一種米爾貝肟的分離純化方法
2023-04-27 23:00:01 1
一種米爾貝肟的分離純化方法
【專利摘要】本發明提供了一種米爾貝肟的分離純化方法，包括以下步驟：將待分離樣品採用矽膠柱層析進行粗分離，所述矽膠柱層析採用溼法裝柱、幹法上樣；將粗分離後的產物採用高效液相色譜純化；將純化後的樣品採用納濾膜進行濃縮，製得濃縮液；將濃縮液減壓蒸發，然後過濾乾燥後製得精純品；將精純品溶解後升溫，再滴加異辛醇、正庚烷或石油醚，然後降溫使其結晶，過濾後製得結晶品；將結晶品溶解後過濾，將濾液滴加至持續攪拌的純淨水中，滴加完成後抽濾製得轉晶品；將轉晶品進行乾燥，乾燥後進行粉碎，粉碎後重新乾燥即製得米爾貝肟成品。該方法在國內首次實現了米爾貝肟的工業化生產，並且所製得產品純度和收率均高於國內外同類產品。
【專利說明】—種米爾貝肟的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於化學品的分離純化領域，具體涉及一種半合成大環內酯類驅蟲藥米爾貝肟的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]米爾貝月虧(Milbemycin Oxime)是大環內酯類抗體內外寄生蟲藥物,是米爾貝黴素A3和A4的肟衍生物，其中米爾貝A4肟不得低於80%。A3肟不得超過20%。米爾貝肟具有廣譜的抗寄生蟲作用，對體內、體外寄生蟲特別是線蟲和節肢動物有良好的驅殺作用。Lee等通過米爾貝肟對廣東血圓線蟲和犬惡絲蟲體外活力的神經藥理學機制研究顯示，米爾貝月虧對兩種蟲體的抑制和刺激效應是通過的gabergic和膽鹼能機制實現的。藥物與祀蟲細胞上的特異性高親合力的位點結合，影響了細胞膜對Cl-的通透性，繼而引起線蟲的神經細胞及節肢動物的肌細胞抑制性神經遞質Y-氨基丁酸(GABA)的釋放量增加，打開穀氨酸控制的Cl-通道，增強神經膜對Cl-的通透性，GABA作用於突觸前神經末梢，減少興奮性遞質的釋放，使突觸後膜產生興奮性突觸後電位減弱，突觸後神經元因膜電位的去極化程度達不到閾值而不能進入興奮狀態，從而引起抑制，蟲體麻痺、死亡。哺乳的主要外周神經傳遞介質是乙醯膽鹼，不受影響，雖然此類藥對大腦中樞神經系統內的GABA有一定影響，但其不易通過血一腦屏障，因此在推薦使用劑量下使用對脊椎動物無毒副作用。本類藥物進入到體內後極少分布到哺乳動物腦組織，因此可以選擇性地作用於宿主的體內外寄生蟲，而對動物宿主本身不表現作用。
[0003]關於米爾貝肟的文獻報導主要集中在米爾貝黴素的發酵和菌種選育方面，尚無米爾貝肟分離純化的文獻報導。CN 101037442A公開了一種利用冰城鏈黴菌製備α -型米爾貝黴素的方法。該方法採用甲醇提取，乙酸乙酯萃取，矽膠層析及C18製備色譜純化得到α -型米爾貝黴素。徐倩倩等在《中國獸藥雜誌》上發表的米爾貝肟的研究進展，該文綜述了米爾貝肟的理化性質、作用機理以及對各種體外寄生蟲的驅殺作用。目前該藥已在日本、美國、歐盟等國家上市，國內尚未有關於米爾貝肟的分離純化的文獻報導。
【發明內容】
[0004]本發明解決了【背景技術】中的不足，提供了一種米爾貝肟的分離純化方法，該方法在國內首次實現了米爾貝肟的工業化生產，並且所製得產品純度和收率均高於國內外同類
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[0005]實現本發明上述目的所採用的技術方案為:
[0006]一種米爾貝肟的分離純化方法，包括以下步驟:(I)、將待分離樣品採用矽膠柱層析進行粗分離，所述矽膠柱層析採用溼法裝柱、幹法上樣，上樣量為柱體積的5%?20% ；
[0007](2)、將粗分離後的產物採用高效液相色譜純化；
[0008](3)、將純化後的樣品採用納濾膜進行濃縮，製得濃縮液，所述納濾膜的截留分子量為 200 ?100Da ；
[0009](4)、將濃縮液減壓蒸發，然後過濾乾燥後製得精純品；
[0010](5)、將精純品採用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯溶解後升溫，再滴加異辛醇、正庚烷或石油醚，然後降溫使其結晶，過濾後製得結晶品；
[0011]￠)、將結晶品用甲醇、乙醇或丙酮溶解後過濾，將濾液滴加至持續攪拌的純淨水中，滴加完成後抽濾製得轉晶品；
[0012](7)、將轉晶品進行乾燥，乾燥後進行粉碎，粉碎後重新乾燥即製得米爾貝肟成品。
[0013]所述步驟(I)中所述的溼法裝柱具體為:將矽膠用0.8?2.5倍體積的氯仿浸泡並攪拌均勻後倒入柱內，柱床的高徑比控制在(8?15):1，然後用正己烷、正庚烷、異辛烷或石油醚洗脫平衡，洗脫體積為I?4個柱體積。
[0014]所述步驟(I)中所述的幹法上樣具體為:將待分離樣品用丙酮溶解，再與矽膠拌勻,在35?45°C下真空乾燥4?1h,所述丙酮、娃膠與樣品質量比為(0.25?2): (0.7?
1.5):1。
[0015]所述的矽膠柱層析中的流動相為溶劑A與溶劑B按照(90?99):1的體積比混合後的混合溶劑，其中溶劑A為正己烷、正庚烷、異辛烷及石油醚中的一種，溶劑B為甲醇、丙酮及乙酸乙酯中的一種。
[0016]所述步驟⑵中所述高效液相色譜所用填料為CS矽膠，填料粒徑為3?10 μ m，比表面積為200?600m2/g。流動相為甲醇、乙腈和水的混合物，其比例為:(70?90): (5?10): (5 ?20)。
[0017]所述步驟(2)中所述高效液相色譜採用甲醇-三氯甲烷溶解上樣，甲醇與三氯甲烷體積比為(0.8?1.8): 1，樣品濃度為0.80?1.5g/mL，進樣量為每千克填料每次進5?15g樣品。
[0018]所述步驟(3)中所述納濾膜為聚偏氟乙烯、聚醯胺、聚醚碸和殼聚糖中的一種。
[0019]所述步驟(5)的具體方法為:先用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯將精純品溶解，所用溶劑體積與精純品質量之比為(0.8?3):lmL/g ;然後將溶液置於40?70°C攪拌，攪拌速度為30?90rpm ;達到設定溫度後開始滴加異辛醇、正庚烷、石油醚中的一種，滴加時間為10?30min ;待出現渾濁後將溫度調節為10?30°C，繼續攪拌3?8h後過濾。
[0020]所述步驟(6)的具體方法為:先用甲醇、乙醇或丙酮將結晶品溶解，所用溶劑體積與結晶品質量之比為(4?7):lmL/g ;溶解後的溶液用0.45 μ m濾膜過濾，將濾液滴加到劇烈攪拌且經過濾的純化水中，攪拌速度為30?90rpm，濾液的滴加時間為I?3h，滴加完成後繼續攪拌30min?2h ;最後採用G4砂芯漏鬥抽濾製得轉晶品。
[0021]所述步驟(7)的具體方法為:將轉晶品放入真空乾燥箱中進行乾燥，乾燥溫度為30?40°C，乾燥時間為10?20h，乾燥後進行粉碎，過100目?300目篩，粉碎後重新置於真空乾燥箱中進行乾燥，乾燥溫度55?75°C，乾燥時間4?7h，最後即製得米爾貝肟成品。
[0022]本發明提供的米爾貝肟的分離純化方法與現有技術相比存在以下優點:1、本發明能夠實現工業化生產。2、本發明所製得的產品純度可高達99 %，收率可高達96 %，兩者均高於現有的同類產品。3、在本發明中創造性的使用了納米過濾技術，實現了溶劑的循環使用，既降低了成本，又減少了環境汙染，而且大大提高了產能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明實施例1中所使用的米爾貝肟粗品液相色譜檢測所得的譜圖；
[0024]圖2為本發明實施例1中所製得的米爾貝肟成品液相色譜檢測所得的譜圖；
[0025]圖3為米爾貝肟的USP對照品液相色譜檢測所得的譜圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖及具體實施例對本發明做詳細具體的說明，但是本發明的保護範圍並不局限於以下實施例。
[0027]實施例1
[0028](I)、稱取120g米爾貝肟粗品，粗品的液相色譜檢測譜圖如圖1所示，其中米爾貝月虧A4標定含量為8.4 %,米爾貝月虧A3的標定含量為5.6 %,將米爾貝月虧粗品用IlOg丙酮溶解，再加入120g矽膠拌勻，置於真空乾燥箱中在35?45°C下真空乾燥4?1h ;再稱取240g柱層析矽膠，將矽膠用0.8?2.5倍體積的氯仿浸泡並攪拌均勻後倒入Φ6.8CmX100Cm玻璃層析柱內，拍打均勻，用1500mL正庚烷洗脫平衡；然後將乾燥後的混合物用300mL正庚烷調勻，加載到柱上，上樣量為柱體積的5%?20% ;
[0029]採用正庚烷/丙酮的混合溶劑作為流動相進行洗脫，正庚烷/丙酮的體積比為97:3, HPLC監測米爾貝肟的洗脫情況，收集米爾貝肟A3和A4總純度大於40%的組分，35°C減壓蒸乾，得米爾貝肟粗純品47.5g。
[0030](2)、高效液相色譜所用填料為C8矽膠，填料粒徑為3?10 μ m，比表面積為200?600m2/g。
[0031]將米爾貝肟粗純品用25mL三氯甲烷和25mL甲醇混合溶劑溶解，用進樣針吸取40mL注入進樣閥上樣，進樣量為每千克填料每次進5?15g樣品。
[0032]採用甲醇/乙腈/水的混合溶液作為流動相洗脫，三者的體積比為75:10:15，分別收集米爾貝肟A3和米爾貝肟A4的洗脫峰，收集得到兩者的洗脫液。
[0033](3)、將洗脫液採用聚偏氟乙烯納濾膜進行濃縮10倍，製得濃縮液，透過液作為流動相重複使用，所述納濾膜的截留分子量為350?500Da ；
[0034](4)、將濃縮液均在45°C下減壓蒸發至不滴，G4砂芯過濾，45°C真空乾燥5h，將米爾貝]3虧A3和米爾貝月虧A4調配成A3/A4為1:4.1，得米爾貝月虧精純品17.8g ；
[0035](5)、將精純品先用72mL三氯甲烷溶解，然後將溶液置於500mL三角瓶中，升溫至60°C並磁力攪拌，攪拌速度為30?90rpm ;達到設定溫度後開始滴加正庚烷，滴加時間為10?30min ;待出現白色渾濁後將溫度調節為30°C，繼續攪拌6h後，G4砂芯過濾。將結晶品按上述方法重結晶2次，最後在40°C下乾燥5h，稱重得米爾貝肟結晶品12.9g
[0036](6)、將結晶品用先用65mL丙酮溶解，45°C旋幹，然後再加入65mL丙酮溶解，溶解後的溶液用0.45 μ m濾膜過濾，將濾液滴加到90mL劇烈攪拌且經過濾的純化水中，攪拌速度為30?90rpm,濾液的滴加時間為I?3h,滴加完成後繼續攪拌30min?2h ;最後採用G4砂芯漏鬥抽濾製得轉晶品。
[0037](7)、將轉晶品放入真空乾燥箱中進行乾燥，乾燥溫度為40°C，乾燥時間為12h，乾燥後進行粉碎，過100目?300目篩，粉碎後重新置於真空乾燥箱中進行乾燥，乾燥溫度65°C，乾燥時間6h，最後即製得米爾貝肟成品12.Hg，其液相色譜檢測譜圖如圖2所示，圖3為米爾貝肟的USP對照品液相色譜檢測所得的譜圖，成品中米爾貝肟A3含量為19.32%,米爾貝肟A4含量為79.41 %，米爾貝肟A4總收率為95.34%。
[0038]實施例2
[0039](I)、稱取3Kg米爾貝肟粗品，其中米爾貝肟A4標定含量為8.7%，米爾貝肟A3的標定含量為6.5%，將米爾貝肟粗品用3.1lKg丙酮溶解，再加入3Kg矽膠拌勻，置於真空乾燥箱中在40°C下真空乾燥6h ;再稱取6Kg柱層析矽膠，將矽膠用12L氯仿浸泡並攪拌均勻後倒入Φ22.8cmX 10cm玻璃層析柱內，拍打均勻，用40L正庚烷洗脫平衡；然後將乾燥後的混合物用7.5L正庚烷調勻，加載到柱上，上樣量為柱體積的5%?20% ;
[0040]採用正庚烷/丙酮的混合溶劑作為流動相進行洗脫，正庚烷/丙酮的體積比為97:3, HPLC監測米爾貝肟的洗脫情況，收集米爾貝肟A3和A4總純度大於40%的組分，35°C減壓蒸乾，得米爾貝肟粗純品1375.Sg。
[0041 ] (2)、高效液相色譜所用填料為C8矽膠，填料粒徑為3?10 μ m，比表面積為200?600m2/g。
[0042]將米爾貝肟粗純品用700mL三氯甲烷和700mL甲醇混合溶劑溶解，用進樣針吸取40mL注入進樣閥上樣，進樣量為每千克填料每次進5?15g樣品。
[0043]採用甲醇/乙腈/水的混合溶液作為流動相洗脫，三者的體積比為75:10:15，分別收集米爾貝肟A3和米爾貝肟A4的洗脫峰，收集得到兩者的洗脫液。
[0044](3)、將洗脫液採用聚偏氟乙烯納濾膜進行濃縮10倍，製得濃縮液，透過液作為流動相重複使用，所述納濾膜的截留分子量為350?500Da ；
[0045](4)、將濃縮液均在50°C下減壓蒸發至不滴，G4砂芯過濾，45°C真空乾燥5h，將米爾貝月虧A3和米爾貝月虧A4調配成A3/A4為1-A.1，得米爾貝月虧精純品487.6g ；
[0046](5)、將精純品先用2L三氯甲烷溶解，然後將溶液置於20L結晶釜中，升溫至60°C並磁力攪拌，攪拌速度為30?90rpm ;達到設定溫度後開始滴加4.5L正庚烷，滴加時間為10?30min ;待出現白色渾濁後將溫度調節為30°C，繼續攪拌6h後，G4砂芯過濾。將結晶品按上述方法重結晶2次，最後在40°C下乾燥5h，稱重得米爾貝肟結晶品343.5g
[0047](6)、將結晶品用先用1.75L丙酮溶解，45°C旋幹，然後再加入1.75L丙酮溶解，溶解後的溶液用0.45 μ m濾膜過濾，將濾液滴加到3.15L劇烈攪拌且經過濾的純化水中，攪拌速度為30?90rpm,濾液的滴加時間為Ih,滴加完成後繼續攪拌30min?2h ;最後採用G4砂芯漏鬥抽濾製得轉晶品。
[0048](7)、將轉晶品放入真空乾燥箱中進行乾燥，乾燥溫度為40°C，乾燥時間為12h，乾燥後進行粉碎，過100目?300目篩，粉碎後重新置於真空乾燥箱中進行乾燥，乾燥溫度65°C，乾燥時間6h，最後即製得米爾貝肟成品316.7g，成品中米爾貝肟A3含量為19.07%,米爾貝肟A4含量為79.33 %，米爾貝肟A4總收率為95.03 %。
【權利要求】
1.一種米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於包括以下步驟:(1)、將待分離樣品採用矽膠柱層析進行粗分離，所述矽膠柱層析採用溼法裝柱、幹法上樣，上樣量為柱體積的5%?20% ； (2)、將粗分離後的產物採用高效液相色譜純化； (3)、將純化後的樣品採用納濾膜進行濃縮，製得濃縮液，所述納濾膜的截留分子量為200 ?100Da ； (4)、將濃縮液減壓蒸發，然後過濾乾燥後製得精純品； (5)、將精純品採用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯溶解後升溫，再滴加異辛醇、正庚烷或石油醚，然後降溫使其結晶，過濾後製得結晶品； (6)、將結晶品用甲醇、乙醇或丙酮溶解後過濾，將濾液滴加至持續攪拌的純淨水中，滴加完成後抽濾製得轉晶品； (7)、將轉晶品進行乾燥，乾燥後進行粉碎，粉碎後重新乾燥即製得米爾貝肟成品。
2.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:步驟(I)中所述的溼法裝柱具體為:將矽膠用0.8?2.5倍體積的氯仿浸泡並攪拌均勻後倒入柱內，柱床的高徑比控制在(8?15):1，然後用正己烷、正庚烷、異辛烷或石油醚洗脫平衡，洗脫體積為I?4個柱體積。
3.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:步驟(I)中所述的幹法上樣具體為:將待分離樣品用丙酮溶解，再與矽膠拌勻，在35?45°C下真空乾燥4?10h，所述丙酮、矽膠與樣品質量比為(0.25?2): (0.7?1.5):1。
4.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:所述的矽膠柱層析中的流動相為溶劑A與溶劑B按照(90?99):1的體積比混合後的混合溶劑，其中溶劑A為正己烷、正庚烷、異辛烷及石油醚中的一種，溶劑B為甲醇、丙酮及乙酸乙酯中的一種。
5.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:步驟(2)中所述高效液相色譜所用填料為C8矽膠，填料粒徑為3?10 μ m，比表面積為200?600m2/g ;流動相為甲醇、乙腈和水的混合物，其比例為:(70?90): (5?10): (5?20)。
6.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:步驟(2)中所述高效液相色譜採用甲醇-三氯甲烷溶解上樣，甲醇與三氯甲烷體積比為(0.8?1.8):1，樣品濃度為0.80?1.5g/ml，進樣量為每千克填料每次進5?15g樣品。
7.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:步驟(3)中所述納濾膜為聚偏氟乙烯、聚醯胺、聚醚碸和殼聚糖中的一種。
8.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:步驟(5)的具體方法為:先用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯將精純品溶解，所用溶劑體積與精純品質量之比為(0.8?3):lml/g ;然後將溶液置於40?70°C攪拌，攪拌速度為30?90rpm ;達到設定溫度後開始滴加異辛醇、正庚烷、石油醚中的一種，滴加時間為10?30min ;待出現渾濁後將溫度調節為10?30°C，繼續攪拌3?8h後過濾。
9.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:步驟(6)的具體方法為:先用甲醇、乙醇或丙酮將結晶品溶解，所用溶劑體積與結晶品質量之比為(4?7):lml/g ;溶解後的溶液用0.45 μ m濾膜過濾，將濾液滴加到劇烈攪拌且經過濾的純化水中，攪拌速度為30?90rpm,濾液的滴加時間為I?3h,滴加完成後繼續攪拌30min?2h ;最後米用G4砂芯漏鬥抽濾製得轉晶品。
10.根據權利要求1所述的米爾貝肟的分離純化方法，其特徵在於:步驟(7)的具體方法為:將轉晶品放入真空乾燥箱中進行乾燥，乾燥溫度為30?40°C，乾燥時間為10?20h，乾燥後進行粉碎，過100目?300目篩，粉碎後重新置於真空乾燥箱中進行乾燥，乾燥溫度55?75°C，乾燥時間4?7h，最後即製得米爾貝肟成品。
【文檔編號】C07D493/22GK104327094SQ201410606012
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月30日 優先權日:2014年10月30日
【發明者】何福彪, 付光明, 張文凱 申請人:湖北宏中藥業有限公司