結核分枝桿菌基因分型檢測引物組及其試劑盒的製作方法

2023-04-27 05:15:01

結核分枝桿菌基因分型檢測引物組及其試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及基因分型領域，尤其涉及結核分枝桿菌基因分型檢測引物組及其試劑盒。本發明提供的引物組包括用於檢測結核桿菌基因組中22個VNTR位點的22個引物對；通過採用本發明提供的引物組對22個結核分枝桿菌的VNTR位點多樣性進行檢測可達到對結核分枝桿菌分型的目的。實驗結果表明，以本發明提供的引物組進行結核分枝桿菌分型的檢測，分辨能力高，特異性強，各位點皆顯示出了良好的多態性，分型指數可達0.903。
【專利說明】結核分枝桿菌基因分型檢測引物組及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因分型領域，尤其涉及結核分枝桿菌基因分型檢測引物組及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]結核病(TB)由結核分枝桿菌感染引起，目前仍是危害人類健康的重要傳染病之一。結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis),俗稱結核桿菌或結核菌,其易發生形態、菌落、毒力、免疫原性和耐藥性等變異。並且，由於結核病具有潛伏感染的特點，傳統的流行病學方法並不能很好的揭示其傳播規律。目前，研究結核病分子流行病學主要方法是基因分型技術，通過基因分型技術可以對病原菌進行追蹤，區分結核病是外源感染還是舊病復發，對實驗室的交叉感染進行鑑別，利用基因分型技術還可以對結核病的暴發流行進行預測。
[0003]目前常用的結核桿菌基因分型方法主要有IS6110-RFLP法、MLVA法和spoligotyping法。上述方法中,MLVA方法具有特異、敏感、簡便、快速、分辨力強、分型效率高和重複性好等特點在目前的結核病分型檢測中廣泛的使用。MLVA法，即多位點可變數目串聯重複序列方法(Multiple Loci VNTR analysis)是基於結核桿菌可變串聯重複序列和分枝桿菌散在重複單位的一種方法，MLVA以普通PCR擴增為基礎，通過電泳檢測確定不同結核分枝桿菌基因組中不同位點串聯重複序列(variable-number tandem-repeat, VNTR)數目，並根據VNTR數目的不同對結核分枝桿菌進行分型。其結果通過數字表示，結果可靠有效，適合於所有結核菌分離株。該方法不僅省時省力，所需菌量少，分辨能力強，還有利於在不同實驗室之間進行數據比較。為獲得更高的解析度，更多VNTR位點被選擇用於結核桿菌的基因分型，多位點的聯合使用有助於提高不同結核桿菌譜系的解析度。
[0004]但是，目前對結核分枝桿菌的MLVA檢測中採用的位點和引物組仍然存在著穩定性和重複性不佳的問題，分型指數也不高。並且，由於結核桿菌的流行具有地域性特點，不同的VNTR位點及引物組合在研究不同地域或不同來源菌株時表現分辨能力存在差異。因此，通過實驗篩選穩定性和重複性以及分型指數良好，並且適合多地區結核桿菌分型的VNTR位點對地域性流行病學研究十分關鍵。

【發明內容】

[0005]有鑑於此，本發明所要解決的技術問題在於提供結核分枝桿菌基因分型檢測引物組及其試劑盒。本發明提供的引物組在對多地區的結核分枝桿菌分型中表現出良好的穩定性和重複性，且表現出極高的分型指數。
[0006]本發明提供了結核分枝桿菌基因分型檢測引物組，包括用於檢測結核桿菌基因組中22個VNTR位點的22個引物對；其中，`
[0007]用於檢測位點QUB-1lb的上遊引物序列如SEQ ID NO:1所示；
[0008]用於檢測位點QUB-1lb的下遊引物序列如SEQ ID NO:2所示；[0009]用於檢測位點MIRU4的上遊引物序列如SEQ ID NO:3所示；
[0010]用於檢測位點MIRU4的下遊引物序列如SEQ ID N0:4所示；
[0011]用於檢測位點MIRU26的上遊引物序列如SEQ ID NO:5所示；
[0012]用於檢測位點MIRU26的下遊引物序列如SEQ ID N0:6所示；
[0013]用於檢測位點MIRU40的上遊引物序列如SEQ ID NO:7所示；
[0014]用於檢測位點MIRU40的下遊引物序列如SEQ ID N0:8所示；
[0015]用於檢測位點MIRUlO的上遊引物序列如SEQ ID NO:9所示；
[0016]用於檢測位點MIRUlO的下遊引物序列如SEQ ID NO: 10所示；
[0017]用於檢測位點MIRU31的上遊引物序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0018]用於檢測位點MIRU31的下遊引物序列如SEQ ID NO: 12所示；
[0019]用於檢測位點Mtub04的上遊引物序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0020]用於檢測位點Mtub04的下遊引物序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0021]用於檢測位點ETR C的上遊引物序列如SEQ ID NO: 15所示；
[0022]用於檢測位點ETR C的下遊引物序列如SEQ ID NO: 16所示；
[0023]用於檢測位點ETR A的上遊`引物序列如SEQ ID NO: 17所示；
[0024]用於檢測位點ETR A的下遊引物序列如SEQ ID NO: 18所示；
[0025]用於檢測位點Mtub30的上遊引物序列如SEQ ID NO: 19所示；
[0026]用於檢測位點Mtub30的下遊引物序列如SEQ ID NO:20所示；
[0027]用於檢測位點Mtub39的上遊引物序列如SEQ ID NO:21所示；
[0028]用於檢測位點Mtub39的下遊引物序列如SEQ ID NO:22所示；
[0029]用於檢測位點Mtub21的上遊引物序列如SEQ ID NO:23所示；
[0030]用於檢測位點Mtub21的下遊引物序列如SEQ ID NO: 24所示；
[0031]用於檢測位點QUB-26的上遊引物序列如SEQ ID NO:25所示；
[0032]用於檢測位點QUB-26的下遊引物序列如SEQ ID NO:26所示；
[0033]用於檢測位點MIRU23的上遊引物序列如SEQ ID NO:27所示；
[0034]用於檢測位點MIRU23的下遊引物序列如SEQ ID NO:28所示；
[0035]用於檢測位點MIRU24的上遊引物序列如SEQ ID NO:29所示；
[0036]用於檢測位點MIRU24的下遊引物序列如SEQ ID NO:30所示；
[0037]用於檢測位點Mtub34的上遊引物序列如SEQ ID NO:31所示；
[0038]用於檢測位點Mtub34的下遊引物序列如SEQ ID NO:32所示；
[0039]用於檢測位點QUB-1895的上遊引物序列如SEQ ID NO:33所示；
[0040]用於檢測位點QUB-1895的下遊引物序列如SEQ ID NO: 34所示；
[0041]用於檢測位點QUB-3336的上遊引物序列如SEQ ID NO:35所示；
[0042]用於檢測位點QUB-3336的下遊引物序列如SEQ ID NO:36所示；
[0043]用於檢測位點MIRU2的上遊引物序列如SEQ ID NO:37所示；
[0044]用於檢測位點MIRU2的下遊引物序列如SEQ ID NO:38所示；
[0045]用於檢測位點MIRU16的上遊引物序列如SEQ ID NO:39所示；
[0046]用於檢測位點MIRU16的下遊引物序列如SEQ ID NO:40所示；
[0047]用於檢測位點MIRU20的上遊引物序列如SEQ ID NO:41所示；[0048]用於檢測位點MIRU20的下遊引物序列如SEQ ID NO:42所示；
[0049]用於檢測位點MIRU27的上遊引物序列如SEQ ID NO:43所示；
[0050]用於檢測位點MIRU27的下遊引物序列如SEQ ID NO:44所示。
[0051]本發明提供的引物組在檢測吉林地區結核分枝桿菌基因分型中的應用。
[0052]本發明通過篩選，得到結核分枝桿菌中22個適於檢測基因分型的VNTR點，並提供了相應的引物。通過釆用本發明提供的引物組對這22個VNTR點多樣性進行檢測可達到對結核分枝桿菌分型的目的。其中，各VNTR位的名稱、對應序列序號和每一拷貝的長度如表I所示:
[0053]表1各VNTR位點的名稱、對應序列序號和每一拷貝的長度
[0054]
【權利要求】
1.結核分枝桿菌基因分型檢測引物組，其特徵在於，包括用於檢測結核桿菌基因組中22個VNTR位點的22個引物對；其中， 用於檢測位點QUB-1lb的上遊引物序列如SEQ ID NO:1所示； 用於檢測位點QUB-1lb的下遊引物序列如SEQ ID NO:2所示； 用於檢測位點MIRU4的上遊引物序列如SEQ ID NO:3所示； 用於檢測位點MIRU4的下遊引物序列如SEQ ID N0:4所示； 用於檢測位點MIRU26的上遊引物序列如SEQ ID NO:5所示； 用於檢測位點MIRU26的下遊引物序列如SEQ ID N0:6所示； 用於檢測位點MIRU40的上遊引物序列如SEQ ID NO:7所示； 用於檢測位點MIRU40的下遊引物序列如SEQ ID N0:8所示； 用於檢測位點MIRUlO的上遊引物序列如SEQ ID NO:9所示； 用於檢測位點MIRUlO的下遊引物序列如SEQ ID NO: 10所示； 用於檢測位點MIRU31的上遊引物序列如SEQ ID NO: 11所示； 用於檢測位點MIRU31的下遊引物序列如SEQ ID NO: 12所示； 用於檢測位點Mtub04的上遊引物序列如SEQ ID NO: 13所示； 用於檢測位點Mtub04的下遊引物序列如SEQ ID NO: 14所示； 用於檢測位點ETR C的上遊引物序列如SEQ ID NO: 15所示； 用於檢測位點ETR C的下遊引物序列如SEQ ID NO: 16所示； 用於檢測位點ETR A的上遊引物序列如SEQ ID NO: 17所示； 用於檢測位點ETR A的下遊引物序列如SEQ ID NO: 18所示； 用於檢測位點Mtub30的上遊引物序列如SEQ ID NO: 19所示； 用於檢測位點Mtub30的下遊引物序列如SEQ ID NO:20所示； 用於檢測位點Mtub21的上遊引物序列如SEQ ID NO:21所示； 用於檢測位點Mtub21的下遊引物序列如SEQ ID NO:22所示； 用於檢測位點QUB-26的上遊引物序列如SEQ ID NO:23所示； 用於檢測位點QUB-26的下遊引物序列如SEQ ID NO: 24所示； 用於檢測位點MIRU23的上遊引物序列如SEQ ID NO:25所示； 用於檢測位點MIRU23的下遊引物序列如SEQ ID NO:26所示； 用於檢測位點MIRU39的上遊引物序列如SEQ ID NO:27所示； 用於檢測位點MIRU39的下遊引物序列如SEQ ID NO:28所示； 用於檢測位點MIRU24的上遊引物序列如SEQ ID NO:29所示； 用於檢測位點MIRU24的下遊引物序列如SEQ ID NO:30所示； 用於檢測位點Mtub34的上遊引物序列如SEQ ID NO:31所示； 用於檢測位點Mtub34的下遊引物序列如SEQ ID NO:32所示； 用於檢測位點QUB-1895的上遊引物序列如SEQ ID NO:33所示； 用於檢測位點QUB-1895的下遊引物序列如SEQ ID NO:34所示； 用於檢測位點QUB-3336的上遊引物序列如SEQ ID NO:35所示； 用於檢測位點QUB-3336的下遊引物序列如SEQ ID NO:36所示； 用於檢測位點MIRU2的上遊引物序列如SEQ ID NO:37所示；用於檢測位點MIRU2的下遊引物序列如SEQ ID NO:38所示； 用於檢測位點MIRU16的上遊引物序列如SEQ ID NO:39所示； 用於檢測位點MIRU16的下遊引物序列如SEQ ID NO:40所示； 用於檢測位點MIRU20的上遊引物序列如SEQ ID NO:41所示； 用於檢測位點MIRU20的下遊引物序列如SEQ ID NO:42所示； 用於檢測位點MIRU27的上遊引物序列如SEQ ID NO:43所示； 用於檢測位點MIRU27的下遊引物序列如SEQ ID N0:44所示。
2.如權利要求1所述的引物組在檢測吉林地區結核分枝桿菌基因分型中的應用。
3.一種用於檢測結核分枝桿菌基因分型的試劑盒，其特徵在於，包括如權利要求1所述的引物組。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，還包括Taq酶、PCR緩衝液和DNA分子量標準。
5.一種檢測結核分枝桿菌基因分型的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟1:提取結核分枝桿菌基因組DNA ； 步驟2:以所述結核分枝桿菌基因組DNA為模板，分別以權利要求1所述的22個引物對為引物，經PCR反應獲得結核桿菌基因組中所述22個VNTR位點的PCR產物； 步驟3:取所述22個VNTR位點的PCR產物，分別以毛細管電泳檢測產物長度； 步驟4:根據所述產物長度換算VNTR位點的拷貝數，各VNTR位點的拷貝數一致的判斷為相同的基因分型； 其中，所述VNTR位點的拷貝數=PCR產物大小/VNTR位點每個拷貝的長度。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，對位點MIRU4、MIRU10、MIRU31、MIRU39、MIRU26、MIRU2、MIRU24、MIRU16、MIRU40、MIRU20、MIRU23 和 MIRU27 的所述 PCR 反應條件為:
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，對位點ETRA、QUB-18、ETR B、ETR C、QUB-1la和QUB-26的所述PCR反應條件為:

8.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，對位點QUB-3232、QUB-3336、QUB-1895、QUB-4156和QUB-2163的所述PCR反應條件為:
9.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，對位點Mtub34、Mtub29、Mtub39、Mtub30、Mtub21和Mtub4的所述PCR反應條件為:
10.根據權利要求5~9任一項所述的方法，其特徵在於，所述毛細管電泳的條件為:加樣體積5 μ L，電壓100V~240V，頻率為50/60Ηζ ；電泳溫度10°C~30°C;電泳溼度:10%~75% ;電泳時間450s，進樣時間10s。
【文檔編號】C12R1/32GK103834743SQ201410114597
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】孟慶峰, 王偉利, 楊莉, 李海濱 申請人:中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局