脂為填料，提取固體濃縮物B1與填料的重量份數比在1∶20-1∶200之間，用水洗脫至洗脫流出液無色，然後再依次用體積百分比為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的乙醇水溶液進行梯度洗脫，每次洗脫至洗脫流出液無色再增加梯度，收集60％-80％的洗脫流出液，其中主含奇壬醇，再在低於60℃溫度下將洗脫流出液減壓濃縮成固體；3)中性氧化鋁層析柱取常壓或真空玻璃層析柱，以60-300目中性氧化鋁為填料，提取固體濃縮物B1與中性氧化鋁的重量份數比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑或石油醚和丙酮的混合溶劑為梯度洗脫液，即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的極性梯度增加，進行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液，控制溫度低於60℃，將洗脫流出液減壓濃縮成固體；4)聚醯胺層析柱取常壓玻璃層析柱，以60-300目聚醯胺為填料，提取濃縮物B1與聚醯胺的重量份數比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶1-1∶10之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為梯度洗脫液即依次以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10為梯度洗脫液，或以體積比在1∶0.5-10之間的石油醚和丙酮的混合溶劑為梯度洗脫液即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合液為梯度洗脫液，進行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液，控制溫度低於60℃，將洗脫流出液減壓濃縮成固體；5)反相矽膠層析柱取常壓柱或包括Lobar柱在內的製備型加壓柱，以100-300目反相矽膠C-18或C-8為填料，提取固體濃縮物B1與反相矽膠C-18或C-8的重量份數比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶9-4∶1之間的甲醇和水的混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇的洗脫液，或以體積比在0∶1-1∶0之間的甲醇-水混合液為梯度洗脫液即依次以0∶1、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶1、8∶2、9∶1、1∶0為梯度洗脫液，進行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液；然後控制溫度低於60℃、將收集到的洗脫流出液減壓濃縮成固體；所述的重結晶，就是將色譜法層析純化後得到的固體，在分析純級的有機溶媒乙酸乙酯或丙酮或包括乙醇在內的C1-C4醇或水中進行重結晶1-4次，得到奇壬醇結晶純品。
2.奇壬醇在製備治療抗類風溼性關節炎的藥中的應用。
3.奇壬醇在製備鎮痛藥中的應用。
4.奇壬醇在製備抗菌藥中的應用。
5.奇壬醇在製備抗瘧藥中的應用。
6.奇壬醇在製備降壓藥中的應用。
7.奇壬醇在製備舒張血管藥中的應用。
8.奇壬醇在製備免疫抑制劑藥中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種從植物、特別是從藥用植物豨薟草中分離提取和純化化合物奇壬醇的方法以及該化合物在醫藥中的應用,以奇壬醇作為先導化合物製成的藥劑,具有抗類風溼性關節炎、鎮痛、抗菌、抗瘧、降壓、舒張血管等功效,並具有毒性低、藥效明顯的優點。
文檔編號C07C35/42GK1380277SQ02116909
公開日2002年11月20日 申請日期2002年4月26日 優先權日2002年4月26日
發明者林文翰, 付宏徵, 李軍 申請人:林文翰