腺梗豨薟中抗血栓作用的活性組分與它的製備方法及應用的製作方法

2023-04-27 05:47:01

專利名稱：腺梗豨薟中抗血栓作用的活性組分與它的製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬中藥技術領域。具體涉及一種腺梗豨薟抗血栓活性組分及製備方法。
近年來，國內外學者對豨薟草進行了較深入的化學、藥理學研究。
豨薟草中主要含有二萜類、倍半萜類、黃酮類等成分，三種原植物中所含成分類似。其中的主要活性成分為二萜及其甙類成分。
豨薟中二萜類成分豨薟甙(darutoside)及其甙元豨薟苦味三醇(darutigenol)最早由法國人Diara分離得到，後又報導從中得到異豨薟苦味三醇B和C(isodalutogenol B、C)、豨薟苦味四醇(pimar-8(14)-ene-6β，15，16，18-tetraol)、豨薟苦味醇酸(16、17-dihydroxy-16β-kauran-19-oic acid)等二萜類成分，最近報導從該種中又得到二個新的二萜類化合物豨薟酯酸(Siegesesteric acid)和豨薟醚酸(Siegesetheric acid)。
腺梗豨薟中的二萜類成分除豨薟甙、豨薟苦味四醇外，主要為海松烷型和貝殼杉烷型二萜類成分腺梗豨薟萜二醇酸、腺梗豨薟萜醇酸、腺梗豨薟萜四醇、腺梗豨薟萜三醇甙、腺梗豨薟萜二酸，近年來報導的新二萜成分有豨薟醚酸(siegesmethyletheric acid)、12-羥基奇壬醇(12-hydroxy-kirenol)、2-酮基-16-乙醯基奇壬醇(2-keto-16-acetyloxykirenol)，最近從該種中得到的一木脂素類化合物二香草基四氫呋喃(epoxylignan)，具有顯著的抗血小板聚集作用。
毛梗豨薟中二萜類成分也有豨薟甙及其甙元豨薟苦味三醇、豨薟苦味醇酸，另含有豨薟新甙(neodarutoside)、siegesbeckioside、豨薟精醇(darutigenol)，豨薟糖甙(darutoside)等[9]二萜類成分。最近，許雲龍等又其中分到四個化合物對映-16β、17-二羥基、貝殼杉烷-19-羧酸(ent-16β、17-dihydroxy-19-oic acid)、奇壬醇(kirenol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)和胡蘿蔔甙(daucos terol)。
表1、豨薟草中主要二萜類成分化合物名稱 存在的原植物結構類型 文獻16，17-dihydroxy-16β Siegesbeckia 貝殼杉烷型 29，30，31(-)-kauran-19-oic acid pubescens腺梗豨薟萜二酸 S.pubescens貝殼杉烷型 31腺梗豨薟萜醇酸 S.pubescens貝殼杉烷型 3，30腺梗豨薟萜醇酸異丁酸酯 S,pubescens貝殼杉烷型 3，30腺梗豨薟萜四醇 S.pubescens貝殼杉烷型 29豨薟酯酸 S.orientalis 貝殼杉烷型 4豨薟醚酸 S.orientalis 貝殼杉烷型 4豨薟苦味醇酸 S.orientalis 貝殼杉烷型 3腺梗豨薟萜二醇酸 S.pubescens貝殼杉烷型 3對映-16 β、17、18-三羥基-貝 S.pubescens貝殼杉烷型 43殼杉-19-羧酸奇壬醇 S.pubescens海松烷型 315-乙醯基-奇壬醇 S.orientalis 海松烷型 612-羥基奇壬醇S.pubescens海松烷型 62-酮基-16-乙醯基奇壬醇 S.pubescens海松烷型 7豨薟精醇 S.orientalis 海松烷型 27豨薟糖醇 S.orientalis 海松烷型 3豨薟苦味三醇 S.orientalis 海松烷型 3豨薟新甙 S.glabrescens 海松烷型 26異豨薟苦味三醇B S.orientalis 海松烷型 3異豨薟苦味三醇C S.orientalis 海松烷型 3豨薟苦味四醇 S.orientalis 海松烷型 3腺梗豨薟糖甙 S.pubescens海松烷型 32.αβ，15， S.orientalis 海松烷型 2316-trihydroxy-ent-pimar-g(14)ene15，16-Dihydroxy-2- S.orientalis 海松烷型 23oxo-ent-pimar-8(14)-ene.
15，16，18-trihydroxy-2-oxo-ent S.orientalis 海松烷型 23pimar-8(14)-ene19-Acetoxy-12-oxo-10，11 S.orientalis 鏈狀二萜 23-dihydrogeranylnerol12-oxo-13，14E-dehydro- S.orientalis 鏈狀二萜 2310，11.14.15-tetrohydro-geranylnerolgeranylnerol S.orientalis鏈狀二萜23表2、豨薟草中其他類成分化合物名稱 存在的原植物 結構類型 文獻9β-hydroxy-8β- S.orientais 吉馬烷型 23isobytyrloxycostunolide9β-hydroxy-8β- S.orientais 吉馬烷型 23methacryloxycostunolide
14-hydroxy-8β- S.orientais 吉馬烷型 23isobutyryloxycostunolide8β-isobytyryloxy-14- S.orientais 吉馬烷型 23alcostunolide9β-dihydroxy-8β-S.orientais 吉馬烷型 23isobutyxyloxycostunolide8-isobutyryloxy-1β，10αS.orientais 吉馬烷型 23-epoxycostunolide9β-hydoxy-8β S.orientais 吉馬烷型 23-isobutyryloxy-1β.10αepoxycostunolide8β，9β-dihydroxy-1β，10α- S.orientais 吉馬烷型 23epoxy-11β，13-dihydrocostunolide14-hydroxy-8β-isobutyryloxy S.orientais 吉馬烷型 23豨萜醛內酯S.orientais 無柄鏽交酯型 3115-hydroxy-9α-acetoxy-8β S.orientais 柄鏽交酯型 23isobutyryloxy-14-oxo-melampolide9α-15-dihydroty-8- S.orientais 無柄鏽交酯型 23isobutyryloxy-14-oxo-melampolide.15-hydroxy-8βS.orientais 柄鏽交酯型 23isobutyryloxy-14-oxo-melamolideβ-谷甾醇 S.orientais 甾醇類 4豆甾醇S.orientais 甾醇類 4胡蘿蔔甙 S.orientais 甾醇類 43，7-二甲基槲皮甙 S.orientais 黃酮類 29二香草基四氫呋喃 S.glabrescens香豆素類 8藥理學研究表明，豨薟草在心血管系統、抗炎、抗病原微生物、免疫系統以及抗早孕方面均有良好的活性，並證實其中的主要活性成分為二萜類成分。1、抗菌作用通過平板打洞法試驗證明金黃色葡萄球菌對豨薟草高度敏感，大腸桿菌、綠膿桿菌、宋氏痢疾桿菌、傷寒桿菌輕度敏感，對白色葡萄球菌、卡他球菌、腸炎桿菌、獵霍亂桿菌有抑菌作用，但對副大腸桿菌、福氏痢疾桿菌、炭疽桿菌、甲型鏈球菌無抑菌作用。2、抗炎作用豨薟草對大鼠注射甲醛或雞蛋清所產生的關節腫有明顯的抗炎作用，其療效與水楊酸鈉300ml/kg腹腔注射相似。實驗證明腺梗豨薟萜二醇酸有較好的抗炎作用，腺梗豨薟萜醇酸也有抗炎作用。3、對心血管方面的作用對心血管系統方面研究表明，豨薟草的水和乙醇浸出液有降低麻醉動物血壓的作用，口服二萜類成分腺梗豨薟萜二醇酸(50mg/kg.d)連續10天，對腎型高血壓大鼠有降壓作用。以Okamoto-SHR高血壓動物為模型，口服腺梗豨薟萜二醇酸(50mg/kg.d)並與心得安(75mg/kg.d)對照，示該成分有顯著抗高血壓作用[13]。腺梗豨薟提取液能使保留神經的兔耳血管舒張，並能阻斷刺激神經引起的收縮血管反應，其血管舒張作用是通過阻斷交感收縮血管神經的影響而產生的。另外豨薟草90％的甲醇提取物對ACE(血管緊張肽轉變因子酶)抑制率可達30％-40％。豨薟草還能改善微循環，減輕血栓溼重。用0.6g(生藥)/ml的豨薟草注射液對小鼠腸繫膜微循環障礙後的血流恢復作用與0.3g(生藥)/ml的複方丹參注射液的作用相當，家兔靜脈注射豨薟草提取物，可使血栓溼重明顯減輕，表明豨薟草對血栓形成有抑制作用，其抑制率為51.41％。4、免疫抑制作用實驗表明，豨薟草煎劑對小鼠的免疫功能有顯著的影響，結合淋巴細胞絕對值減少和Ea、Et花環形成率下降，結合血清抗體滴度降低細胞內DNA和RNA吖橙螢光減弱，小白鼠腹腔巨噬細胞功能下降，血清溶菌酶活性降低。說明豨薟草對小白鼠細胞免疫、體液免疫和非特免疫均有抑制作用。5、抗瘧作用豨薟草煎劑按100g/kg給大鼠灌胃，對鼠瘧原蟲抑制率達90％。6、抗生育作用等觀察到大鼠腹腔注射毛梗豨薟醇提取物至1.7g生藥/kg劑量時，有明顯抗早孕作用。從中分離到的豨薟甙在20-40mg/kg劑量時，對大鼠有明顯，抗早孕作用。
最近報導腺梗豨薟甲醇提取液對愛滋病病毒蛋白酶(HIV-lprotease)也有較強的抑制作用。
本發明提供了腺梗豨薟草的抗血栓活性組分，該活性組分包括奇壬醇(kirenol 1)、豨薟精醇(darutigenol 2)、對映-17、18-二羥基貝殼杉烷-19-羧酸(ent-17，18-dihydroxy kauran-19-oic acid 3)、對映-16、17-二羥基貝殼杉烷-19-羧酸(ent-16，17，-dihydroxy kauran-19-oic acid4)、對映-17-羥基貝殼杉烷-19-羧酸(ent-16αH，17-hydroxykauran-19-oic acid 5)、3』、5』、β-三羥基，3、4、4』、α、-四甲氧基查兒酮(3』、5』、β-trihydroxy，3、4、4』、α、-tetramethoxy-chalcone 6)、以及豆甾醇(Stigmasterol7)。其中3』、5』、β-三羥基，3、4、4』、α、-四甲氧基查兒酮是新化合物，對映-17-羥基貝殼杉烷-19-羧酸為首次從豨薟屬植物中分離得到。 化合物6的結構式

化合物6的NMR波譜數據。化合物6的主要HMBC相關示意圖見

圖1。抗血栓有效組分化學成分分析(一)豨薟草抗血栓有效組分化學成分的指紋圖譜分析為確保豨薟草抗血栓有效組分質量的穩定及可控，我們採用HPLC的方法對5批豨薟草抗血栓有效組分進行了指紋圖譜分析，得到了分離、檢測的最佳條件。1、儀器和材料Agilentl100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配有自動進樣器，柱溫箱，二極體陣列檢測器(DAD)，四元泵，Agilent-ChemStation化學工作站。Pall純水器(美國Pall公司)，乙腈(色譜純，美國默克公司)。
樣品製備稱取5份腺梗豨薟，各20g，按有效組分的提取方法，平行操作，得到5個有效組分樣品。各取0.1g樣品，加入適量甲醇∶水1∶4的溶液，過C18預柱，再用甲醇洗脫，收集甲醇液，再用0.45μm的有機相濾膜過濾，作為樣品溶液。
對照品溶液製備取奇壬醇1mg，甲醇溶解，用0.45μm的有機相濾膜過濾，定容到10ml的容量瓶中，作為對照品溶液。2、色譜條件色譜柱Polaris C8-A5u，150×4.6mm檢測器DAD，215nm流動相乙腈-水(梯度，乙腈0min，20％；15min，35％；40min，80％)柱溫40℃流速1ml/min3、方法學考察(1)穩定性試驗取同一樣品溶液，分別在不同時間(0hr、2hr、4hr、12hr、24hr)檢測，其各峰的相對保留時間基本一致(見表3)，結果表明，樣品溶液穩定性好。
(2)表3、抗血栓有效組分指紋圖譜穩定性試驗(相對保留時間)(以奇壬醇為對照品)

(3)精密度試驗取同一樣品，連續進樣5次，其相對保留時間見表4，RSD小於2％，符合規定。
表4、抗血栓有效組分指紋圖譜精密度試驗(相對保留時間)(以奇壬醇為對照品)

(4)樣品測定取已製備好的5個樣品，分別進同樣的量，其相對保留時間見表5，共有峰相對峰面積見表6，相對峰面積的RSD小於2，符合規定。
表5、抗血栓有效組分指紋圖譜相對保留時間數據(以奇壬醇為對照品)

表6、抗血栓有效組分指紋圖相對峰面積數據(以奇壬醇為對照品)

4、結果分析結果表明，以乙腈-水梯度洗脫，在215nm下檢測，能夠獲得較多信息的指紋圖譜，且指紋圖譜分離度好、重現性高，可作為該有效組分的質量標準的一個重要指標。
試驗結果表明，豨薟草抗血栓有效組分指紋圖譜有14個共有峰，經與對照品對照，保留時間在9.826分鐘的色譜峰為奇壬醇，該有效組分的中主要有效成分為二萜類成分奇壬醇。(見圖2、圖3)(二)抗血栓有效組分化學成分的LC-MS分析為闡明豨薟草抗血栓有效組分中化學成分的類型，採用LC-APCIMS的方法，對有效組分進行了分析，進一步確證了該組分中化學成分是以奇壬醇為主的二萜類成分。1、儀器與試劑Thermo Finigan Surveyor LCQ DECA XP plus液-質聯用儀(美國Finigan公司)Pall純水器(美國Pall公司)，乙腈(色譜純，美國默克公司)。2、樣品與對照品稱取腺梗豨薟20g，按有效組分的提取方法提取製備。取0.1g樣品，加入適量甲醇∶水1∶4的溶液，過C18預柱，再用甲醇洗脫，收集甲醇液，再用0.45μm的有機相濾膜過濾，作為樣品溶液。
對照品溶液製備取奇壬醇1mg，甲醇溶解，用0.45μm的有機相濾膜過濾，定容到10ml的容量瓶中，作為對照品溶液。3、分析條件液相條件色譜柱C8，150×4.6mm，5um流動相乙腈∶水乙腈0min，20％；15min，35％；40min，80％柱溫40℃檢測器PDA，215nm流速1ml/min質譜條件正離子模式源電壓4.50kV毛細管電壓15V管透鏡補償電壓30VAPCI氣化溫度450℃毛細管溫度250℃霧化氣N2(80units)輔助氣N2(10units)負離子模式源電壓6.00kV毛細管電壓-15V管透鏡補償電壓-30VAPCI氣化溫度450℃毛細管溫度250℃霧化氣N2(80units)輔助氣N2(10units)4、結果1)對照品奇壬醇的LC-APCIMS測試採用上述分析條件測定了奇壬醇的正碳離子和負碳離子，分析結果見圖4、圖5、圖6、圖7。
奇壬醇APCIMS(正碳離子)給出準分子離子峰為356(M+NH4+)，其他主要碎片分別為321(M-OH)，303(M-H2O-OH)，285(M-2H2O-OH)。奇壬醇的APCIMS(負碳離子)只給出準分子離子峰為397(M+CH3CN+H2O)。2)有效組分的LC-APCIMS測定採用上述分析條件測定了抗血栓有效組分中化學成分的正碳離子和負碳離子，分析結果表7及見圖8、圖9、圖10。
表7、抗血栓有效組分LC-APCI-MS(正離子)數據分析結果

表8、抗血栓有效組分LC-APCI-MS(負離子)數據分析結果

根據海松烷型和貝殼杉烷型二萜類成分的裂解規律，分析結果表明，抗血栓有效組分中主要為這2類二萜，其中以奇壬醇為主。(三)抗血栓有效組分化學成分的定性、定量分析1、抗血栓有效組分TLC定性分析1)儀器與試劑CAMAG薄層成像儀(瑞士，CAMAG公司)，氯仿(分析純，上海化學試劑廠)，甲醇(分析純，上海化學試劑廠)，矽膠板(50×100mm，德國默克公司)2)樣品與對照品樣品溶液製備稱取腺梗豨薟20g，按有效組分的提取方法提取製備。取0.1g樣品，加入適量甲醇溶解，作為樣品溶液。
對照品溶液製備取奇壬醇1mg，甲醇溶解，用0.45μm的有機相濾膜過濾，定容到10ml的容量瓶中，作為對照品溶液。3)薄層條件展開劑，CHCl3∶CH3OH(6∶1)，顯色劑10％硫酸溶液，展距，8cm4)結果在上述薄層條件下展開，噴10％硫酸溶液，於105℃下加熱30分鐘，在CAMAG薄層成像儀用白光觀察，結果如圖11，其中1、——為抗血栓有效組分，S、——為對照品奇壬醇，其中主要有5個紫色斑點，與對照品相應的位置的斑點為奇壬醇，並可察見奇壬醇為主要成分。2、抗血栓有效組分中奇壬醇的含量測定1)儀器和材料Agilent1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配有自動進樣器，柱溫箱，二極體陣列檢測器(DAD)，四元泵，Agilent-ChemStation化學工作站。Pall純水器(美國Pall公司)，乙腈(色譜純，美國默克公司)。2)樣品與對照品樣品製備稱取5份腺梗豨薟，各100g，按有效組分的提取方法，平行操作，得到5個有效組分樣品。各取0.2g樣品，甲醇定容於50ml容量瓶中，作為樣品溶液。
對照品溶液製備精密稱取奇壬醇1.68mg，置於10ml容量瓶中，用甲醇豨釋至該刻度，搖勻，即得(每1ml中含奇壬醇168μg).
色譜條件色譜柱Lichrospher100，RP-18e(5um)，25cm流動相乙腈-水(25∶75)檢測器DAD，215nm柱溫40℃流速1ml/min3)標準曲線製備取對照品溶液分別進0.5μl，2.0μl，5.0μl，8.0μl，12.0μl，15.0μl，20.0μl，以奇任醇的量為橫坐標，吸收峰面積為縱坐標，進行回歸計算得回歸方程Y＝789.9941X-3.3156，相關係數r＝0.99998，線性範圍奇壬醇在0.084μg-3.36μg之間呈現良好的線性，結果見表9和圖12。
表9、線性關係考察進樣量(μg) 峰面積(mau*s)0.080 69.530.360 268.680.840 661.931.344 1058.892.016 1591.292.520 1983.993.360 2653.064)精密度試驗取濃度為0.168ug/ml的標準品溶液，連續進樣5次，每次5ul，測定奇任醇的吸收峰面積，結果見表10，RSD＝0.12％，＜2.0％，說明精密度較好。
表10、精密度試驗結果進樣次數(n) 峰面積(μV)平均(X) RSD(％)1 665.192 665.223 667.30665.86 0.124 665.615 665.965)穩定性試驗取樣品溶液，以奇壬醇的吸收峰面積進行考察，進樣6次，每隔5小時進樣20ul，結果表明樣品至少在24小時內穩定，其結果見表10，RSD＝0.75％，說明樣品的穩定性好。
表11穩定性試驗結果樣品放置時間(h)峰面積(μV) 平均(X) RSD(％)0 693.875 687.8110 689.89 689.32 0.7515 693.1320 679.5625 691.686).加樣回收率的測定取豨薟草樣品溶液，精密吸取1ml，分別置於9個5.0ml的容量瓶中，然後分別加0.168ug的奇壬醇對照品溶液0.2ml，0.2ml，0.2ml，0.25ml，0.25ml，0.25ml，0.3ml，0.3ml，0.3ml，並豨釋至該刻度，然後分別進樣20ul，結果見表12。按公式回收率＝測得奇壬醇量-樣品奇壬醇量/添加奇壬醇量對照品量得回收率平均值為101.89％。RSD＝1.34％表12加樣回收率的測定結果(單位ug)序 樣品中奇壬添加奇壬醇的 測得奇壬醇回收率(％) 平均回收率RSD(％)號 醇含量量 總量 (％)1 0.04341 0.0336 0.0775 101.52 0.04341 0.0336 0.0773 100.73 0.04162 0.0336 0.0762 102.94 0.04162 0.0420.0851 103.5 101.89 1.345 0.04162 0.0420.0837 100.20.04162 0.0420.0853 104.167 0.04162 0.0504 0.093 102.8 0.04162 0.0504 0.0923 100.59 0.04162 0.0504 0.0929 101.67)樣品測定取樣品溶液，過0.45μm微孔濾膜，採用上述色譜條件，進樣2ul，對5個樣品中奇壬醇的含量進行測定，結果表明，有效組分中奇壬醇的含量為10.6％，樣品色譜圖及測定結果見圖13、圖14和表13。表13、抗血栓有效組分中奇壬醇含量測定結果序號奇壬醇含量(％)平均含量(％)RSD(％)1 10.712 10.61310.64 10.6260.85410.69510.483、抗血栓有效組分中總二萜的含量測定儀器蛋白核酸分析儀DU-640(BECKAEN公司)試劑甲醇，香草醛，冰醋酸，高氯酸，乙酸乙酯，均為分析純。線性關係的考察對照品溶液的製備精密稱取奇壬醇對照品2.01mg，甲醇定容於10ml容量瓶中，即每毫升含奇壬醇0.201mg。精密稱取豨薟草抗血栓有效組分205.3mg.，用甲醇定容於50ml容量瓶中，作為供試液，精確吸取上述奇壬醇對照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml分別置試管中揮去溶劑，精密加入5％香草醛冰醋酸0.2ml，高氯酸0.8ml，混均，置70℃恆溫水浴上加熱15分鐘，冷卻至室溫，精密加入乙酸乙酯4ml，搖勻，在600m波長處，以第一管作空白對照測量吸收度繪製標準曲線(見圖15，縱座標為吸光度，橫座標為奇壬醇溶液)。樣品測定取供試品溶液0.1ml三份，按上法測定，結果見表14

抗血栓有效組分的藥理、毒理研究1、急性毒性實驗實驗材料1.動物昆明種小鼠，合格證號醫動02-24-3號，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。
2.受試藥物部位I、豨薟草抗血栓有效組分、部位III實驗方法與結果1.部位III小鼠半數致死量LD50的測定首先取少數健康小鼠禁食過夜後，進行預實驗，測出受試藥物引起0至100％死亡率的劑量範圍。然後取健康小鼠40隻，雌雄各半，體重20～22g，隨機分為4個劑量組(各劑量組組距為0.85)，禁食不禁水過夜，然後按等比劑量灌胃給藥。給藥後，嚴密觀察並記錄，用Bliss法進行統計，計算LD50。死亡動物立即進行屍檢，記錄病變情況。見表15表15、腺梗豨薟部位III小鼠急性毒性實驗結果動物數 劑量組別 死亡率(P)
(n) (g提取物/kg)1 10 20 0.82 10 17 0.63 10 14.45 0.44 10 12.28 0.0實驗顯示中毒死亡小鼠的表現症狀為活動減少，共濟失調，呼吸困難。死亡後動物屍解，發現胃底部充血，腫脹；其餘重要臟器(心、肝、脾、肺、腎)肉眼觀察，未發現異常情況。經計算LD50＝16.17g提取物/kg，相當於571.4g生藥/kg；LD50的95％可信度＝log-1(X50±1.96SX50)＝10.69～24.47g提取物/kgLD50的平均可信限＝16.17±6.89g提取物/kg2.部位I與豨薟草抗血栓有效組分最大給藥量的測定經預試，部位I與豨薟草抗血栓有效組分測不出LD50，故改為測定小鼠最大給藥量。分別取健康小鼠20隻，雌雄各半，體重20～22g，禁食不禁水過夜，以小鼠能接受的最大濃度(0.5g提取物/ml)，0.4ml/10g體重灌胃給藥1次。連續觀察7日。7日後，小鼠稱重，處死，解剖，肉眼觀察重要臟器(心、肝、脾、肺、腎)，並計算動物最大給藥量。結果顯示，1.小鼠給部位I後，各方面均正常。
2.小鼠給豨薟草抗血栓有效組分後1-2hr內，少量動物有豎毛現象，活動稍減，2hr後恢復正常。
3.兩組小鼠在以後的觀察期間內，食量、活動、大小便均正常，飼養7日後小鼠的體重均有增加，平均為26±2g，未見死亡。脫頸椎處死動物，肉眼觀察重要臟器(心、肝、脾、肺、腎)，均無異常發現。
4.經計算，部位I的最大給藥量為20g提取物/kg，相當於1626g生藥/kg，豨薟草抗血栓有效組分的最大給藥量為20g提取物/kg，相當於1747g生藥/kg。結論通過腺梗豨薟三個部位對小鼠的急性毒性實驗，表明部位III有一定的毒性，其半數致死量為16.17g提取物/kg(相當於571.4g生藥/kg)，部位I、豨薟草抗血栓有效組分無毒性，經測定部位I最大給藥量為20g提取物/kg，相當於1626g生藥/kg，豨薟草抗血栓有效組分最大給藥量為20g提取物/kg，相當於1747g生藥/kg。有效組分的藥理學實驗研究(一)、抗血栓活性篩選1、三種豨薟草總提物抗血栓作用的比較研究目的通過三種豨薟草抗血栓作用的比較，篩選出作用最好的種。實驗材料1.動物昆明種小鼠，合格證號醫動02-24-3號，SD品系大鼠，合格證號醫動02-24-4號。均由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。
2.試劑及儀器丹參注射液上海中西藥業股份有限公司，批號010104複方丹參片上海雷允上藥業有限公司，批號020802豨薟草總提物將三種豨薟草分別用乙醇回流提取，回收乙醇，分別得到三種豨薟草的總提取物。
鹽酸腎上腺素注射液(Adr)，上海禾豐製藥有限公司，批號0006017MR-4型多環血栓檢測儀，上海斯隆醫電設備有限公司產品實驗方法與結果1.對正常小鼠凝血時間的影響取健康小鼠80隻，雌雄各半，體重20±2g，隨機分為8組，ig給藥或等容積蒸餾水，每日1次，連續4日。未次給藥後1hr，摘眼球取血，以毛細玻管法測定凝血時間(CT)。結果顯示，三種豨薟草均可顯著延長小鼠凝血時間，其中腺梗豨薟作用更好些，與豨薟組比有顯著性差異。見表16.
表16 三種豨薟草總提物對正常小鼠凝血時間的影響


與正常組比**P＜0.01豨薟小劑量與腺梗豨薟小劑量比較ΔP＜0.052.對冰水-腎上腺素型大鼠血栓形成的影響[1]取健康SD大鼠90隻，雌雄各半，體重200±20g，隨機分為9組。ig給藥或等容積蒸餾水。每日1次，連續8日。於第7日除正常組外，其餘各組大鼠皮下注射Adr，每次0.5mg/kg體重，共2次，間隔4hr。正常組皮下注射等容積生理鹽水。處置後禁食不禁水過夜。第8日末次給藥後1hr，除正常組外，其餘各組大鼠均皮下注射Adr0.5mg/kg，20min後浸入冰水中5min。正常組動物僅皮下注射等容積生理鹽水。然後，所有動物用25％烏拉坦0.5ml/100g體重麻醉後，腹主靜脈取血1ml，按照Chandler體外法立刻將血注入旋轉環內，迅速密封。置血栓形成儀上，旋轉15min，傾出血栓，用濾紙吸乾表面鮮血，稱量血栓溼重。結果表明，毛梗豨薟小劑量組、腺梗豨薟大、小劑量組對冰水-腎上腺素造成的「血瘀」大鼠血栓形成有抑制作用，以腺梗豨薟的抑制作用為最強。見表17。表17三種豨薟草總提物對冰水-腎上腺素型大鼠血栓形成的影響

與模型組相比*P＜0.05**P＜0.01豨薟小劑量與腺梗豨薟小劑量比較ΔP＜0.053.對靜脈血栓型大鼠體內血栓形成的影響取健康SD大鼠80隻，雌雄各半，體重200±20g，隨機分為8組，ig給藥或等容積蒸餾水。每日1次，連續8日。末次給藥前禁食不禁水過夜，未次給藥後1hr，烏拉坦麻醉(麻醉劑量同前)，剖開大鼠腹部，於左腎靜脈下方用粗絲線結紮下腔靜脈。2hr後自結紮處下方2cm處縱行剖開管腔，取出血栓，吸乾表面鮮血，稱重，結果表明，毛梗豨薟小劑量組、豨薟大、小劑量組、腺梗豨薟大、小劑量組均可抑制大鼠靜脈體內血栓的形成，各組間作用無顯著性差異。見表18。表18三種豨薟草總提物對靜脈血栓型大鼠體內血栓形成的影響

與正常組比**P＜0.01*P＜0.05結論上述實驗採用兩種血瘀動物模型血栓形成及一種正常動物凝血時間的測定方法，對三種藥典中收載的豨薟草進行了抗血栓作用的比較，結果顯示三種豨薟草總提取物均有延長小鼠凝血時間及不同的抗血栓的作用，其中以腺梗豨薟抗血栓作用為好。(二)、腺梗豨薟草三個不同部位提取物抗血栓作用的比較研究目的尋找腺梗豨薟草的有效部位。實驗材料1.動物昆明種小鼠，合格證號醫動02-24-3號，SD品系大鼠，合格證號醫動02-244號。均由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。
2.試劑及儀器丹參注射液上海中西藥業股份有限公司，批號010104複方丹參片上海雷允上藥業有限公司，批號020802
腺梗豨薟三個部位將腺梗豨薟草的總提取物分別用不同極性的溶劑提取，按極性大小分為部位I、部位II和部位III鹽酸腎上腺素注射液(Adr)，上海禾豐製藥有限公司，批號0006017MR-4型多環血栓檢測儀，上海斯隆醫電設備有限公司實驗方法與結果1.對正常小鼠凝血時間的影響取健康小鼠80隻，雌雄各半，體重20±2g，隨機分為8組，ig給藥或等容積蒸餾水，每日1次，連續4日。末次給藥後1hr，摘眼球取血，以毛細玻管法測定凝血時間(CT)，結果表明，部位II小劑量能夠顯著延長小鼠的凝血時間，與部位I、III相比較有顯著性差異。見表19。
表19腺梗豨薟三個部位提取物對正常小鼠凝血時間的影響

與正常組比*P＜0.05，**P＜0.01與部位II小劑量比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.012.對正常小鼠出血時間的影響[1]取健康小鼠70隻，雌雄各半，體重20±2g，隨機分為7組，ig給藥或等容積蒸餾水。末次給藥後1hr，以利剪將小鼠尾尖5mm處橫斷，並迅速將鼠尾浸入裝有37℃水的試管中，由血液自行溢出開始計時，至血液自然停止(無血絲落下)為止。計算出血時間(BT)，結果表明，三個部位均有延長小鼠出血時間的作用，各組間作用無顯著性差異。見表20。
表20 腺梗豨薟三個部位提取物對正常小鼠出血時間的影響


與正常組比，*P＜0.05，**P＜0.013.對靜脈血栓型大鼠體內血栓形成的影響取健康大鼠70隻，雄性。體重200±20g，隨機分為7組，ig給藥或等容積蒸餾水。每日1次，連續8日，處置前禁食不禁水過夜。末次給藥後1hr，用烏拉坦麻醉(劑量同前)，於左腎靜脈下方用粗絲線結紮下腔靜脈，2hr後自結紮處下方2cm處縱行剖開管腔，取出血栓，吸乾表面鮮血，稱重，結果顯示，三個部位均有抗血栓作用，各組間作用無顯著性差異。見表21。表21、腺梗豨薟三個部位提取物對靜脈血栓型大鼠體內血栓形成的影響

與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.014.腺梗豨薟部位I、II對冰水-腎上腺素型大鼠血栓形成的影響根據急性毒性實驗結果，認為部位III相對毒性較大，故下列實驗僅選用部位I與部位II進行抗血栓作用的比較研究。
取健康SD大鼠42隻，雄性，隨機分為6組。ig給藥或等容積蒸餾水。每日1次，連續8日。於第7日除正常組外，其餘各組大鼠皮下注射Adk，每次0.5mg/kg體重，共2次，間隔4hr。正常組皮下注射等容積生理鹽水。處置後禁食不禁水過夜。第8日末次給藥後1hr，除正常組外，其餘各組大鼠均皮下注射Adr0.5mg/kg，20min後浸入冰水中5min。正常組動物僅皮下注射等容積生理鹽水。然後，所有動物用烏拉坦麻醉(劑量同前)後，腹主動脈取血2ml，按照Chandler體外法立刻將血注入旋轉環內，迅速密封。置血栓形成儀上，旋轉15min，傾出血栓，用濾紙吸乾表面鮮血，將血栓條置80℃烘箱1hr，恆重後稱重，即為血栓乾重，結果顯示，部位II可顯著減輕血栓乾重，其作用顯著強於部位I，見表22。表22腺梗豨薟I、II部位對冰水-腎上腺素型大鼠體內血栓形成的影響

與模型組比**P＜0.01部位I大劑量與部位II大劑量比較ΔΔP＜0.01結論1.腺梗豨薟部位II延長正常小鼠凝血時間的作用顯著強於部位I和III。2.腺梗豨薟三個部位均能延長小鼠的出血時間，並對靜脈血栓型大鼠體內血栓的形成有顯著的抑制作用。3.部位II能顯著抑制冰水-腎上腺素型大鼠血栓的形成。
綜合上述結果，結合藥效與毒理研究，初步認為部位II抗血栓作用較強且毒性較小，部位II值得進一步研究。(三)梗豨薟部位II與IIA抗血栓作用研究目的1.尋找部位II的有效劑量及作用機理初探2.進一步尋找抗血栓的有效組分實驗材料1.動物昆明種小鼠，合格證號醫動02-24-3號，SD品系大鼠，合格證號醫動02-24-4號。均由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。2.試劑及儀器複方丹參片上海雷允上藥業有限公司，批號020802腺梗豨薟部位II提取方法同前。抗血栓有效組分，將部位II進一步分離純化的有效組分(簡稱IIA)。鹽酸腎上腺素注射液(Adr)，上海禾豐製藥有限公司，批號0006017MR-4型多環血栓檢測儀，上海斯隆醫電設備有限公司SN-682放射免疫γ計數器，中國科學院上海原子核研究所日環儀器廠實驗方法與結果1.部位II對冰水-腎上腺素型大鼠血栓形成的影響取健康大鼠58隻，雄性，隨機分為6組，ig給藥或等容積蒸餾水。每日1次，連續8日。於第7日除正常組外，其餘各組大鼠皮下注射Adr，每次0.5mg/kg體重，共2次，間隔4hr。正常組皮下注射等容積生理鹽水。處置後禁食不禁水過夜。第8日末次給藥後1hr，除正常組外，其餘各組大鼠均皮下注射Adr0.5mg/kg，20min後浸入冰水中5min。正常組動物僅皮下注射等容積生理鹽水。然後，所有動物用烏拉坦麻醉(劑量同前)後，腹主動脈取血2ml，按照Chandler體外法立刻將血注入旋轉環內，迅速密封。置血栓形成儀上，旋轉15min，傾出血栓，用濾紙吸乾表面鮮血，稱量血栓溼重。將血栓條置80℃烘箱1hr，恆重後稱量，即為血栓乾重。結果表明，腺梗豨薟部位II可顯著減輕血栓溼重和乾重，在劑量為55mg提取物/kg時有顯著意義。見表23。
表23、腺梗豨薟部位II對冰水-腎上腺素型大鼠血栓形成的影響


與模型組比較*P＜0.05**P＜0.012.腺梗豨薟部位II和IIA對冰水-腎上腺素型大鼠凝血系統的影響取健康大鼠74隻，雄性，隨機分為7組。ig給藥或等容積蒸餾水。每日1次，連續8日。於第7日除正常組外，其餘各組大鼠皮下注射Adr，每次0.5mg/kg體重，共2次，間隔4hr。正常組皮下注射等容積生理鹽水。處置後禁食不禁水過夜。第8日末次給藥後1hr，除正常組外，其餘各組大鼠均皮下注射Adr0.5mg/kg，20min後浸入冰水中5min。正常組動物僅皮下注射等容積生理鹽水。然後，所有動物用烏拉坦麻醉(劑量同前)後，腹主動脈取血5ml，其中2ml血注入放有3.8％枸櫞酸鈉的試管中(抗凝劑和全血的比例為1∶9)，3ml血注入含有消炎痛-EDTA-Na2液0.2ml試管內，4℃，3500rpm，離心15min，分離血漿。按試劑藥盒說明書測定凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、白陶土部分凝血活酶時間(KPTT)和TXB2。結果顯示，部位II與IIA能顯著抑制冰水-腎上腺素型大鼠血栓形成，顯著延長大鼠凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、白陶土部分凝血活酶時間(KPTT)，明顯降低血中TXB2的含量。見表24表24腺梗豨薟部位II及IIA對冰水-腎上腺素型大鼠凝血功能的影響

與模型組比**P＜0.01*P＜0.05PTII大與IIA大比較ΔP＜0.05TTII大與IIA大比較ΔΔP＜0.01結論1.通過腺梗豨薟部位II對冰水-腎上腺素型大鼠血栓形成影響的實驗研究，尋找出部位II在劑量為55mg提取物/kg即有效。2.IIA為部位II進一步分離純化的組分，經測定凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、白陶土部分凝血活酶時間(KPTT)和TXB2，表明IIA有抑制大鼠內源性及外源性凝血系統和抗血小板聚集的作用，顯示IIA應為豨薟草抗血栓作用的有效組分。
本發明的另一目的是提供了腺梗豨薟草抗血栓活性組分的製備方法，該方法為將腺梗豨薟用70％乙醇分別於1小時、小時、0.5小時回流提取3次，合併提取液加收乙醇，得提取物，然後按極性大小，將總提取物分別用石油醚、乙酸乙酯、甲醇萃取，得到小極性部位I、中極性部位II和大極性部位III，將中極性部位經活性炭脫色得豨薟草抗血栓活性組分。
社會效益與經濟效益預測通過系統的活性篩選和化學成分研究，闡明了豨薟草抗血栓活性組分中的藥效物質基礎和初步的作用機理，為二類中藥新藥的研製奠定了良好的基礎，同時，傳統中藥向現代意義的中藥過渡，也必將產生一定的社會效益與巨大的經濟效益。
權利要求
1.一種豨薟草抗血栓有效組分，其特徵在於該組分包括奇壬醇(kirenol 1)、豨薟精醇(darutigenol 2)、對映-17、18-二羥基貝殼杉烷-19-羧酸(ent-17，18-dihydroxy kauran-19-oic acid 3)、對映-16、17-二羥基貝殼杉烷-19-羧酸(ent-16，17，-dihydroxy kauran-19-oic acid 4)、對映-17-羥基貝殼杉烷-19-羧酸(ent-16αH，17-hydroxy kauran-19-oic acid 5)、3』、5』、β-三羥基，3、4、4』、α、-四甲氧基查兒酮(3』、5』、β-trihydroxy，3、4、4』、α、-tetramethoxy-chalcone 6)、以及豆甾醇(Stigmasterol 7)。
2.根據權利要求1所述的一種豨薟草抗血栓有效組分，其特徵在於其中所述3』、5』、β-三羥基，3、4、4』、α-四甲氧基查兒酮具有下列結構。 化合物6的結構式
3.一種如權利要求1所述的豨薟草抗血栓有效組分的分離方法，其特徵在於該方法為將腺梗豨薟用70％乙醇分別於1小時、小時、0.5小時回流提取3次，合併提取液加收乙醇，得提取物，然後按極性大小，將總提取物分別用石油醚、乙酸乙酯、甲醇萃取，得到小極性部位I、中極性部位II和大極性部位III，將中極性部位經活性炭脫色得豨薟草抗血栓活性組分。
4.一種如權利要求1所述的豨薟草抗血栓有效組分的指紋圖譜分析方法，其特徵在於該分析方法為(1)儀器和材料高效液相色譜儀，配有自動進樣器，柱溫箱，二極體陣列檢測器DAD，四元泵，Agilent-ChemStation化學工作站，Pall純水器，乙腈；樣品製備稱取5份腺梗豨薟，各20g，按有效組分的提取方法，平行操作，得到5個有效組分樣品，各取0.1g樣品，加入適量甲醇∶水1∶4的溶液，過C18預柱，再用甲醇洗脫，收集甲醇液，再用0.45μm的有機相濾膜過濾，作為樣品溶液；對照品溶液製備取奇壬醇1mg，甲醇溶解，用0.45μm的有機相濾膜過濾，定容到10ml的容量瓶中，作為對照品溶液；(2)色譜條件色譜柱Polaris C8-A5u，150×4.6mm檢測器DAD，215nm流動相乙腈-水(梯度，乙腈0min，20％；15min，35％；40min，80％)柱溫40℃流速1ml/min試驗結果表明，豨薟草抗血栓有效組分指紋圖譜有14個共有峰，經與對照品對照，保留時間在9.826分鐘的色譜峰為奇壬醇，該有效組分的中主要有效成分為二萜類成分奇壬醇。
5.一種如權利要求1所述的豨薟草抗血栓有效組分在製備心血管系統藥中的應用。
全文摘要
本發明屬中藥技術領域。本發明公開了採用抗血栓活性指標對豨薟草進行活性篩選，得到豨薟草抗血栓有效組分，並分離得到10餘個化合物，通過化學成分分析確定了主要成分的化學結構，建立了該組分的分析方法及指紋圖譜，為創製抗血栓中藥奠定基礎，有較好的發展前景。
文檔編號A61P7/00GK1453258SQ0311709
公開日2003年11月5日 申請日期2003年5月23日 優先權日2003年5月23日
發明者侴桂新, 金若敏, 王崢濤 申請人:上海中醫藥大學