一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法
2023-04-27 02:55:56
一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法
【專利摘要】本發明涉及一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法，屬於生物製劑【技術領域】。該方法具體包括以下步驟：(1)製備免疫原準備：採用豬傳染性胃腸炎豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗，該疫苗含有兩種病毒蛋白；(2)採用免疫程序；(3)抗體效價測定；(4)純化卵黃抗體；(5)鑑定卵黃抗體。本發明採取水稀釋法，該法安全可靠沒有汙染，成本低，經過以上處理的高免蛋可以獲得活性高、純度高，產量高，性質穩定的卵黃抗體，操作方法簡單易行可靠，有利於工業化生產。
【專利說明】一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法，屬於生物製劑【技術領域】。
【背景技術】
[0002]豬傳染性胃腸炎(TGE)與豬流行性腹瀉(PED)是引起豬腹瀉的兩種傳染性腸道病毒病，均為冠狀病毒屬成員。由於這兩種疫病傳播快、引起的病死率高，在流行季節可呈暴發流行，給養豬業造成重大的經濟損失，是我國當前豬病防控中的重點疫病。目前，疫苗接種仍然是預防該病的主要措施，尚無有效的治療藥物，一旦發病，往往損失慘重，並且隨著國內一些抗生素逐漸被禁用及耐藥性的產生，抗生素替代品的研究日益受到重視。因此，開發高效特異性防治藥物已經成為臨床上的迫切需求。
[0003]卵黃抗體(IgY)是用抗原免疫蛋雞後產生的抗體由血液轉入卵黃中形成的，其化學性質穩定、產量高、成本低，有開發功能性食品和新藥的潛能。雞卵黃可富集從雞血清中轉移而來的大量特異多克隆抗體IgY，這些抗體與哺乳動物產生的抗體相比具有許多明顯的優點。卵黃抗體不會激發補體系統，不與抗哺乳動物抗原的抗體發生反應，不與哺乳動物和細菌的Fe受體結合，這在免疫診斷中具有重要意義。目前IgY的應用主要是疾病的診斷檢測和防治、食品添加劑及化妝品領域等。而且卵黃抗體作為一種高效的生物活性免疫球蛋白在獸醫領域具有取代抗生素、抗血清等治療手段的巨大潛力和優勢。國內外已有抗細菌及病毒IgY產品問世，應用廣泛的IgY有抗傳染性法氏囊病、抗小鵝瘟病、抗雞新城疫、抗鴨病毒性肝炎、抗番鴨細小病毒病、抗雞減蛋症候群等。卵黃抗體在豬病病原方面研究較少，且多針對豬細菌性腹瀉，如大腸桿菌的K88、K99、987P標準菌株和地方分離菌株製成多價菌體IgY、大腸桿菌的0157:H7、志賀菌、沙門氏菌等為免疫原製成的IgY等，病毒方面的研究有抗豬瘟病毒、輪狀病毒、圓環病毒等的卵黃抗體，關於豬腹瀉病毒的卵黃抗體鮮有報導，所以缺乏卵黃抗體為豬病 毒性腹瀉提供防制手段的理論研究。再有雞卵黃免疫球蛋白作為抗體家族的重要成員，是一種高產、優質的多克隆抗體，具有來源豐富、易於獲得、使用方便、成本低廉等特點。綜上所述，研究抗豬病毒性腹瀉卵黃抗體提取純化工藝，尋找一種簡便、高效、經濟的方法，有很大應用價值。
[0004]製備抗豬病毒性腹瀉卵黃抗體首先是要選取試驗動物，準備免疫原，按照一定的程序免疫蛋雞，刺激機體產生抗該病毒的抗體並轉移到卵黃中，並進行提取純化，以獲得高純度的卵黃抗體。
[0005]一般來說，用於生產卵黃抗體的雞最好選用近交系的蛋雞。根據生產IgY的不同目的選擇合適的雞群，如用於治療目的的IgY的生產應選用SPF雞，而用於預防目的的IgY的生產可以選用商用蛋雞。使用SPF雞的優點是可產生高滴度抗體，而使用商品蛋雞既價格低廉，又可在產蛋前用來製備抗體而不影響產蛋，因此可以減少製備卵黃抗體的成本。抗原注射途徑可選用皮下、皮內、肌肉、靜脈、腹股溝、法氏囊注射或通過口服等，也可將多種免疫方法綜合使用。通常使用油乳類佐劑如弗氏不完全佐劑可以產生明顯的抗體反應。在抗原劑量選擇上，應將不同濃度的抗原和佐劑結合後進行測試。通常免疫的雞至少7周齡，最好分兩個部位注射，劑量為0.15-lml。至少要免疫兩次。IgY分離主要是除去卵黃中高含量的脂肪及脂蛋白，以獲得水溶性組分(WSF)。卵黃中的主要成分是蛋白質和脂肪，其比例約為1:2。大部分蛋白質是脂蛋白，存在於卵黃顆粒中，不溶於水，只有卵黃球蛋白是水溶性的，IgY是一種Y-卵黃球蛋白。因此如何去除高濃度的脂類是IgY提純的關鍵。
[0006]目前已建立許多提純IgY的方法，綜合分為以下幾類:(1)沉澱法:沉澱法又分為有機物沉澱法和有機試劑沉澱法，有胺基酸鹽或硫酸鈉法、聚乙烯醇(PEG)法、辛酸法、聚乙二醇法、氯仿法、苯酚、丙酮法等。這些方法能初步純化蛋白質，產量約為ImL黃提取
5.0~7.5mg,純度(2)色譜層析法:有親和層析法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法和凝膠過濾柱層析法等。色譜層析法因其設備昂貴，操作過程繁瑣，處理樣少，只是作為實驗室純化法。
[0007]鹽析破壞蛋白質的水化層，使疏水基團暴露，蛋白質的可溶性隨著鹽濃度的增加呈對數下降，蛋白質很容易沉澱析出。採用鹽析技術提取和濃縮IgY是一個簡單溫和的方法。雖然分離率不高，但適用於大量生產，而且價值便宜，特別適用於純化流程的前期的最終的濃縮。在低離子強度的酸性條件下，辛酸可與絕大多數的卵黃蛋白反應，形成不可逆的沉澱，唯有IgY類抗體蛋白不發生反應，仍留在上清中，離心除去沉澱，將上清液經過超濾設備濃縮分離後，可以提高後續硫酸銨法分離率低的弊端，將上清的PH調整到7.0左右，用硫酸銨使IgY析出，可得到純度90%以上的IgY，該法經濟、簡便、快速，不損害抗體活性。
[0008]現有在使用的技術有氯仿法:蛋黃抗體為存在於蛋黃中的水溶性蛋白質，其總量僅為蛋黃固形物的10%，其餘大部分是顆粒狀的蛋黃高磷蛋白、脂蛋白、可溶性的低密度脂蛋白和少量色素，這些物質存在於蛋黃液中，使之甚為粘稠。氯仿法可以分離出水溶性成分和變性的脂類，通過離心或過濾去除變性脂類後，就可得到單純的水溶性成分，即提純的蛋黃抗體液。將高免雞蛋浸入0.2%強力消毒靈溶液中浸泡lOmin，取出讓其自然乾燥，在無菌室內分離蛋清與蛋黃，充分除去蛋清，收集蛋黃，再將蛋黃用攪拌機充分攪拌呈均勻膏狀。量取1OOmL蛋黃液，200mL生理鹽水和1OOmL氯仿，按生理鹽水:氯仿(三氯甲烷):蛋黃液=2:1:1的比例混合後充分搖勻，靜置約2-3h，讓蛋黃液和氯仿充分反應，再用離心機3000r / min，離心30min，收集上清液，並量取其容量，上清液中既包含目的抗體。氯仿可以破壞與蛋白結和的磷脂，從而將二者分離，分離後的卵黃蛋白就溶於水中。該法提取抗體的量比較低，造成一些抗體損耗；還會氯仿有機溶劑會損傷抗體活性，造成抗體效價的降低；大量提取抗體，使用的氯仿的量就更多，氯仿有毒對操作者和環境都帶來嚴重汙染，只是適合少量生產。
[0009]卵黃抗體是具有很大潛力的，其生產技術應適合大規模的生產，氯仿法不符合條件。另外常用的方法有聚乙二醇沉澱法，聚乙二醇溶於水中不會發熱、升溫，不會引起蛋白質變性，沉澱蛋白質的時間較短且不影響離心處理，並有促進蛋白質結晶的作用。將收集的高免蛋浸泡消毒，無菌分離蛋黃，經無菌攪碎機攪拌5min,按1:1加入無菌生理鹽水,用雙層無菌紗布過濾，加入青黴素、鏈黴素各1000單位、疊氮鈉至0.01 %濃度，置4°C冰箱備用。在高免卵黃液中加入4倍體積的PBS緩衝液，充分搖勻，再加入PEG6000，使其最終濃度達4%，攪拌1Omin後，4000r / min離心30min。無菌收集上清液再加入PEG6000，使其最終濃度為12%，攪拌lOmin，同上離心，棄上清液，所得產品即提取的IgY。該方法中，聚乙二醇易溶於水，在得到的目的上清液中目前尚沒有辦法去除，對畜禽的危害迄今也尚無確切定論。
【發明內容】
[0010]本發明的目的在於提供一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法，採用水稀釋辛酸法，結合超濾法和硫酸銨沉澱法獲取高純度和高效價的卵黃抗體。
[0011]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。
[0012]一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法，具體包括以下步驟:
[0013](I)製備免疫原準備:免疫原是提取的蛋白、細胞上清液、疫苗等，需要含有特點抗原，刺激機體產生特定抗體，本發明中採用的是豬傳染性胃腸炎豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗，該疫苗含有兩種病毒蛋白，能刺激機體產生相應抗體並轉移到卵黃中。
[0014](2)免疫程序:初次免疫劑量Im L，胸部皮下多點注射；分別間隔兩周進行第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫，免疫劑量分別為lml、1.5ml、lml，4免後28天加強免疫，注射劑量為lml。
[0015](3)測定抗體效價--第1次免疫I周后每周收集高免蛋和採集血清，並利用豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒抗體檢測試劑盒檢測高免卵黃抗體和血清效價，待血清抗體效價達到2000，卵黃抗體濃度達到約4.5mg / ml時收集高免蛋。
[0016](4)純化卵黃抗體:將雞蛋浸入0.1 %新潔爾滅水溶液中消毒15min,自然晾乾,無菌條件下分離並收集卵黃；向其中加9倍體積4°C雙蒸水，緩慢加入I %辛酸，充分攪拌均勻，鹽酸調整pH值至5.3，4°C靜置IOh後低溫12000r / min離心25min，收集上清液，即為水溶性組分(WSF) ；WSF進行0.22 μ m濾膜微濾，除去細菌和雜質顆粒，然後進行超濾；超濾時調節WSF的溫度為25°C，pH6.5，操作壓力為0.05MPa，`留分子量為50KD膜包，濃縮倍數根據需要進行選擇；對獲得的濃縮液用氨水調PH至7.0,緩慢加入等體積飽和硫酸銨溶液使其濃度達到50%;4°C靜置2h離心25min，取沉澱；再加入適量pH為7.4PBS溶解，加入飽和硫酸銨使其最終濃度為33%，靜置2h，同上步離心，取沉澱並用適量PBS溶解，即為提取的卵黃抗體；
[0017](5)鑑定卵黃抗體:卵黃抗體的濃度採用紫外可見分光光度計和考馬斯亮藍法進行測定；卵黃抗體的純度採用十二烷基磺酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PEGE)進行確定；卵黃抗體效價和特異性用豬病毒性腹?寫抗體檢測試劑盒和western bolting進行確定；卵黃抗體的無菌檢測採用細菌培養法；並對卵黃抗體進行安全性檢查、人工感染治療效果鑑定。
[0018]本發明中，卵黃抗體本身是水溶性的，不會對環境和人體造成危害，無毒無害、成本低；單純加水溶解卵黃，不能分離與磷脂等結合的抗體，而辛酸的加入可以彌補這一缺點，充分暴露出卵黃抗體，以獲得高含量的水溶性組分。超濾可以進行蛋白質的濃縮分離，除鹽去醇。卵黃採用9倍蒸餾水進行稀釋後，體積較多，後續操作繁瑣，引入超濾技術，對獲得的WSF進行超濾，不僅可以濃縮WSF，還可以依據超濾膜的截留分子量將非目的蛋白給排除掉，分離出目標抗體，並為下一步的再純化打下基礎。超濾法成本低，易放大，簡化操作過程，並可以提高提純效率。超濾後的目的溶液已經經過了純化一次，為了得到更高純度的卵黃抗體，進行下一步的沉澱法。硫酸銨沉澱法是一種經典的蛋白分離純化方法，該法依據目標蛋白的化學性質，在低離子強度、酸性條件下，辛酸可與絕大多數的卵黃蛋白反應，形成不可逆的沉澱，唯有IgY類抗體蛋白不發生反應，仍留在上清中，離心除去沉澱，將上清的pH調整到7.0左右，用硫酸銨使IgY析出，可得到純度90%以上的IgY，該法經濟、簡便、快速，不損害抗體活性，回收率高。
[0019]該發明的有益效果在於:本發明採取水稀釋法，該法安全可靠沒有汙染，成本低，辛酸的加入可以增加卵黃抗體的溶解量，提高抗體提取效率。辛酸也可以在獲得WSF時的離心和之後的超濾過程、硫酸銨沉澱中除去不存在殘留問題。超濾技術現已逐漸替代空間排阻色譜，成為蛋白質脫鹽、脫醇和濃縮富集的首選方法，超濾分離技術因具有低成本、易放大、處理量大的特點，適合規模化生產。硫酸銨沉澱法所用試劑少，成本低，安全，沉澱後產物濃度高，有利於商品化卵黃抗體進行的處理。經過以上處理的高免蛋可以獲得活性高、純度高，產量高，性質穩定的卵黃抗體，操作方法簡單易行可靠，有利於工業化生產。綜上所述，該法不僅不需要有毒試劑，安全可靠，成本低，操作簡單易行，處理量大，適合大規模生產，並且獲得的卵黃抗體損傷量小，活性高，純度高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是本發明實施例中純化卵黃抗體的簡易流程圖。
[0021]圖2是本發明實施例中提取的IgY的SDS-PAGE結果圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖和實施例對本發明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發明。
[0023]實施例
[0024]一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法，具體包括以下步驟:
[0025](I)製備免疫原準備:免疫原是提取的蛋白、細胞上清液、疫苗等，需要含有特點抗原，刺激機體產生特定抗體，本發明中採用的是豬傳染性胃腸炎豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗，該疫苗含有兩種病毒蛋白，能刺激機體產生相應抗體並轉移到卵黃中。
[0026](2)免疫程序:初次免疫劑量Im L，胸部皮下多點注射；分別間隔兩周進行第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫，免疫劑量分別為lml、1.5ml、lml，4免後28天加強免疫，注射劑量為lml。對照組注射滅菌生理鹽水。
[0027](3)抗體效價測定--第1次免疫I周后每周收集高免蛋和採集血清，並利用豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒抗體檢測試劑盒檢測高免卵黃抗體和血清效價，待血清抗體效價達到2000，卵黃抗體濃度達到約4.5mg / ml時收集高免蛋。
[0028](4)純化卵黃抗體:具體流程如圖1所示，將雞蛋浸入0.1 %新潔爾滅水溶液中消毒15min，自然晾乾，無菌條件下分離並收集卵黃。向其中加9倍體積4°C雙蒸水，一定要緩慢加入1%辛酸，充分攪拌均勻，鹽酸調整pH值至5.3，4°C靜置IOh後低溫12000r / min離心25min，收集上清液，即為水溶性組分(WSF)。WSF進行0.22 μ m濾膜微濾，除去細菌和雜質顆粒，然後進行超濾。超濾時調節WSF的溫度為25°C，pH6.5，操作壓力為0.05MPa,(根據使用的超濾設備的不同，操作壓力是不一樣的)截留分子量為50KD膜包，濃縮倍數根據需要進行選擇。本發明中，超濾時間和超濾效果的關係，確定WSF濃縮8倍。對獲得的濃縮液用氨水調PH至7.0,緩慢加入等體積飽和硫酸銨溶液使其濃度達到50%。4°C靜置2h離心25min，取沉澱。再加入適量pH為7.4PBS溶解，加入飽和硫酸銨使其最終濃度為33%，靜置2h，同上步離心，取沉澱並用適量PBS溶解，即為提取的卵黃抗體。
[0029](5)鑑定卵黃抗體:
[0030]卵黃抗體的濃度採用紫外可見分光光度計和考馬斯亮藍法進行測定，結果IgY最高濃度可達到9.5mg / ml。
[0031]卵黃抗體的純度採用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PEGE)進行確定，本發明實施例中提取的IgY的SDS-PAGE結果見圖2，IgY純度達到95%。
[0032]卵黃抗體效價和特異性用豬病毒性腹灣抗體檢測試劑盒和western bolting進行確定，結果IgY效價較高，測定的OD45tl,可達到2.900,高效價IgY可保持5周以上,westernbolting結果顯示有目的條帶。
[0033]卵黃抗體的無菌檢測採用細菌培養法，取卵黃抗體溶液分別接種於普通營養瓊脂和厭氧肉湯培養基上，於37°C培養24h，結果無細菌生長。
[0034]卵黃抗體的安全性檢查，取健康小鼠10隻，隨機分為2組，一組為試驗組，灌服純化的卵黃抗體Iml另一組為對照組，灌服生理鹽水1ml，連續觀察7d，觀察小鼠狀況。結果試驗組和對照組 小鼠7d內均未呈現異常症狀，無死亡，說明所製備的卵黃抗體安全性較好。
[0035]卵黃抗體人工感染治療效果鑑定，將24頭剛出生未吃初乳的仔豬隨機分成3組，每組8頭，第I組為卵黃抗體治療組;第2組為抗生素治療對照組；第3組為空白對照組。各組仔豬以傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒混合液口服攻毒，每次2ml，一天2次。進行人工攻毒，結果攻毒24後，所有仔豬均出現腹瀉症狀，卵黃抗體治療組口服卵黃抗體後腹瀉症狀逐漸減輕，大部分仔豬在4~5d後不再腹瀉，個別仔豬在7d後恢復正常；抗生素治療組出現腹瀉和死亡，死亡主要出現在攻毒後2~3d，痊癒I頭，死亡7頭死亡，死亡率87.5% ;未採取治療措施的空白對照組則全部死亡。
[0036]以上所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種治療豬病毒性腹瀉生物製劑的製備和應用方法，其特徵在於:具體包括以下步驟: (1)製備免疫原準備:採用豬傳染性胃腸炎豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗，該疫苗含有兩種病毒蛋白； (2)免疫程序:初次免疫劑量ImL，胸部皮下多點注射；分別間隔兩周進行第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫，免疫劑量分別為1ml、1.5ml、lml，4免後28天加強免疫，注射劑量為Iml ； (3)測定抗體效價--第1次免疫I周后每周收集高免蛋和採集血清，並利用豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒抗體檢測試劑盒檢測高免卵黃抗體和血清效價，待血清抗體效價達到2000，卵黃抗體濃度達到4.5mg / ml時收集高免蛋； (4)純化卵黃抗體:將雞蛋浸入0.1 %新潔爾滅水溶液中消毒15min，自然晾乾,無菌條件下分離並收集卵黃；向其中加9倍體積4°C雙蒸水，緩慢加入I %辛酸，充分攪拌均勻，鹽酸調整pH值至5.3，4°C靜置IOh後低溫12000r / min離心25min，收集上清液，即為水溶性組分(WSF) ;WSF進行0.22 μ m濾膜微濾，除去細菌和雜質顆粒，然後進行超濾；超濾時調節WSF的溫度為25°C，pH6.5，操作壓力為0.05MPa，截留分子量為50KD膜包，濃縮倍數根據需要進行選擇；對獲得的濃縮液用氨水調PH至7.0，緩慢加入等體積飽和硫酸銨溶液使其濃度達到50% ;4°C靜置2h離心25min，取沉澱；再加入適量pH為7.4PBS溶解，加入飽和硫酸銨使其最終濃度為33%，靜置2h，同上步離心，取沉澱並用適量PBS溶解，即為提取的卵黃抗體； (5)鑑定卵黃抗體:卵黃抗體的濃度採用紫外可見分光光度計和考馬斯亮藍法進行測定；卵黃抗體的純度採用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PEGE)進行確定；卵黃抗體效價和特異性用豬病毒性腹?寫抗體檢測試劑盒和western bolting進行確定；卵黃抗體的無菌檢測採用細菌培 養法；並對卵黃抗體進行安全性檢查、人工感染治療效果鑑定。
【文檔編號】A61P31/14GK103694348SQ201310660244
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】劉聚祥, 曹立輝, 高嶺 申請人:劉聚祥